JA 能誘發 Hep 3B 細胞自噬現象

第四章結果

第一節 JA 能誘發 Hep 3B 細胞自噬現象

在細胞自噬產生的過程中，溶酶體與自噬小體結合後形成一酸性囊狀胞器（AVOs），使用 AO 染劑在酸性環境下會發出紅光的特性，

來判別加入藥物後細胞自噬的情形。自噬小體上的 LC3-I 蛋白與 PE 結合後形成 LC3-II，並存留在自噬小體上直到與溶酶體結合才被降解，

因此其蛋白表現量的多寡能當作細胞自噬的指標，p62 則會與 LC3 蛋白結合並在細胞自噬流程後期與溶酶體結合後也一起被降解，因此被當作細胞自噬流程有走完的指標。

為確認 JA 是否能誘發 Hep 3B 細胞產生細胞自噬，實驗將 Hep 3B 細胞處理 0~4 M 的 JA，作用 24、48 及 72 小時後將細胞收下，利用流式細胞儀分析 AO 染劑所染到的 AVOs 的比例。結果如（Fig. 1）

所示， Hep 3B 細胞經劑量 0.5~4M 的 JA 處理，產生細胞自噬的比例與時間劑量呈正相關。從時間點來看，作用時間 24 小時、JA 4 M 的濃度下，自噬比例明顯較 0 M 濃度高（p < 0.05），作用時間 48 小時，JA 在 0.5 M 濃度下的自噬比例即較 0 M 高（p < 0.05），濃度在 0.5~4 M 之間，自噬比例有隨濃度增加而上升，至 72 小時的自噬比例同樣在 0.5 M 濃度下的自噬比例較 0 M 高（p < 0.05），濃度在 0.5~4 M 之間，自噬比例隨濃度增加而上升。而在相同 JA 劑量下，

時間點 48 小時自噬的比例較 24 小時明顯增加並有顯著差異（P <

0.05），而至 72 小時細胞自噬的比例與時間點 48 小時相比則有增加 的趨勢（P > 0.05）。為確認 JA 誘發細胞自噬情形，由不同時間劑量 的自噬比例選出固定劑量 1 M，收取 whole cell lysates，利用西方墨點法檢測 LC3-II 與 p62 在 0 小時、24 小時、48 小時、72 小時、96 小時蛋白表現量，結果如（Fig. 2）所示，LC3-II 蛋白表現量在 1 M 的劑量下，隨作用時間增長而增加，24 小時的表現量與 0 小時相比 即有顯著較多（P < 0.05），到 72 小時後其表現量與 0 及 24 小時相比 明顯增加具有顯著差異（P < 0.05），p62 蛋白則是在 24 小時後增加表現，但隨時間增加到 96 小時，p62 的表現量有遞減的情形，24 小時 的表現量與 96 小時相比有顯著差異（P < 0.05），LAMP2a 蛋白在 24 小時後增加表現（P < 0.05），到 96 小時與 72 小時相比有下降的趨勢。

而未加 JA 的控制組培養至 96 小時的 LC3-II、p62 及 LAMP2a 蛋白表現量則無明顯變化，顯示 LC3-II、p62 及 LAMP2a 蛋白非細胞因壓力或養份不足而影響表現(White, Karp, Strohecker, Guo, & Mathew, 2010)，顯示 JA 能誘發 Hep 3B 細胞產生自噬，並且隨作用時間增加，

LC3-II 表現量越多，p62 則越少。

為確認細胞自噬流程是否有走完，實驗利用了細胞自噬抑制劑 Bafilomycin A1（BAF）抑制自噬小體與溶酶體結合，使用西方墨點

法檢測細胞自噬相關蛋白質：LC3、p62、LAMP2a 的表現量，及利用免疫螢光染色法使用共軛焦顯微鏡觀察 LAMP2a 與 LC3 結合的情形。實驗結果（Fig. 3）發現，未加 BAF 前處理單獨以 JA 處理的組別中，LC3-II 在 JA 1、2 M 濃度下與 JA 0 M 比較有明顯增加（p <

0.05），但 JA 1 與 2 M 濃度的 LC3-II 表現相比無明顯差異（p > 0.05）;

有加 BAF 前處理的組別中，LC3-II 在 JA 1、2 M 濃度下與 JA 0 M 比較有明顯增加（p < 0.05），但 JA 1 與 2 M 濃度的 LC3-II 表現無明 顯差異（p > 0.05）；相同濃度下的 JA 比較則發現，在 JA 1 M 的濃 度下，有加入 BAF 前處理的組別 LC3-II 在定量數值來看有較未加入 BAF 前處理有較高的趨勢（p > 0.05），在 JA 2 M 的濃度下，有加入 BAF 前處理的組別 LC3-II 表現量較未加入 BAF 前處理高（p < 0.05）。

實驗結果（Fig. 4）發現，未加 BAF 前處理單獨以 JA 處理的組別中，

p62 在 JA 1 M 濃度下的表現量與 0 M 相比有明顯增加，但在 JA 2

M 的濃度下與 0 及 1 M 相比無明顯差異（p > 0.05）; 有加 BAF 前

處理的組別中，p62 在 JA 2 M 濃度下的表現量與 0 M 相比有明顯增加，但在 JA 1 M 的濃度下與 0 及 2 M 相比無明顯差異（p > 0.05）；相同濃度下的 JA 比較則發現在 JA 1 M 的濃度下，有加入 BAF 前處理的組別，p62 在定量數值來看與未加入 BAF 前處理相比有較多的 趨勢（p > 0.05），在 JA 2 M 的濃度下，有加入 BAF 前處理的組別

p62 表現量較未加入 BAF 前處理多（p < 0.05）。而溶酶體上的 LAMP2a 蛋白表現量，由（Fig. 5）觀察發現，在未加 BAF 前處理單獨以 JA 處理的組別中在濃度 0、1、2 M 之間表現量有明顯隨劑量增加而上 升（p < 0.05），在加入 BAF 前處理的組別中也有相同的表現情形（p

> 0.05）；在相同濃度下的 JA 比較則發現加入 BAF 前處理的組別其 LAMP2a 的表現量顯著多於未加 BAF 前處理的組別。由實驗結果（Fig.

3、4、5）發現，在有 JA 處理的組別有使用 BAF 前處理，LC3-II、

p62 與 LAMP2a 表現量較多，顯示自噬小體與溶酶體結合較少，因此這些蛋白質未被分解而有較多的蛋白量累積。免疫螢光染色的結果顯示（Fig. 6），在未加入抑制劑與 JA 的組別幾乎沒有明顯的 LC3 聚集點（puncta）出現，而有 JA 處理的組別中，則有明顯的表現；且部分 LC3 因與 LAMP2a 結合而會有黃色亮點出現，表示自噬小體與溶酶體有結合的現象，代表細胞自噬的流程有完成至自噬溶酶體階段。

從（Fig. 6）可看到在 JA 處理的組別中，使用 BAF 前處理的組別，

其黃色亮點的顆數較單獨使用 JA 處理的組別少（p＜0.05）。以上結 果可確認，JA 不僅能誘發 Hep 3B 細胞產生細胞自噬現象，也能完成細胞自噬的流程。

Fig. 1 Effect of JA on autophagy of HCC Hep 3B cells.

Hep 3B cells (1 × 10⁵ cells/well) were exposed to 4 concentrations (0.5 to 4 M) of JA for 24, 48 and 72 h. After treatment, cells were stained with AO (1.5 g/ml) for 15 min before flow cytometry. The percentages in the figure indicate the proportion of cells with AVOs staining (upper two guadrants). Data are presented as mean ± SEMs. Means without a common letter differ, p＜0.05. Results are representative of three independent experiments.

Fig. 2 JA significantly induced LC3-II and LAMP2a expression, and the decrease of p62 at 96 h compared to 24 h suggested the process of autophagy flux.

Hep 3B cells (1 × 10⁶cells/dish) were treated with or without 1 M JA for 0, 24, 48, 72 and 96 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-LC3, anti-p62 and anti-LAMP2a

antibodies. -actin antibody was used as an internal control.

Quantification of LC3-II, p62 and LAMP2a protein expressions from

three independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.

Fig. 3 BAF increased JA-induced LC3-II expression in Hep 3B cells.

Hep 3B cells (1 × 10⁶ cells/dish) were pretreated with or without 25 nM Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-LC3 antibody. -actin antibody was used as an internal control. Quantification of LC3-II protein expressions from three independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.

Fig. 4 BAF increased JA-induced p62 expression in Hep 3B cells.

Hep 3B cells (1 × 10⁶ cells/dish) were pretreated with or without 25 nM BAF for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h.

Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-p62 antibody. -actin antibody was used as an internal control.

Quantification of p62 protein expressions from three independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.

Fig. 5 BAF increased JA-induced LAMP2a expression in Hep 3B cells.

Hep 3B cells (1 × 10⁶ cells/dish) were pretreated with or without 25 nM BAF for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h.

Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-LAMP2a antibody. -actin antibody was used as an internal control. Quantification of LAMP2a protein expressions from three

independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.

Fig. 6 BAF dcreased JA-induced colocalization of autophagosomal

and lysosomal markers.

Hep 3B cells (1 × 10⁵cells/ well) were pretreated with or without 25 nM Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 2 M JA for 48 h. After fixation the cells were subjected to immunocytochemistry using anti-LC3 mouse monoclonal and anti-LAMP2a rabbit monoclonal antibodies, and subsequently anti-mouse antibody conjugated to Alexa 568 and anti-rabbit antibody conjugated to Alexa 488, respectively.

Nuclei were visuliazed by incubating the cells with Hoechst 33258. Cells were observed with confocal microscopy. ※, significant differ from the group treated with JA only with or without BAF. Results are

representative of three independent experiments.

第二節抑制細胞自噬能促進 JA 毒殺 Hep 3B 細胞及細胞凋亡，而

在文檔中傳統中草藥爵床純化物爵床素A對肝癌細胞產生細胞自噬的效果 (頁 54-66)

第四章 結果