傳統中草藥爵床純化物爵床素A對肝癌細胞產生細胞自噬的效果

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(1)國立臺灣師範大學人類發展與家庭學系. 營養科學與教育組. 碩士論文 Department of Human Development and Family Studies National Taiwan Normal University. 傳統中草藥爵床純化物爵床素 A 對肝癌細胞產生細胞自噬的效果. The autophagic effect of Justicidin A purified from traditional Chinese medicine Justicia procumbens in human hepatocellular carcinoma cells. 研究生：吳幸芷 Hsing-Chih Wu 指導教授：蘇純立博士 Advisor：Chun-Li Su, Ph.D.. 中華民國一零二年六月 June, 2013.

(2) 中文摘要行政院衛生署 100 年統計資料顯示，肝癌在台灣癌症死因中排名第二位，全球癌症死因當中，肝癌排名第三位。目前 FDA 認可的肝癌標靶藥物 Sorafenib 並未有效治療肝癌，對正常細胞毒性很大，病人耐受度較差，而肝癌患者的抗藥性也造成目前的藥物無法有效治療肝癌，因此需要找尋新藥物。爵床素 A 是傳統中草藥爵床中萃取出來的純化物，我們研究團隊在之前研究中已發現爵床素 A 對人類正常周邊血細胞的毒性很低，但對癌細胞，如：大腸癌細胞株以及肝癌細胞株會誘發細胞凋亡，在動物實驗上也發現可抑制腫瘤細胞生長。近期研究發現細胞自噬與細胞凋亡間有許多蛋白會相互影響，細胞自噬可能會促進或抑制細胞凋亡，而影響癌症治療效果。因此，本研究將探討爵床素 A 對於人類肝癌細胞是否能誘發細胞自噬，並了解細胞自噬與細胞凋亡之間的關係。實驗使用 acridine orange 染色，以流式細胞儀分析自噬溶酶體產生比例確認自噬現象，發現自噬溶酶體比例與時間及劑量呈正相關。以西方墨點法檢測自噬小體上 LC3、p62 及溶酶體上 LAMP2a 蛋白表現量，觀察自噬小體的形成與降解時間點，發現在爵床素 A 1 M 濃度下作用 24 小時，LC3-II 與 LAMP2a 的表現量即明顯上升，到 96 小時 p62 蛋白表現量與 24 小時相比明顯降低。利用細胞自噬抑制劑 Bafilomycin A1(BAF)前處理抑制細胞自 i.

(3) 噬，以西方墨點法檢測發現有細胞自噬抑制劑前處理的組別，LC3、 p62、LAMP2a 表現量較未加抑制劑前處理的組別多，並由共軛焦顯微鏡發現在未加入抑制劑前處理的組別有較多 LC3 與 LAMP2a colocalization 的 puncta。顯示爵床素 A 能誘發 Hep 3B 細胞自噬，並完成細胞自噬流程。為探討細胞自噬與細胞凋亡之間的關聯，利用 BAF 及細胞凋亡的抑制劑 pan-caspase inhibitor zVAD-fmk 前處理 Hep 3B 細胞，以流式細胞儀與西方墨點法分析發現加入 BAF 前處理的組別，sub-G1 比例及活化型 caspase 3 表現量增加，而有無加入 zVAD-fmk 前處理不影響 LC3-II、p62、LAMP2a 的表現量，顯示爵床素 A 誘發的細胞自噬會抑制細胞凋亡但細胞凋亡不影響細胞自噬。利用西方墨點法發現爵床素 A 會誘發 Raf/MEK/ERK 路徑導致細胞自噬，與抑制 class I PI3K/Akt/mTOR 路徑以及誘發 class III PI3K/Beclin 1 路徑則無相關。為觀察爵床素 A 與臨床抗癌用藥 Sorafenib 合併效用，以細胞毒殺試驗分析發現 Sorafenib 在臨床使用之 10 M 濃度下與 0.5 M 或 1M 濃度的爵床素 A 合併使用皆有加成效應。整體而言，本研究顯示爵床素 A 在臨床應用上可與細胞自噬抑制劑合併使用來增加抗癌效果，也能增加 Sorafenib 的用藥敏感性，提升醫療品質。. 關鍵字：爵床素 A、人類肝癌細胞、細胞自噬、細胞凋亡、Sorafenib. ii.

(4) Abstract The 2011 statistics of Department of Health (DOH) shows that human hepatocellular carcinoma (HCC) is the second death of cancer in Taiwan, and is the third death of cancer in the world. Chemotherapy is the traditional choice for advanced HCC, but the FDA-approved targeted therapy Sorafenib limits the therapeutic effect due to its intolerable side effects to patients. Thus, to develop new drugs for HCC is urgent. Justicidin A (JA) is a purified compound isolated from Justicia procumbens. Our previous published report indicates that JA induced apoptosis of human HCC cells in vitro and in vivo. Recently, many reports indicate that there are interactions between autophagy and apoptosis, and the autophagic effect induced by anticancer drugs may inhibit or promote apoptotic cell death. The present study is proposed to investigate if JA can induce autophagy of HCC and to find out how JA-induced autophagy influences the process of JA-induced apoptosis. When autophagy was induced in cells, acidic vescular organelles (AVOs) produced in cells. By staining cells with acridine orange, induction of autophagy can be investigated. In the present study, JA increased the percentages of AVOs-positive cells in a time- and dose-related manners using flow cytometry. The expressions of LC3-II and LAMP2a increased as the incubation time increased, but that of p62 decreased between 24 to iii.

(5) 96 h. To confirm the process of autophagy flux, Hep 3B cells were pretreated with or without autophagy inhibitor Bafilomycin A1 (BAF) and then treated with JA. The increase in protein expression of LC3-II, p62 and LAMP2a using Western blot and the decrease in colocalization of LC3 and LAMP2a puncta using confocal microscopy in BAF-pretreated group confirm that JA not only induced autophagy but also completed the autophagy flux. In order to analyze the interaction between autophagy and apoptosis, Hep 3B cells were pretreated with BAF or pan-caspase inhibitor zVAD-fmk to inhibit autophagy and apoptosis, respectively. In BAF-pretreated Hep 3B cells, JA elevated the percentages of cells at sub-G1 phase and raised the expression of cleaved caspase 3. However, in zVAD-fmk-pretreated Hep 3B cells, no changes in the expression of autophagy-related LC3-II, p62 and LAMP2a proteins was observed, suggesting that using autophagy inhibitor promoted JA-induced apoptosis and JA-induced apoptosis didn’t affect JA-induced autophagy. Moreover, to investigate the molecules involved in JA-induced autophagic pathway, we observed that JA-induced autophagy was via activation of Raf/MEK/ERK pathway, and was not associated with inhibition of class I PI3K/Akt/mTOR or induction of class III PI3K/Beclin 1 pathway by western blot. To examine if addition of JA promotes chemosensitivity of Sorafenib, cell growth inhibition was. iv.

(6) analyzed using MTT assay. Addictive effect was found when cells were treated with 10 M Sorafenib, the dosage uses for patients, in combination with 0.5 or 1 M JA, suggesting the benefit of using JA in addition to Sorafenib. Taken together, our data suggest that the use of autophagy inhibitor should be taken into consideration to enhance the anticancer effect of JA and addition of JA promotes the chemosensitivity of FDA-approved targeted therapy Sorafenib.. Key words: Justicidin A, human hepatocellular carcinoma, autophagy, apoptosis, Sorafenib. v.

(7) 誌謝兩年來的碩班生活，研究論文能順利完成，很感謝許多人的幫助與鼓勵。首先謝謝指導教授蘇純立老師，給予我們很大的思考空間，也很有耐心的帶領一些實驗邏輯，培養獨立思考的能力，在實驗討論的過程中也給與許多不同的看法，激發出更多不同的想法，謝謝老師的指導！感謝口試委員黃奇英教授、劉校生教授百忙當中審閱論文，提供許多意見及修正建議，也提供了實驗技術與資源讓我學到更多，感謝台北醫學大學葉淇臺老師提供儀器，讓實驗順利完成，這本論文更加完整。在研究所學習到了不少實驗技巧，感謝呈欣學姐的實驗入門指導，及盈堤、嘉玲學姐的叮嚀，除了提醒及提點實驗上許多該注意的細節與建議，在我心情最低落的那陣子也給與我不少鼓勵與安慰，很慶幸能遇到兩位這麼好的學姐，也感謝同為師大的小柏、雅欣，總是互相鼓勵與幫忙，感謝銘穗常常陪我聊天把在難過情緒中的我拉出來，也感謝琇雯與雅雯兩位學妹，打點了許多實驗室的事務，還有芝翎學妹，假日總是會在實驗室出現，讓我不覺得自己孤單做實驗!在成大的日子，雖然只有寒暑假，但能認識到這麼厲害的學長姐與同學，真的很難得；感謝昇輝學長與珊盈學姐在實驗上的幫忙，還有爽朗的紓晴陪我聊天。感謝陽明黃老師實驗室的小丁與小嘟，除了教我實驗技術外 vi.

(8) 還幫忙我顯微鏡的拍攝，謝謝你們！還有謝謝在雙和醫院的 Ivy，抽空幫忙我們實驗儀器操作。也感謝貴芳姐姐與姐夫一家人，不僅提供我在高雄暫住的房間，還照顧生病的我、帶我逛遍高雄，讓我不用擔心環境適應不良的問題。感謝好友們錡瑩、朝萱、侑桂、劭子、郭子瑜、怡君、黃宇辰、 Jess、Yvonne 以及家教班的老師與大姊還有吳老師與 Simone 和容易鑽牛角尖的我聊天與打氣，你們所給的心靈上的支持與開導，讓我有更多的動力往前。感謝徐偉方，常常討論實驗上的問題以及人生哲理還請我吃福祿閣的蛋糕；還有常找我去看電影、吃飯的表弟，讓我有忙裡偷閒的時刻，還有許多人在這段期間無論是關心或是打擊，雖然未能一一列出名字，但也由衷的感謝你們。還有最重要的是我的家人們，感謝爸媽總是無條件的提供我念書，總是讓我能專心的完成目標。目前，這個階段的目標算是完成了，對於學業上或是人際關係上都有更多的體驗，因而成長。再次的由衷感謝大家！. 僅將此論文獻給我敬愛的大家吳幸芷. 謹誌於. 國立台灣師範大學人類發展與家庭學系碩士班中華民國一零二年六月 vii.

(9) 目錄第一章第一節. 緒論 ......................................................................................... 1 肝癌 ...................................................................................... 1. 一、肝癌的流行與發生.................................................................... 1 二、肝癌治療 ................................................................................... 2 第二節. 爵床素 A............................................................................... 5. 第三節. 計畫性細胞死亡 ................................................................... 7. 一、細胞凋亡 ................................................................................... 7 二、細胞自噬 ................................................................................. 10 第二章. 研究目的 ............................................................................... 14. 第三章. 材料與方法............................................................................ 16. 第一節. 實驗藥品與試劑 ................................................................. 16. 第二節. 儀器與實驗耗材 ................................................................. 19. 第三節. 實驗方法 ............................................................................ 23. 一、細胞株繼代培養、解凍及保存 .............................................. 23 二、藥物配製 ................................................................................. 26 三、細胞存活率分析 ..................................................................... 26 viii.

(10) 四、細胞自噬比例分析.................................................................. 27 五、細胞週期比例分析.................................................................. 28 六、西方墨點法 ............................................................................. 29 七、免疫螢光染色法 ..................................................................... 36 八、統計分析方法 ......................................................................... 39 第四章. 結果 ....................................................................................... 40. 第一節. JA 能誘發 Hep 3B 細胞自噬現象 ..................................... 40. 第二節. 抑制細胞自噬能促進 JA 毒殺 Hep 3B 細胞及細胞凋亡，而. 抑制細胞凋亡不影響 JA 所誘發的細胞自噬 ................................... 52 第三節. JA 所誘發的細胞自噬與 MEK/ERK 路徑的活化有關 ..... 62. 第四節. JA 與臨床藥物 Sorafenib 合併使用對於肝癌細胞的影響 73. 第五章. 討論 ....................................................................................... 78. 第六章. 結論 ....................................................................................... 86. 第七章. 參考文獻 ............................................................................... 87. 附錄 ..................................................................................................... 104. ix.

(11) 圖次 Fig. 1 Effect of JA on autophagy of HCC Hep 3B cells.......................... 44 Fig. 2 JA significantly induced LC3-II expression, and the decrease of p62 at 96 h compared to 24 h suggested the process of autophagy flux............................................................................................... 45 Fig. 3 BAF increased JA-induced LC3-II expression in Hep 3B cells. ... 47 Fig. 4 BAF increased JA-induced p62 expression in Hep 3B cells. ........ 48 Fig. 5 BAF increased JA-induced LAMP2a expression in Hep 3B cells. 49 Fig. 6 BAF dcreased JA-induced colocalization of autophagosomal and lysosomal markers........................................................................ 50 Fig. 7 BAF increased JA-induced cell growth inhibition in Hep 3B cells. ..................................................................................................... 55 Fig. 8 BAF increased JA-induced sub G1 percentage in Hep 3B cells. .. 56 Fig. 9 BAF increased JA-induced cleavage caspase 3 expression in Hep 3B cells. ....................................................................................... 57 Fig. 10 zVAD-fmk decreased JA-induced cleavage caspase 3 expression in Hep 3B cells. .......................................................................... 58 Fig. 11 zVAD-fmk didn’t affect JA-induced LC3-II expression in Hep 3B cells. ........................................................................................... 59 x.

(12) Fig. 12 zVAD-fmk didn’t affect JA-induced p62 expression in Hep 3B cells. ........................................................................................... 60 Fig. 13 zVAD-fmk didn’t affect JA-induced LAMP2a expression in Hep 3B cells. ..................................................................................... 61 Fig. 14 Expression of Atg12-Atg5 and Atg5 in JA-treated Hep 3B cells. 65 Fig. 15 Expression of Beclin 1and Class III PI3K in JA-treated Hep 3B cells. ........................................................................................... 66 Fig. 16 Expression of total mTOR and phospho-mTOR in JA-treated Hep 3B cells. ..................................................................................... 67 Fig. 17 Expression of total Akt and phospho-Akt in JA-treated Hep 3B cells. ........................................................................................... 68 Fig. 18 Expression of total class I PI3K and phospho-class I PI3K in JA-treated Hep 3B cells. ............................................................. 69 Fig. 19 Expression of pan-Ras in JA-treated Hep 3B cells. .................... 70 Fig. 20 Expression of total MEK and phospho-MEK in JA-treated Hep 3B cells. ........................................................................................... 71 Fig. 21 Expression of total ERK and phospho-ERK in JA-treated Hep 3B cells. ........................................................................................... 72 Fig. 22 Effect of Sorafenib with or without JA on Hep 3B cells viability xi.

(13) determined by MTT assay and the interaction of sorafenib and JA determined by the value of q. ..................................................... 76 Fig. 23 Effect of Sorafenib with or without JA on Hep 3B cells viability determined by MTT assay and the interaction of sorafenib and JA determined by the value of q. ..................................................... 77. xii.

(14) 附錄 Appendix Fig. 1 The picture of Justicia procumbens and the structure of Justicidin A................................................................. 104 Appendix Fig. 2 The apoptosis signaling pathway. .............................. 105 Appendix Fig. 3 The process of autophagy pathway. ........................... 106. xiii.

(15) 第一章. 第一節. 緒論. 肝癌. 一、肝癌的流行與發生肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）在全球癌症死因中排名第三位(Llovet & Bruix, 2008)，亞洲及非洲有較高的好發率，但在美洲及歐洲肝癌的發生率也有持續成長的情形(Llovet, Di Bisceglie, et al., 2008)。台灣行政院衛生署 100 年統計資料顯示，癌症佔死亡原因排名第一位，而癌症死因中肝癌則僅次於肺癌，排名第二位，可見肝癌對於國人健康的威脅。肝癌發生的機制目前尚未完全明確，飲食、遺傳、藥物代謝、病毒感染都可能使肝臟受損，增加肝癌的發生率。 B 型肝炎病毒的感染是造成肝癌的主要危險因子，其次為 C 型肝炎病毒及酒精引起的病變(Bosch, Ribes, Diaz, & Cleries, 2004)，B 型肝炎病毒感染在亞洲及非洲國家較為普遍，在西方國家則是 C 型肝炎病毒的感染佔較多數(But, Lai, & Yuen, 2008)，無論是 B 型肝炎或是 C 型肝炎的患者都有很大的風險罹患肝硬化，最後可能導致肝癌(Degos et al., 2000; Fattovich et al., 1991)。自西元 1991 年起，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）推行施打 B 型肝炎疫苗後，臺灣地區 B 型肝炎盛行率大幅降低，也減少因 B 型肝炎所導致的肝癌比例(Chang et al., 1997; Lai & Lau, 2005)。此外，其他影響因子如：飲食中的黃麴 1.

(16) 毒素（Aflatoxin）造成的 p53 基因突變、遺傳性疾病血鐵沉積症（hereditary hemochromatosis）、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis；NASH）都會提高罹患肝癌的風險 (Bruix & Sherman, 2011; Qian et al., 1994)。二、肝癌治療目前肝癌的治療方式有外科手術治療、肝臟移植及化學藥物治療，在治療前需評估病患的身體狀況、腫瘤的大小來選擇治療的方式，但皆有一定的風險及負作用存在。手術切除腫瘤對於肝腫瘤小於 2 cm、無肝硬化及肝臟功能較良好的病患，其治療效果較佳，併發症也較少，但病患在切除腫瘤後五年內復發率高達 80%(Imamura et al., 2003)。其他的手術治療方法還包括經皮酒精注射法（Percutaneous ethanol injection，PEI）、射頻切除手術（Radiofrequency ablation，RFA）、微波熱凝治療（Microwave coagulation therapy，MCT）、肝動脈栓塞化療（Transarterial chemoembolization，TACE）、肝動脈栓塞放射線治療（Transarterial radioembolization，TARE）(Maluccio & Covey, 2012)。經皮酒精注射法是將針插入肝臟腫瘤內並緩慢注射 95%的酒精，造成局部細胞壞死。射頻切除手術是利用熱能造成癌細胞壞死，經皮酒精注射法及射頻切除手術在 2 cm 以下的腫瘤治療效果最好，若大於 2 cm 的腫瘤則是射頻切除手術的效果較佳，但若腫瘤太過靠近附近的 2.

(17) 器官則會因怕波及到其他器官而有所限制(Bruix & Sherman, 2011)。肝動脈栓塞化療則是將化療藥物置入供應癌細胞的主要動脈中，造成細胞壞死並延緩腫瘤生成，目前常用的藥物為 Doxorubicin、Cisplatin 與 Lipiodol 混合使用，但也發現病患有嚴重的副作用，造成肝臟衰竭而死亡的病例(Chan, Yuen, Hui, Tso, & Lai, 2002)。肝臟移植較不受肝硬化的限制，可以清除所有肝臟內部癌細胞病灶，且復發率也較手術切除低(Iwatsuki et al., 1991)，但病患可能在等待肝臟移植時，肝癌繼續惡化而死亡或被排除在等後名單內(Iwatsuki, et al., 1991)。由於肝癌患者被診斷出肝癌時大多是較後期的肝癌，此時無法使用手術方式治療，因此化學藥物治療是病患的首要選擇。目前臨床化療用藥有 Doxorubicin、5-Fluorouracil（5-FU）、Capecitabine、Cisplatin、 Tamoxifen 等，但這些藥物合併或單獨使用也只能延長使用這些藥物的病患壽命 3～12 個月(Kawano et al., 2012)，治療後出現的負作用常讓病患難受；此外，肝癌常出現多重藥物抗藥性（Multidrug resistance， MDR）也增加治療的困難(Perez-Tomas, 2006)。病患常見的副作用像是 Doxorubicin 會引發心毒性而有劑量限制(Sadzuka, Nagamine, Toyooka, Ibuki, & Sonobe, 2012)。目前最新的臨床標靶藥物 Sorafenib 在 2007 年由美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration；FDA）核准使用於肝癌治療上(Llovet, Ricci, et al., 2008)，Sorafenib 為多酶抑 3.

(18) 制劑，能抑制血管新生及抑制腫瘤生長，但在臨床上發現只能使病患延長 3 個月的壽命(A. L. Cheng et al., 2009; Llovet, Ricci, et al., 2008)。產生的副作用像是：體重減輕、噁心、嘔吐、手足症後群也讓病患感到不適(Rossi et al., 2010)。同為抑制血管新生的 Bevacizumab 在臨床試驗第一、二期發現對於肝癌患者有好的治療效果，但會造成嚴重的出血副作用，因此使用上也需審慎的評估(Rossi, et al., 2010)。目前在臨床試驗上合併 Sorafenib 與 Doxorubicin 藥物的治療，雖然病人有較好的耐受性，但對於癌細胞死亡的機制卻有相互抵制癌細胞凋亡的效果(Manov, Pollak, Broneshter, & Iancu, 2011)。而 Sorafenib 與 5-FU 合併使用的結果發現，病患存活率雖然有較高，但其手足症後群在有肝硬化病人身上發生頻率卻增加(B. Xie, Wang, & Spechler, 2012)。以上的治療結果可發現目前治療肝癌的藥物不僅副作用大，且無論有無合併使用，其治療效果並不佳，因此找尋有效且副作用低的藥物為目前迫切所需。. 4.

(19) 第二節. 爵床素 A（Justicidin A，JA）. 爵床素 A （Justicidin A，JA）是由全草植物爵床（Justicia procumbens，JP）萃取出來的純化物，爵床為民間傳統中藥，具有抗菌消炎、止痛、治療發燒的功效(Asano, Chiba, Tada, & Yoshii, 1996; Weng, Ko, Yeh, Lin, & Lin, 2004) （Appendix Fig. 1）。之前的研究發現，在以脂多醣（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的巨噬細胞 RAW 264.7 細胞株中給與低濃度（ 1 M）的 JA 能促進腫瘤壞死因子-（Tumor necrosis factor-，TNF-）生成，但在大於 5M 的濃度下，JA 卻能抑制 TNF-被高基氏體（Golgi body）運送至細胞膜上，降低 TNF- 分泌Tsao, Lin, & Wang, 2004)。我們研究團隊之前的研究發現，結直腸癌細胞 HT-29 以及 HCT 116 兩種細胞株在 JA 處理後，會降低細胞質中的 Ku70 蛋白表現量，增加粒線體上的 Bax 蛋白量，破壞粒線體膜電位，增加粒線體釋放細胞色素 c（Cytochrome c）到細胞質中，進而活化 caspase-9 及 caspase-3 讓細胞產生細胞凋亡而死亡，而使用不同濃度的 JA 培養六天使用 MTT 檢測其抑制率計算出 IC50 的濃度則發現，人類正常單核球細胞（Peripheral blood mononuclear cells， PBMC）的 IC50 明顯大於 HT-29 以及 HCT 116 細胞株，顯示對於正常細胞並無明顯影響；在動物試驗中，給予 NOD-SCID 老鼠每天口服 6.2 或 10.6 mg/kg 的 JA 達 60 天，發現老鼠體內 HT-29 腫瘤細胞的生 5.

(20) 長有明顯降低(J. C. Lee et al., 2005)；另外在肝癌細胞株 Hep 3B 以及 Hep G2 中，發現 JA 能誘發 caspase-8 活化，讓粒線體膜電位降低，細胞質中的細胞色素 c 及 Smac/DIABLO 蛋白質表現量增加，經由內在及外在路徑導致細胞進行細胞凋亡，並且在動物試驗中將 Hep 3B 細胞株注射至 NOD-SCID 老鼠體內，每天餵食 20 mg/kg 的 JA 至 60 天，也發現能降低腫瘤的生長(Su et al., 2006)。. 6.

(21) 第三節. 計畫性細胞死亡（Programmed cell death，PCD）. 計畫性細胞死亡在器官發育的過程中扮演著關鍵且重要的角色，能控制細胞的數量，讓受損的細胞死亡，維持細胞的動態平衡。細胞死亡可分為三種：細胞凋亡（Apoptosis，Type I）、細胞自噬（Autophagy， Type II）、細胞壞死（Necrosis，Type III）(Lockshin & Zakeri, 2004)。計畫性細胞死亡包括細胞凋亡及細胞自噬(Debnath, Baehrecke, & Kroemer, 2005)，因細胞壞死會造成周邊組織產生發炎反應，所以在癌症治療上會以導致細胞凋亡的死亡方式為目標。一、細胞凋亡細胞凋亡是生物體內主要的計畫性細胞死亡方式，當細胞受到無法回復的損傷時就會進行細胞凋亡讓細胞走向死亡(Kerr, Wyllie, & Currie, 1972)。主要特徵包括：細胞膜上的 phosphatidylserine（PS）外翻、細胞膜皺縮（Shrinkage）、細胞核濃縮（Nuclear condensation）、細胞膜萎縮成空泡狀（Membrane blebbing）、細胞凋亡小體（Apoptotic body）產生，最後被鄰近的巨噬細胞吞噬(Hengartner, 2000)。其訊息傳遞路徑分為兩種：外在路徑（Extrinsic pathway）和內在路徑（Intrinsic pathway）（Appendix Fig. 2）。外在路徑是藉由 death ligand 如：Fas ligand、CD95 ligand、 TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）與 death receptor，如： 7.

(22) Fas、CD95、Tumor necrosis factor receptor（TNFR）結合後形成 Death complex 再與 adaptor（如：Fas-associated death domain，FADD）以及 initiator caspase（如：procaspase-8）結合形成更大的複合體，稱為 Death inducing signaling complex（DISC），誘發 caspase-8 活化後引發一連串 pro-caspase 活化，最後活化 caspase-3 而走向細胞凋亡 (Lavrik, Golks, & Krammer, 2005; Walczak & Krammer, 2000; Zapata et al., 2001)。內在路徑則是以粒線體為主要中心，當細胞受到刺激（如： UV 光照射、藥物刺激），粒線體外膜變得可通透時，細胞色素 c （Cytochrome c）、Smac/DIABLO、AIF、endonuclease G 會被釋放出來(Saelens et al., 2004)，細胞色素 c 被釋放出後與 Apaf-1 及 procaspase-9 結合，形成 apoptosome，進而活化 caspase-9 及 caspase-3，最後導致細胞凋亡(Reed, 1997)。其它與細胞凋亡相關的蛋白質還有 p53、NF-B、Bcl-2 家族蛋白、 MAPK 家族蛋白。Bcl-2 家族蛋白對於細胞凋亡的調控扮演重要的角色，主要分為三類：促進細胞凋亡蛋白（如：Bax、Bak），抑制細胞凋亡蛋白（如：Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1）及 Bcl-2 Homology (BH) domains(Adams & Cory, 2007; Youle & Strasser, 2008)。Bax 及 Bak 蛋白主要存在於細胞質中，粒線體受到刺激後 Bax 及 Bak 蛋白會聚集在粒線體外膜上，形成通道讓粒線體內的細胞色素 c 能穿過通道釋放 8.

(23) 至細胞質中(Kroemer, Galluzzi, & Brenner, 2007); Bcl-2 及 Bcl-XL 則會抑制 Bax 移到粒線體外膜上，避免形成通道因而抑制細胞色素 c 的釋放。而只有 BH3 結構的蛋白質（如：Bid、Bad、PUMA）會增進促凋亡蛋白質 Bax、Bak 的活性(Giam, Huang, & Bouillet, 2008)。p53 會活化 Bcl-2 家族蛋白中的促凋亡蛋白如：Bid、PUMA，間接調控內在路徑或是直接活化 Bax 或 Bak 讓粒線體外膜通透性增加來促進細胞凋亡進行(Moll, Wolff, Speidel, & Deppert, 2005)。Extracellular signal-regulated kinase（ERK）屬於 MAPK 家族蛋白，其上游蛋白還有 Mitogen-activated protein kinase/ERK kinase（MEK）、Raf 及 Ras； Raf/MEK/ERK 路徑會影響細胞凋亡的內在及外在路徑相關蛋白質，對於細胞凋亡的調控有促進及抑制的功能。活化的 ERK 會降低粒線體膜電位促進細胞色素 c 的釋放，活化 caspase 9 來促進細胞凋亡進行並且調控 Bcl-2 家族蛋白，正調控促凋亡蛋白質：Bax、PUMA、 Bak、Bim，使促凋亡蛋白表現量增加，負調控抑凋亡蛋白質：Bcl-2 及 Bcl-XL，來促進細胞凋亡。但也會活化抑凋亡蛋白質 Mcl-1，抑制 Bax 活化與合成 homodimers，以及磷酸化 Bad S112 的位置，抑制 Bad 促凋亡功能，進而抑制細胞凋亡(Harada, Quearry, Ruiz-Vela, & Korsmeyer, 2004; H. Li et al., 2007; J. Liu, Mao, Ding, & Liang, 2008; Schweyer et al., 2004)。對於外在路徑則能藉由增加 death ligand 及促 9.

(24) 進 death receptor 與 adaptor 結合來活化 caspase-8 促進細胞凋亡進行 (Tewari, Sharma, Koul, & Sen, 2008) 。二、細胞自噬細胞自噬在 1963 年首先被提出，為受損細胞內藉由溶酶體（Lysosome）降解的過程，普遍存在於真核細胞內，是一種維持細胞動態平衡的機制，在細胞受到壓力或營養缺乏時，細胞為了自救而產生雙層膜的自噬體（Autophagosome）包裹受損或老化的胞器，再與溶酶體結合，由溶酶體內的酵素分解自噬體內的物質後，釋放出胺基酸讓細胞利用而能存活(Mizushima, Yoshimori, & Levine, 2010)。細胞自噬的形成及降解分為五個階段：起始（Initiation）、延展（Enlogation）、包覆（Closure）、融合（Fusion）、降解（Degradatoin） (Huett, Goel, & Xavier, 2010)（Appendix Fig. 3）。起始的階段是由一系列 Atg （Autophagy related gene）蛋白以及 LC3 蛋白所構成，當 Atg8/LC3-I 與 phosphatydylethanolamine（PE）結合形成 Atg8/LC3-II，與 Atg7、Atg12-Atg5-Atg16L 蛋白質複合體及 Beclin1、class III PI3K 共同作用即可繼續延展自噬體雙層膜構造，雙層膜形成後 Atg12-Atg5-Atg16L 蛋白質複合體便脫離雙層膜，保留 LC3-II 蛋白在膜上，雙層膜內包裹大量蛋白質及其它胞器，溶酶體靠近結合形成自噬溶酶體（Autolysosome）並呈酸性，因此也稱為酸性囊狀胞器（Acidic 10.

(25) Vesicular organelles，AVOs），內部的物質藉由酶的分解後，可再被細胞利用，使細胞獲得養份(Baehrecke, 2005; Mizushima, Ohsumi, & Yoshimori, 2002; Z. Xie & Klionsky, 2007)。近年來的研究也發現細胞自噬也與 ubiquitin pathway 有交互作用，其中 p62/SQSTM1 蛋白，會與 Atg8/LC3 蛋白結合，當細胞自噬被誘發並且細胞自噬流程進行至後期與溶酶體結合後，p62 的含量會下降，反之若抑制了細胞自噬進行，p62 就會累積在細胞中，此現象可利用西方墨點法來觀察藉由使用 Bafilomycin A1（BAF）抑制溶酶體與自噬小體結合，讓 p62 無法被降解，因此 p62 也可作為細胞自噬流程的一個指標(Komatsu et al., 2007; Larsen et al., 2010)。細胞自噬訊息傳遞路徑主要分為兩條：（1） Class I phosphoinositide 3-kinase（Class I PI3K）/AKT/mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway 以及（2）Class III PI3K/Beclin-1 signaling pathway(Pattingre, Espert, Biard-Piechaczyk, & Codogno, 2008)。Class I PI3K 由生長因子（Growth factor）活化後，會促進 PIP2 磷酸化成 PIP3 能誘發其下游分子 Akt 活化，最後活化 mTOR 而抑制細胞自噬進行(Gonzalez-Polo et al., 2005)。另一條路徑 Class III PI3K 與 Beclin-1 結合形成複合體，誘發細胞自噬發生並參與了自噬小體的形成(Itakura, Kishi, Inoue, & Mizushima, 2008)。Beclin-1 是屬於 BH3 11.

(26) 結構家族蛋白的一員，目前也有研究顯示 Bcl-2 及 Bcl-XL 也會與 Beclin 1 交互作用來抑制細胞自噬(Maiuri, Zalckvar, Kimchi, & Kroemer, 2007)。致癌基因 Ras 能活化 Class I PI3K 路徑來抑制細胞自噬，但也能經由活化 Raf/MEK/ERK 路徑來誘發細胞自噬，ERK 的活化能促使 LC3-I 轉變成 LC3-II 來幫助自噬小體的形成，也能誘發 Beclin 1 活化來促進細胞自噬進行(Y. Cheng, Qiu, Tashiro, Onodera, & Ikejima, 2008; Pattingre, Bauvy, & Codogno, 2003)。細胞自噬被視為一種細胞自救的行為，在正常細胞中，若處於飢餓或代謝壓力的環境下，細胞自噬會產生來幫助細胞在惡劣環境中存活。但持續處於惡劣環境下導致細胞自噬過度表現，則會讓細胞走向死亡(Levine, 2007)。在細胞凋亡及細胞自噬路徑中，發現有許多共同的上游分子；所誘發的下游蛋白中，也有許多蛋白彼此交互作用；在不同的刺激下，兩者之間可能會互相促進或互相抑制。內質網壓力能誘發細胞凋亡的內在路徑也會誘發細胞自噬的產生，但在某些研究中則發現，抑制了內質網壓力所誘發的細胞自噬能促進細胞凋亡進行 (Ogata et al., 2006; Xu, Bailly-Maitre, & Reed, 2005; Yorimitsu, Nair, Yang, & Klionsky, 2006)；另外 Atg5 不只能促進細胞自噬產生，也會與 FADD 產生交互作用，促進 caspase 相關的細胞凋亡路徑進行(Pyo et al., 2005; Yousefi et al., 2006)。 12.

(27) 在治療癌症方面，部分實驗發現抗癌藥物可藉由誘發細胞自噬來抑制癌細胞生長，像是 Perhexilin、Niclosamide 會抑制 mTORC1 來促進細胞自噬進行，(Balgi et al., 2009; Salazar et al., 2009; Turcotte et al., 2008)。然而近年研究也發現，某些癌細胞上，化學藥物治療及放射線治療所誘發的細胞自噬會抑制細胞凋亡的進行，造成治療效果不佳 (Boya et al., 2005a)，因此細胞自噬抑制劑則需考慮使用。在乳癌細胞株上則發現，將化療藥物 Ixabepilone 與細胞自噬抑制劑 Hydroxy-chloroquine（HCQ）合併使用治療，效果較佳。也有研究發現將細胞自噬抑制劑 3-methyladenine（3-MA）與抗癌藥物 5-FU 合併使用在大腸直腸癌細胞株上，可提高抗癌藥物的療效(Chen & Karantza-Wadsworth, 2009; J. Li et al., 2009)。因此，在癌症治療上，細胞自噬與細胞凋亡之間，釐清其互相抑制或促進的關係，越來越重要。. 13.

(28) 第二章. 研究目的. 本論文的研究目的在於探討爵床素 A（JA）對於人類肝癌 Hep 3B 細胞是否會產生自噬現象，並釐清細胞自噬與細胞凋亡間的關係，實驗也將 JA 與臨床藥物合併使用在肝癌細胞上，期望能在癌症治療上有更好的抗癌療效，並且有更少的副作用及增加化療敏感性。實驗設計如下：一、檢測 JA 是否引發 Hep 3B 細胞之細胞自噬。利用流式細胞儀分析 Acridine orange（AO）染劑所染到的酸性囊狀胞器（Acidic vescular organelles，AVOs）比例來確認細胞自噬情形。再以西方點墨法來觀察細胞自噬中 LC3-II 以及 p62 蛋白的表現量，檢測 JA 是否引發 Hep 3B 之細胞自噬，並有走完細胞自噬的流程。並使用細胞自噬的抑制劑 Bafilomycin A1（BAF）來抑制細胞自噬進行，以西方墨點法檢測細胞自噬相關蛋白表現及以共軛焦顯微鏡來觀察細胞自噬小體是否有與溶酶體結合，確認細胞自噬流程的進行。二、分析細胞自噬與細胞凋亡的關聯性。使用細胞自噬抑制劑 BAF 抑制細胞自噬進行，以 MTT assay 確認使用 BAF 後 JA 毒殺細胞的能力。並以流式細胞儀來分析 AO 染劑染 AVOs，確認細胞自噬產生的情形，以 propidium iodide （PI）染劑染色分析細 14.

(29) 胞週期 Sub- G1 的比例。實驗也使用西方墨點法觀察相關蛋白的表現量，釐清 JA 所誘發的細胞自噬現象是否影響細胞凋亡。並利用 pan-caspase 蛋白的抑制劑 zVAD-fmk 抑制細胞凋亡的表現，以西方墨點法檢測細胞凋亡相關蛋白的表現，確認抑制細胞凋亡後細胞自噬產生的情形。三、探討 JA 引起細胞自噬的相關機轉。利用西方墨點法檢測不同時間點下細胞自噬的相關蛋白質表現量。四、探討合併使用臨床藥物對於肝癌細胞的效果。實驗使用 MTT assay 算出 q 值確認 JA 是否可以協同、加成或拮抗 Sorafenib 的療效。. 15.

(30) 第三章. 第一節. 材料與方法. 實驗藥品與試劑. 爵床素 A (Justicidin A，JA)由高醫香妝品學系林忠男教授提供 Sorafenib 由陽明大學生藥所黃奇英教授提供藥劑名稱. 產品編號. 廠商. Dimethyl sulfoxide (DMSO). D2650. Sigma, St. Louis, MO, USA. Methyl alcohol. 494437. 3-4,5-Dimethyl-2-thiazolyl (MTT). M5655. NaCl. S5886. Glycerol. G5516. Bafilomycin A1. B1793. Penicillin. P3032. Streptomycin. S9137. Protein inhibitor cocktail. P9599. Phosphtase inhibitor cocktail. P2850. Propidium iodide. P4170. Acridine orange. A6014. Ribonuclease A (RNase A). R6513. Skim milk. 70166. Trypan blue solution. T8154. Triton X-100. T6878. 16.

(31) Albumin from bovine serum (BSA). A7906. hochest 33258. 861405. 30% Acrylamide. 161-0156. Ammonium persulfate (APS). 161-0700. Glycine. 161-0724. N,N,N, N-tetra-methylethlyenediamine (TEMED). 161-0800. Protein assay dye reagent. 500-0006. EDTA. K10721018. KH2PO4. 104873. Sodium dodecyl sulfate (SDS). 113760. Paraformaldehyde. 1.04003.1000. Trypsin-EDTA. 15400-054. Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM). 11995-040. Fetal bovine serum (FBS). 10437-028. NaHCO3. 191-0130. NaOH. 197-02125. Na2HPO4. 199-0282. Sucrose. 1900-2150. Tween 20. 2055-3250. Tris ultrapure. A1086. Developer. 900943. Fixer. 1901875 17. Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA. Merck, Darmstadt, Germany. GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA. Wako, Osaka, Japan. Showa Chemical, Tokyo Applichem, Boca Raton, FL, USA Kodak, Rochester, NY, USA.

(32) M-PER mammalian protein extraction reagent. 78501 SM0671. Prestained protein ladder PM006-0500. Bovine serum albumin (BSA). B9001S. Chemiluminescent HRP substrate. WBKLS0100. Mounting medium. H-1000. zVAD-fmk. sc-311561. 18. Pierce, Rockford, IL, USA Fermentas, Glen Burnie, MD, USA Gene DireX, Inc., Las Vagas City, Nevada, USA New England Biolabs Inc., Ipswich, Australia Millipore Corp. Billerica, MA, USA Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA.

(33) 第二節儀器與實驗耗材器材名稱二氧化碳細胞培養箱. 產品編號. 廠商. SCA-165DS. Astec Co., Ltd, Fukuoka, Japan. 4BH-24. HI TEN, Taiwan, ROC. CO2 incubator 垂直循環負壓式操作台 Laminar Flow 相位差顯微鏡. CK-2. 封罩式電動共軛焦顯微鏡 (儀器位置：國立陽明大學. FV 10i. Olympus, Tokyo, Japan. 公共儀器中心) 高速離心機. Allegra X-22R 392187. 細胞計數盤. 719805. 恆溫水浴槽. B205-T2. 超純水數位整合系統. ZR0Q00800. Millipore, Billerica, MA, USA. TB-215D. Denver, Bohemia, NY, USA. Q259-1085. Corning, NY, NY, USA. GENIE® VORTEX-2. Scientific Industries, Bohemia, NY, USA. pH211. Hanna Instruments, Taipei, Taiwan. Milli-Q Direct 8 電子微量天平加熱攪拌器 Stirrer 調速震盪器 Vortex 酸鹼測量器. Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA BRAND, Wertheim, Germany Firstek Scientific, Taipei, ROC. pH meter 19.

(34) 分光光度判讀機. 3111302-28. ELISA reader. Molecular Devices, San Francisco, CA, USA. 流式細胞儀（儀器位置：行政院衛生署 FACS Calibur. Becton Dickinson, Lexington, KY, USA. 雙和醫院） Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA Owl Scientific Inc., Woburn, MA, USA. 小型蛋白質垂直電泳槽. BP165-8007. 電源供應器. 164-5050. 半乾式蛋白質轉漬器. 18712. 冰箱（-4℃, -20℃）. 8ED2FHKXVT. Whirlpool. 低溫冷凍櫃（-20℃）. FFU2124DW. Frigidaire. 超低溫冷凍櫃（-80℃）. Revco ULT 1386-3-V12. Revco. Dancing Roller The Belly Dancer. 4.702.610. Stovall Life Science, Inc., USA. 烘箱. UNB 400. Memmert, Germany. 可調式微量分注器. U52843A. Pipetteman. A20608. 吸管輔助器. Gilson, Middleton, USA Nichiryo, Tojyo, Japan. 18-068. Drummond, Broomall, PA, USA. 玻璃吸管. NC-0710. Sibata, Tokyo, Japan. 50 ml 離心管. 227261. Greiner Bio-One, Munich, Germary. 15 ml 離心管. 188271. Pipette-aid. 20.

(35) 6 well 細胞培養盤. 140675. 96 well 細胞培養盤. 167008. 10 cm 細胞培養盤. 172958. 細胞培養瓶（25T）. 156340. 細胞培養瓶（75T）. 156472. 細胞冷凍管. 363401. 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube. 352052. （Flow 小管） Microtube. MCT-150-C. 拭鏡紙. 34155. 微量過濾器 0.22 m. SCGPT05RE. PVDF membrane. NEF1002. 轉漬用濾紙. Nunc, Roskilde, Denmark. Becton Dickinson, Lexington, KY, USA Axygen Inc., Central Avenue Union City, CA, USA Kimberly-Clark professional, Roswell, GA, USA Millipore Corp., Billerica, MA, USA Perkin Elmer, Santa Clara, CA, USA. GFP001. GenePure, USA. 3008. Costar Corp., Cambridge, MA, USA. Filter Paper 細胞刮勺 Cell lifter X-ray film Polysine® microscope slide. Super RX 47410 08399 # P4981-001. 載玻片 21. Fujifilm, Tokyo, Japan ESCO® porsmouth, New Hampshire, VA, USA.

(36) Cover glass 蓋玻片. 0111520 0101050. 22. Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Germany.

(37) 第三節實驗方法一、細胞株繼代培養、解凍及保存細胞株：Hep 3B (Human hepatocellular carcinoma cell line) 實驗溶液名稱. 藥品. 劑量. DMEM. 450 ml. FBS. 50 ml. 細胞培養液. Penicillin. 0.059 g. DMEM + 10% FBS. Streptomycin. 0.05 g. 保存於 4℃冰箱. Phosphate buffer saline (PBS) 10X. NaCl. 80 g. KCl. 2g. KH2PO4. 2g. Na2HPO4. 11.5 g. 加 M. Q water 至 1L、調整 pH 7.4，使用時稀釋成 1 倍，經 0.22 M 過濾膜過濾 Trypsin. 以 PBS 1：1 稀釋，分裝後保存於-20℃冰箱. （一）細胞繼代培養人類肝癌細胞 Hep 3B 以含有 10% FBS 的 DMEM 細胞培養液進行培養，將細胞培養在 25T 或 75T 細胞培養盒，細胞生長環境為含有 5% CO2 氣體、37℃細胞培養箱，大約 2-3 天更換一次培養液。待生長至 8 分滿時需進行繼代分盤，將細胞培養盒內的培養液抽出，以 PBS 輕柔沖洗後加入 0.25% Trypsin 2-3ml 至培養盒中，放入含有 5% 23.

(38) CO2 氣體、37℃細胞培養箱中靜置 1-2 分鐘後取出，輕拍培養盒讓細胞懸浮，再加入與 Trypsin 等量的 10% DMEM 終止 Trypsin 反應，並使用玻璃吸管稍加打散細胞，爾後將多餘的細胞懸浮液丟棄，再加入細胞培養液至培養盒後放入 5% CO2 氣體、37℃細胞培養箱中繼續培養，即完成繼代。（二）解凍細胞準備一支 15 ml 離心管，管內加入 10 ml 的細胞培養液，從液態氮桶取出含有細胞的冷凍小管，放入操作台內，利用手心溫度讓冷凍小管中細胞液稍加溶解後加入 1 ml 細胞培養液使細胞液解凍並吸取排放至含有 10 ml 細胞培養液的離心管內，重覆上述動作直到冷凍小管內的細胞液全數吸至離心管中，再以 1000 rpm 的轉速離心 5 分鐘。離心後將上清液倒掉，將細胞刮散，加入 5 ml 含有 10% FBS 的 DMEM，全數吸至 25T 細胞培養盒中，放入 5% CO2 氣體、37℃細胞培養箱中即完成解凍細胞。待隔天細胞貼附後，更換新的細胞培養液，以培養細胞的方式進行即可。（三）冷凍細胞新解凍的細胞培養至第 3 代時，細胞狀態良好可進行冷凍保存細胞來維持足夠的細胞品質與數量。與繼代細胞相同，細胞長至八分滿時，使用 Trypsin 將細胞打下後，置於 15 ml 離心管中以轉速 1000 rpm 24.

(39) 離心 5 分鐘。培養在 75T 的細胞長至 8 分滿時，約可冷凍至 5 支冷凍小管，等待離心的時間準備細胞冷凍小管，標記細胞名稱、冷凍日期、冷凍者。離心完將上清液倒掉，以每管 900 l 細胞培養液計算培養液需取的量，與細胞均勻混合後於冷凍小管中分別加入 900 l 的細胞混合液與 100 l 的 DMSO 做為抗凍劑，防止細胞急速冷凍而造成細胞膜破裂。先置於-20℃冰箱中 30 分鐘後移至-80℃冰箱低溫保存隔夜再放入液態氮桶中保存。（四）細胞計數將細胞懸浮液放入 50 ml 的離心管中，取出 100 l 細胞懸浮液與 900 l 含有 1% FBS 的 DMEM 混合（10 倍稀釋），再取出 10 倍稀釋後的細胞液 500 l，與 500 l Trypan blue solution 等體積稀釋，混合均勻後取出 17~20 l 的細胞液加入細胞記數盤中，在 100 倍倒立顯微鏡底下觀察計數，由於 Trypan blue 染料可進入死細胞中呈藍色，計數時可確定活細胞的數目。將細胞計數盤上下分別 5 個方格之細胞數目加總後除以 2，乘上稀釋倍數（20 倍），再乘以 103，即為每毫升細胞懸浮液的細胞數目。. 25.

(40) 二、藥物配製（一）Justicidin A （JA）配製 JA 分子量為 394 g/mol 。以微量天秤（準確至 0.01 mg）約取 0.4 mg 的 JA 至 microtube 中，以 10 l 的 DMSO 溶解，再以 990 l 含有 10% FBS 的 DMEM 使總體積為 1 ml，放入-20℃保存，依實驗所需要濃度再稀釋調配。（二）Sorafenib 配製 Sorafenib 由陽明大學生藥所黃奇英教授提供，庫存液濃度為 10 mM，存放於-20℃冰箱，實驗時將庫存液以含有 10% FBS 的 DMEM 稀釋成 1 mM 再依實驗所需濃度調配。. 三、細胞存活率分析實驗溶液名稱. 藥品. 劑量. MTT. MTT powder 1X PBS Buffer. 5g 100 ml. 使用 1X PBS Buffer 稀釋成 5 mg/ml ，分裝於避光 microtube，保存於-20℃。黃色的 MTT （3-[4,5-dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromidetetrazolium）會進入活細胞粒線體中與琥珀酸去氫酶（succinate dehydrogenase）作用形成藍紫. 26.

(41) 色的 MTT-formazan，當細胞存活的越多，藍紫色的結晶會越深，因此可做為細胞存活率的指標。利用 DMSO 將 MTT-formazan 結晶溶解，以 ELISA reader 測量吸光值（波長 590 nm），再計算出細胞存活比率。將 Hep 3B 細胞以 1×103 cells/100 μl /well 的密度種於 96-well 培養盤中，待 24 小時細胞貼附後，將上清液抽掉，依實驗目的，以含有 10% FBS 的 DMEM 配製不同濃度的藥物加入培養盤中，培養至實驗目的時間點將培養液吸掉後加入 30 μl 的 MTT，置於 5% CO2、37℃ 培養箱中 4 小時後將 MTT 試劑吸掉，加入 100 μl DMSO 待 5 分鐘後以 ELISA reader 測量波長 590 nm 吸光值。數值的差異代表細胞存活及抑制生長的比率。. 四、細胞自噬比例分析實驗溶液名稱. 藥品. 劑量. AO 染劑. AO. 1.5 μg. AO 染劑可與細胞自噬產生的酸性囊狀胞器（AVOs）結合發出紅色螢光，利用流式細胞儀分析細胞自噬的比例。 Hep 3B 以 1×105 cells/2 ml /well 的密度種於 6 well 的培養盤中，以含有 1% FBS 的 DMEM 培養，待 24 小時細胞貼附後抽掉上清液加入含有 10% FBS 的 DMEM 配製不同濃度的藥物加入培養盤中，培養. 27.

(42) 至實驗目的時間點將培養液吸掉後加入 1 ml 含有 AO 染劑的培養液將細胞染色，待 15 分鐘後，將含有染劑的培養液抽起分別置入 5 ml Polystyrene Round-Bottom tube，再用 Trypsin 將細胞打下分別收集至同一支 5 ml Polystyrene Round-Bottom tube。經流式細胞儀（FACS Calibur, Becton Dickinson）讀取數值，再以 WinMDI 2.8 軟體（Windows. Multiple Document Interface Flow Cytometry Application）分析自噬比例。. 五、細胞週期比例分析實驗溶液名稱 PI 染劑. 藥品. 劑量. PI (2 μg/ml) RNase A (100 μg/ml) 1X PBS. 20 μl 5 μl 800 μl. PI 為一核酸染劑，能與細胞核內的 DNA 及 RNA 結合，為了避免 RNA 干擾 PI 對 DNA 的測定，染劑會加入 RNase A。在正常細胞中，細胞週期在 G0/G1 期染色體為 2 套（2N），G2/M 期染色體為 4 套（4N），Ｓ期則介於 G0/G1 及 G2/M 期之間。當細胞進行細胞凋亡時，細胞核內的 DNA 會片段化，染色體套數少於 2N，為 Sub-G1 期，在 G0/G1 期前有一波峰出現。利用流式細胞儀分析，觀察細胞週期變化及細胞凋亡比例。 Hep 3B 細胞以 1×105 cells/2 ml/ well 的密度種於 6 well 培養盤， 28.

(43) 以含有 1% FBS 的 DMEM 培養，待 24 小時細胞貼附後抽掉上清液，加入含有 10% FBS 的 DMEM 配製不同濃度的藥物加入培養盤中，於 5% CO2、37℃培養箱中培養，在不同時間點收取細胞。控制組的培養液吸除丟棄後以 1X PBS 輕柔沖洗，有藥物處理的組別則將培養液依組別收集到 15 ml 離心管中。培養盤中加入 500 μl 的 Trypsin 使細胞懸浮後加入等體積的 DMEM 中和反應，將細胞懸浮液依組別收集至同一離心管。細胞液以 3000 rpm 離心 5 分鐘後，倒掉上清液後加入 1 ml PBS 沖洗，再以 3000 rpm 離心 5 分鐘，離心完畢將上清液倒掉加入 1 ml 70%酒精固定細胞及增加細胞通透性，存放於 4℃冰箱隔夜。上機前將細胞以 3000 rpm 離心 5 分鐘來移除酒精，再以 1 ml PBS 沖洗打散細胞後以 3000 rpm 離心 5 分鐘，移除上清液後加入 800 μl 1X PBS 將細胞打散，在避光環境下每管樣品中加入 PI 與 RNase A 混和液靜置 30 分鐘。細胞懸浮液以 35 m 尼龍篩網過濾至 5 ml Polystyrene Round-Bottom tube 中，經流式細胞儀（FACS Calibur, Becton Dickinson）讀取數值，再以 WinMDI 2.8 軟體分析細胞凋亡比例及細胞週期。. 六、西方墨點法（一）細胞蛋白製備（whole cell lysates）. 29.

(44) 實驗溶液名稱. 藥品. 劑量. Lysis buffer. M-PER@ mammalian protein extraction reagent Phosphatase inhibitor cocktail Protein inhibitor cocktail. 250 l 1 l 1 l. Hep 3B 細胞以 1×106cells/10 ml/dish 的密度以含有 1% FBS 的 DMEM 種於 10 cm 培養盤，待 24 小時細胞貼附於培養盤後，置換為含有 10% FBS 的 DMEM 配製不同濃度藥物加入培養盤中，依實驗所需時間，將培養盤拿出置於冰上收取細胞。控制組的上清液倒掉加入適量 PBS，藥物處理組別的上清液需保留。使用細胞刮勺刮取細胞，分別收取至 50 ml 離心管中，於 4℃下以 3000 rpm 離心 10 分鐘後將上清液倒掉，加入 500 l PBS 清洗細胞 3 次，並將細胞吸取至標記好的 microtube 中，以 3000 rpm 離心 10 分鐘將上清液去除，加入 lysis buffer，依細胞盤數決定 lysis buffer 的取量。每隔 5 分鐘 vortex 一次，重複六次後在 4℃下以 12000 rpm 離心 5 分鐘，所得的上清液為 total protein，吸取上清液至標記好的 microtube 中並保存於-80 度冰箱備用。（二）蛋白質濃度測定標準品 BSA 溶液. 30.

(45) BSA 最終濃度（mg/ml） 10 mg/ml BSA 取量（l） 1X PBS 取量（l） 0 2.5 5 7.5 1 1.25. 0 3.8 7.5 11 15 19. 150 146.2 142.5 139 135 131. 5X 稀釋 Protein assay dye 配製 5X 稀釋 Protein assay dye. Bradford 染劑. 5 ml. M.Q water. 20 ml. 牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準品，濃度為 0、0.25、0.5、0.75、1、1.25 mg/ml，蛋白質樣品（total protein）置於冰上解凍後進行 10 倍稀釋（sample：1X PBS＝3 l：27 l），分別取稀釋後的樣品 10 l 與 490 l Protein assay dye 混合，在避光環境下取 100 l 加入 96 孔盤中四重覆，使用 ELISA reader 以 590 nm 波長測吸光值，以標準品所測出之吸光值製作標準曲線，計算出趨勢方程式及 r2 值（r2 值> 0.95），根據標準曲線計算出的方程式計算蛋白質樣品中蛋白質濃度。（三）聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-PAGE eletrophoresis）實驗溶液名稱 1.5 M Tris （pH 8.8）. 藥品. 劑量. Tris. 18.7 g. 加入 M.Q water 至 100 ml，pH 8.8 31.

(46) Tris 1.0 M Tris （pH 6.8）. 10% SDS 10% APS. Resolving gel (15%，10 ml). Stacking gel (5%，3 ml). 5X SDS-page running buffer. 18.7 g. 加入 M.Q water 至 100 ml，pH 6.8 SDS. 1g. M.Q water APS M.Q water M.Q water. 10 ml 0.1 g 1 ml 2.3 ml. Tris（1.5M，pH 8.8） 2.5 ml 30%acrylamide mix 10% SDS 10% APS TEMED M.Q water. 5 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.004 ml 2.1 ml. Tris（1.0 M，pH 6.8） 0.38 ml 30%acrylamide mix 10% SDS 10% APS TEMED Tris Glycine SDS. 0.5 ml 0.03 ml 0.03 ml 0.003 ml 15.1 g 72 g 5g. 加入 M.Q water 至 1L 調整 pH 8.3 使用時稀釋至 1X Tris Glycine. 30.3 g 144 g. 加入 M.Q water 至 1L 調整 pH 值至 8.3 10X transfer buffer 稀釋 1X 配方： 10X transfer buffer：100 ml 32.

(47) M.Q water：700 ml Methanol：200 ml 1M Tris Bromophenol blue SDS 100% Glycerol M.Q water 2-mercaptoethanol 6X SDS loading dye. 3.5 ml 6 mg 1.2 g 3 ml 7 ml 50 l. 前 4 項藥品與 M.Q water 混合溶解後保存於室溫，與 2-mercaptoethanol 比例為 950 l：50 l。加入 2-mercaptoethanol 後需避光並保存於 4℃。. 1X SDS loading buffer. Blocking buffer. TBST. Tris (1M) 10% SDS 10% Glycerol M.Q water Skim milk TBST Tris NaCl Tween 20. 2.5 ml 10 ml 5 ml 32.5 ml 0.5 g 10 ml 12.114 g 43.875 g 5 ml. 加入 M.Q water 至 5L，調整 pH 值至 7.4 Chemiluminescent HRP substrate（感光劑） Developer（顯影劑） Fixer（定影劑）. HRP Substrate Peroxide Solution HRP Substrate Luminol Reagent Developer M.Q water Fixer M.Q water 33. 1 ml 1 ml 50 ml 200 ml 50 ml 200 ml.

(48) 一級抗體抗體名稱. 編號. 廠商. Rabbit polyclonal anti-LC3B Rabbit monoclonal anti-APG5L/ATG5 Rabbit polyclonal anti-LAMP2a Rabbit polyclonal anti-Caspase-3 Rabbit monoclonal anti-mTOR Rabbit polyclonal anti-phospho-mTOR(Ser2481) Rabbit polyclonal anti-Akt Rabbit monoclonal anti-phospho-Akt (Ser473) Rabbit monoclonal anti-PI3 Kinase p85 Rabbit polyclonal anti-phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) Rabbit monoclonal anti-PI3 Kinase class III Rabbit monoclonal anti-Beclin-1 Rabbit monoclonal anti-MEK1/2(D1A5) Rabbit monoclonal antiphospho-MEK1/2(Ser221)(166F8) Rabbit polyclonal anti- p62 (SQSTM1). ab48394 ab109490. Abcam, Cambridge Science Park, UK. Rabbit polyclonal anti-ERK 1 (C-16) Mouse monoclonal anti-phosphor-ERK (E-4) (Tyr204) Mouse anti-pan-Ras. sc-93. ab18525 9662 2983 2971. Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA. 9272 4058 4257 4228. 3358 3495 8727 2338 PM045. sc-7383 OP22. MBL International Corporation, Woburn, MA, U.S.A Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Calbiochem® , San Diego, CA, USA. 34.

(49) Mouse monoclonal Anti-β-Actin. A3854. Sigma, St. Louis, MO, USA. 二級抗體抗體名稱. 編號. 廠商. Goat anti-rabbit (H+L) HRP conjugate Goat anti-mouse IgM+IgG+IgA (H+L) HRP conjugate. AP307P. Millipore Corp., Billerica, MA, USA. AP501P. 蛋白質樣品由回歸方程式算出濃度後，與 6X SDS loading dye 及 1X SDS loading buffer 混合，在 100℃水中加熱煮沸 10 分鐘後經離心即可加入電泳膠槽中，若非當天使用則可保存於-20℃冰箱中待隔天使用。將電泳所需之大小玻璃膠台架好，在兩片玻璃中間倒入配製好的 Resolving gel solution 至適當高度，再以 M.Q water 填滿上方空隙將膠壓平，待 Resolving gel 凝固後將 M.Q water 移除倒入 Stacking gel solution 並插入分離梳，待凝固後以保鮮膜將膠片包裹，浸泡在 M.Q water 中置於 4℃冰箱隔夜使膠片更穩定。開始操作電泳時將膠片放入電泳槽中，倒入 Running buffer 並移除分離梳，將 Protein marker 與樣品加入樣品槽中，未加入樣品的樣品槽填補與樣品相同體積之 1X SDS loading buffer，電壓為 100 V，電泳時間約 2 小時。（四）蛋白質樣品轉印（Transfer）電泳結束將膠片取出，準備 Filter paper、PVDF 膜，Filter paper 35.

(50) 以 1X transfer buffer 浸潤，PVDF 膜浸泡於 methanol，由下往上擺放順序為：filter paper、膠片、PVDF 膜、filter paper，以半乾式轉漬器進行轉印，將蛋白質由膠片（負極）轉印到 PVDF 膜（正極）上，固定電流 400 mA、轉印時間 1.5 小時。（五）抗體雜交與顯影將 PVDF 膜置於含有 5% Skim milk 的 TBST buffer 中，在室溫下進行 blocking 兩小時（或置於 4℃冰箱中隔夜）。Blocking 結束後， PVDF 膜以 TBST buffer 清洗 10 分鐘，重覆 3~5 次，加入稀釋後的一級抗體於 4℃下作用 16~20 小時再將抗體回收，以 TBST buffer 清洗 10 分鐘，重覆 3 次，再加入適當稀釋之二級抗體在室溫下作用一小時，以 TBST buffer 清洗 10 分鐘，重覆 3 次，最後將感光劑加在 PVDF 膜上，使樣品發出螢光，利用底片進行感光成像。底片掃描後以 Image J 影像軟體（USA National Institutes of Health，NIH）進行分析。. 七、免疫螢光染色法（Immunofluorescence Staining）實驗溶液名稱. 藥品. 劑量. 0.1% Triton X-100. Triton X-100 1X PBS BSA 1X PBS BSA 1X PBS hochest 33258 (5 36. 10 l 10 ml 1g 20 ml 0.1 g 10 ml 1l. 5% BSA 1% BSA hochest 33258 (5g/ml).

(51) 3.7% Paraformaldehyde 1X TBST. mg/ml) 1X PBS Paraformaldehyde 1X PBS Tris NaCl Tween 20. 1 ml 0.37 g 10 ml 1.2 g 8.8 g 0.5 ml. 加 M.Q. water 至 1 L，調整 pH 值至 7.4 一級抗體抗體名稱. 編號. 廠商. Rabbit polyclonal anti-LAMP2a. ab18525. Mouse monoclonal anti-LC3. M152-3. Abcam, Cambridge Science Park, UK MBL International Corporation, Woburn, MA, U.S.A. 二級抗體抗體名稱. 編號. 廠商. Alexa Fluor® 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L). A11004. InvitrogenTM, Carlsbad, CA, USA. A11008. 在 6-well plate 中置入約 5 片無菌圓型蓋玻片，以 UV 光照射過夜，再將 Hep 3B 細胞以 1×105 cells/2 ml/ well 的密度種於 6 well 培養盤，以含有 1% FBS 的 DMEM 培養，待 24 小時細胞貼附後抽掉上清液，於 Bafilomycin A1 （BAF）前處理的組別以 10% FBS 的 DMEM 配製 25 nM 的 BAF，前處理兩小時後將 BAF 抽掉，分別給予含有 37.

(52) 10% FBS 的 DMEM 以及 JA 處理的組別中加入 2 M 的 JA，於 5% CO2、 37℃培養箱中培養，於 48 小時後取出培養盤並將上清液抽掉，每個 well 中加入 1~2 ml 的 PBS 輕輕潤洗後抽掉。再加入 500 l 的 3.7% paraformaldehyde，此步驟是將細胞固定，靜置 10 分鐘後抽掉，以 PBS 清洗 5 分鐘，共三次。再加入 0.1% Triton X-100 500l，此步驟是將細胞打洞，放置室溫 30 分鐘後抽掉，以 PBS 清洗 5 分鐘，共三次後，將圓型玻片取出，每組保留 1~2 片，放置於貼有 parafilm 的 6 well 盤的蓋子上，標註好組別，每個玻片加入 5% BSA 50 l 放置於 37℃恆溫培養箱中 1 個小時後取出，以 TBST 清洗三次。選擇需使用的一級抗體以 1% BSA 依適當比例稀釋後，每片玻片上加入 50 l 的一級抗體，靜置放於 4℃冰箱中過夜。隔天將玻片分別夾至外用 6 well 盤中以 TBST 清洗 5 分鐘共 3 次後，將玻片夾回 6 well 盤的蓋子上，在避光環境下每個玻片加入 50 l，以 1% BSA 稀釋好的二級抗體，稀釋倍數為 1：500，以鋁箔紙將蓋子包好放置於 37℃的培養箱中一個半小時，將玻片分別夾至外用 6 well 盤中，以 TBST 清洗 5 分鐘共 3 次，將玻片夾回 6 well 盤的蓋子上，在避光環境下加入 20 g/ml Hochest 33258 染劑，每個玻片加入 50 l 的染劑，避光靜置於室溫下 30 分鐘後，再以 TBST 清洗 5 分鐘共 3 次。玻片風乾後在標註好的載玻片上滴上 3 l 的 mouting medium，將玻片斜放蓋住，進行封片。 38.

(53) 周圍用指甲油固定放入載玻片盒中以黑色塑膠袋包好，置於 4℃冰箱中進行保存。以封罩式電動共軛焦顯微鏡（Olympus FV 10i confocal microscope）觀察並擷取影像以波長 488 nm 激發綠色螢光、波長 568 nm 激發紅光。. 八、統計分析方法分析數據以 SPSS（statistical package for the social science）12.0 for Windows 套裝軟體進行變異數分析（Analysis of variance，ANOVA），計算平均值（mean）與標準誤（standard error of the mean，SEM），並以 Duncan’s new multiple range test 為事後檢定方法來比較各組別間統計差異（p＜0.05）。. 39.

(54) 第四章. 第一節. 結果. JA 能誘發 Hep 3B 細胞自噬現象. 在細胞自噬產生的過程中，溶酶體與自噬小體結合後形成一酸性囊狀胞器（AVOs），使用 AO 染劑在酸性環境下會發出紅光的特性，來判別加入藥物後細胞自噬的情形。自噬小體上的 LC3-I 蛋白與 PE 結合後形成 LC3-II，並存留在自噬小體上直到與溶酶體結合才被降解，因此其蛋白表現量的多寡能當作細胞自噬的指標，p62 則會與 LC3 蛋白結合並在細胞自噬流程後期與溶酶體結合後也一起被降解，因此被當作細胞自噬流程有走完的指標。為確認 JA 是否能誘發 Hep 3B 細胞產生細胞自噬，實驗將 Hep 3B 細胞處理 0~4 M 的 JA，作用 24、48 及 72 小時後將細胞收下，利用流式細胞儀分析 AO 染劑所染到的 AVOs 的比例。結果如（Fig. 1）所示， Hep 3B 細胞經劑量 0.5~4M 的 JA 處理，產生細胞自噬的比例與時間劑量呈正相關。從時間點來看，作用時間 24 小時、JA 4 M 的濃度下，自噬比例明顯較 0 M 濃度高（p < 0.05），作用時間 48 小時，JA 在 0.5 M 濃度下的自噬比例即較 0 M 高（p < 0.05），濃度在 0.5~4 M 之間，自噬比例有隨濃度增加而上升，至 72 小時的自噬比例同樣在 0.5 M 濃度下的自噬比例較 0 M 高（p < 0.05），濃度在 0.5~4 M 之間，自噬比例隨濃度增加而上升。而在相同 JA 劑量下， 40.

(55) 時間點 48 小時自噬的比例較 24 小時明顯增加並有顯著差異（P < 0.05），而至 72 小時細胞自噬的比例與時間點 48 小時相比則有增加的趨勢（P > 0.05）。為確認 JA 誘發細胞自噬情形，由不同時間劑量的自噬比例選出固定劑量 1 M，收取 whole cell lysates，利用西方墨點法檢測 LC3-II 與 p62 在 0 小時、24 小時、48 小時、72 小時、96 小時蛋白表現量，結果如（Fig. 2）所示，LC3-II 蛋白表現量在 1 M 的劑量下，隨作用時間增長而增加，24 小時的表現量與 0 小時相比即有顯著較多（P < 0.05），到 72 小時後其表現量與 0 及 24 小時相比明顯增加具有顯著差異（P < 0.05），p62 蛋白則是在 24 小時後增加表現，但隨時間增加到 96 小時，p62 的表現量有遞減的情形，24 小時的表現量與 96 小時相比有顯著差異（P < 0.05），LAMP2a 蛋白在 24 小時後增加表現（P < 0.05），到 96 小時與 72 小時相比有下降的趨勢。而未加 JA 的控制組培養至 96 小時的 LC3-II、p62 及 LAMP2a 蛋白表現量則無明顯變化，顯示 LC3-II、p62 及 LAMP2a 蛋白非細胞因壓力或養份不足而影響表現(White, Karp, Strohecker, Guo, & Mathew, 2010)，顯示 JA 能誘發 Hep 3B 細胞產生自噬，並且隨作用時間增加， LC3-II 表現量越多，p62 則越少。為確認細胞自噬流程是否有走完，實驗利用了細胞自噬抑制劑 Bafilomycin A1（BAF）抑制自噬小體與溶酶體結合，使用西方墨點 41.

(56) 法檢測細胞自噬相關蛋白質：LC3、p62、LAMP2a 的表現量，及利用免疫螢光染色法使用共軛焦顯微鏡觀察 LAMP2a 與 LC3 結合的情形。實驗結果（Fig. 3）發現，未加 BAF 前處理單獨以 JA 處理的組別中，LC3-II 在 JA 1、2 M 濃度下與 JA 0 M 比較有明顯增加（p < 0.05），但 JA 1 與 2 M 濃度的 LC3-II 表現相比無明顯差異（p > 0.05）; 有加 BAF 前處理的組別中，LC3-II 在 JA 1、2 M 濃度下與 JA 0 M 比較有明顯增加（p < 0.05），但 JA 1 與 2 M 濃度的 LC3-II 表現無明顯差異（p > 0.05）；相同濃度下的 JA 比較則發現，在 JA 1 M 的濃度下，有加入 BAF 前處理的組別 LC3-II 在定量數值來看有較未加入 BAF 前處理有較高的趨勢（p > 0.05），在 JA 2 M 的濃度下，有加入 BAF 前處理的組別 LC3-II 表現量較未加入 BAF 前處理高（p < 0.05）。實驗結果（Fig. 4）發現，未加 BAF 前處理單獨以 JA 處理的組別中， p62 在 JA 1 M 濃度下的表現量與 0 M 相比有明顯增加，但在 JA 2 M 的濃度下與 0 及 1 M 相比無明顯差異（p > 0.05）; 有加 BAF 前處理的組別中，p62 在 JA 2 M 濃度下的表現量與 0 M 相比有明顯增加，但在 JA 1 M 的濃度下與 0 及 2 M 相比無明顯差異（p > 0.05）；相同濃度下的 JA 比較則發現在 JA 1 M 的濃度下，有加入 BAF 前處理的組別，p62 在定量數值來看與未加入 BAF 前處理相比有較多的趨勢（p > 0.05），在 JA 2 M 的濃度下，有加入 BAF 前處理的組別 42.

(57) p62 表現量較未加入 BAF 前處理多（p < 0.05）。而溶酶體上的 LAMP2a 蛋白表現量，由（Fig. 5）觀察發現，在未加 BAF 前處理單獨以 JA 處理的組別中在濃度 0、1、2 M 之間表現量有明顯隨劑量增加而上升（p < 0.05），在加入 BAF 前處理的組別中也有相同的表現情形（p > 0.05）；在相同濃度下的 JA 比較則發現加入 BAF 前處理的組別其 LAMP2a 的表現量顯著多於未加 BAF 前處理的組別。由實驗結果（Fig. 3、4、5）發現，在有 JA 處理的組別有使用 BAF 前處理，LC3-II、 p62 與 LAMP2a 表現量較多，顯示自噬小體與溶酶體結合較少，因此這些蛋白質未被分解而有較多的蛋白量累積。免疫螢光染色的結果顯示（Fig. 6），在未加入抑制劑與 JA 的組別幾乎沒有明顯的 LC3 聚集點（puncta）出現，而有 JA 處理的組別中，則有明顯的表現；且部分 LC3 因與 LAMP2a 結合而會有黃色亮點出現，表示自噬小體與溶酶體有結合的現象，代表細胞自噬的流程有完成至自噬溶酶體階段。從（Fig. 6）可看到在 JA 處理的組別中，使用 BAF 前處理的組別，其黃色亮點的顆數較單獨使用 JA 處理的組別少（p＜0.05）。以上結果可確認，JA 不僅能誘發 Hep 3B 細胞產生細胞自噬現象，也能完成細胞自噬的流程。. 43.

(58) Fig. 1 Effect of JA on autophagy of HCC Hep 3B cells. Hep 3B cells (1 × 105 cells/well) were exposed to 4 concentrations (0.5 to 4 M) of JA for 24, 48 and 72 h. After treatment, cells were stained with AO (1.5 g/ml) for 15 min before flow cytometry. The percentages in the figure indicate the proportion of cells with AVOs staining (upper two guadrants). Data are presented as mean ± SEMs. Means without a common letter differ, p＜0.05. Results are representative of three independent experiments.. 44.

(59) Fig. 2 JA significantly induced LC3-II and LAMP2a expression, and the decrease of p62 at 96 h compared to 24 h suggested the process of autophagy flux. Hep 3B cells (1 × 106 cells/dish) were treated with or without 1 M JA for 0, 24, 48, 72 and 96 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-LC3, anti-p62 and anti-LAMP2a antibodies. -actin antibody was used as an internal control. Quantification of LC3-II, p62 and LAMP2a protein expressions from. 45.

(60) three independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.. 46.

(61) Fig. 3 BAF increased JA-induced LC3-II expression in Hep 3B cells. Hep 3B cells (1 × 106 cells/dish) were pretreated with or without 25 nM Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-LC3 antibody. -actin antibody was used as an internal control. Quantification of LC3-II protein expressions from three independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.. 47.

(62) Fig. 4 BAF increased JA-induced p62 expression in Hep 3B cells. Hep 3B cells (1 × 106 cells/dish) were pretreated with or without 25 nM BAF for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-p62 antibody. -actin antibody was used as an internal control. Quantification of p62 protein expressions from three independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.. 48.

(63) Fig. 5 BAF increased JA-induced LAMP2a expression in Hep 3B cells. Hep 3B cells (1 × 106 cells/dish) were pretreated with or without 25 nM BAF for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-LAMP2a antibody. -actin antibody was used as an internal control. Quantification of LAMP2a protein expressions from three independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.. 49.

(64) Fig. 6 BAF dcreased JA-induced colocalization of autophagosomal and lysosomal markers. 50.

(65) Hep 3B cells (1 × 105 cells/ well) were pretreated with or without 25 nM Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 2 M JA for 48 h. After fixation the cells were subjected to immunocytochemistry using anti-LC3 mouse monoclonal and anti-LAMP2a rabbit monoclonal antibodies, and subsequently anti-mouse antibody conjugated to Alexa 568 and anti-rabbit antibody conjugated to Alexa 488, respectively. Nuclei were visuliazed by incubating the cells with Hoechst 33258. Cells were observed with confocal microscopy. ※, significant differ from the group treated with JA only with or without BAF. Results are representative of three independent experiments.. 51.

(66) 第二節. 抑制細胞自噬能促進 JA 毒殺 Hep 3B 細胞及細胞凋亡，而. 抑制細胞凋亡不影響 JA 所誘發的細胞自噬細胞自噬與細胞凋亡之間有許多蛋白分子會交互影響，彼此可能會促進或抑制，在之前的研究已發現 JA 會促進細胞凋亡進行(Su, et al., 2006)。因此，為釐清 JA 所誘發的細胞自噬與細胞凋亡之間的關係，利用細胞自噬抑制劑 BAF 來抑制自噬小體與溶酶體結合，觀察細胞凋亡下游分子 caspase 3 的表現量並觀察細胞凋亡的比例是否有受影響。實驗也使用細胞凋亡抑制劑 pan-caspase 蛋白抑制劑 zVAD-fmk 抑制細胞凋亡蛋白質表現，並觀察細胞自噬相關蛋白質的表現量，以確認細胞凋亡與細胞自噬之間的相關性。實驗先以細胞毒殺能力試驗檢測有使用與未使用細胞自噬抑制劑 BAF 前處理對於 JA 毒殺細胞的能力，實驗結果發現（Fig. 7），JA 濃度在 0.5 M 的濃度下有加入抑制劑前處理的組別細胞死亡的比例明顯增加（p＜0.05），但在 JA 1 及 2 M 的濃度下，加入抑制劑前處理的組別細胞死亡的比例並無明顯增加（p＞0.05）。為確認細胞凋亡情形，利用 PI 染劑經流式細胞儀檢測細胞凋亡 Sub-G1 的比例，依前節實驗（Fig. 1）時間與劑量的自噬比例，選用細胞自噬較明顯的時間點 48 小時及劑量 JA 1 及 2 M 的濃度，如（Fig. 8）所示，單獨使用抑制劑的組別，Sub-G1 比例沒有明顯差異。加入 JA 後，Sub-G1 52.

(67) 比例隨著劑量增加而上升，並且在加入細胞自噬抑制劑 BAF 前處理的組別，其 Sub-G1 的比例較未加入 BAF 前處理的組別高（p＞0.05），顯示抑制了細胞自噬有增加細胞凋亡比例的趨勢，因此利用西方墨點法來確認細胞凋亡相關蛋白質的表現量，實驗結果發現（Fig. 9），細胞凋亡下游分子 caspase3 活化型的表現量，也是在有加入細胞自噬抑制劑前處理的組別中，表現量較多（p＜0.05），與 Sub-G1 細胞凋亡比例的結果一致，證實抑制 JA 所誘發的細胞自噬能增加細胞凋亡的比例。從前面結果（Fig. 7、8、9）得知抑制了 JA 誘發的細胞自噬後會促進細胞凋亡的進行，為檢測細胞凋亡對於細胞自噬的影響，實驗使用細胞凋亡抑制劑 zVAD-fmk 抑制 caspase 蛋白活性，利用西方墨點法檢測 caspase 3、LC3、p62 及 LAMP2a 的表現，來觀察抑制細胞凋亡後 JA 對於細胞自噬的影響。結果（Fig. 10）顯示單獨使用 50M zVAD-fmk 預處理的組別，caspase 3 沒有變化；單獨使用 1 M 及 2 M 濃度的 JA，caspase 3 表現量上升（p＜0.05）；而合併處理後，活化型 caspase 3 表現受到抑制，且有顯著差異（p＜0.05）。細胞自噬相關蛋白部分，單獨使用 50M zVAD-fmk 預處理的組別，LC3、p62 及 LAMP2a 表現量沒有變化，但加入 JA 後，有使用與未使用 zVAD-fmk 預處理的組別相比，如結果（Fig. 11、12、13）所示，並不影響 LC3、 53.

(68) p62 及 LAMP2a 的蛋白表現量（p＞0.05），顯示 JA 所誘發的細胞凋亡並不影響細胞自噬。. 54.

(69) Fig. 7 BAF increased JA-induced cell growth inhibition in Hep 3B cells. Hep 3B cells (1 × 105 cell/well) were pretreated with or without 25 nM Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 0.5, 1 M and 2 M JA for 48 h. Growth inhibition was evaluated by MTT assay. Data are presented as mean ± SEMs. Means without a common letter differ, p＜0.05. Results are representative of three independent experiments.. 55.

(70) Fig. 8 BAF increased JA-induced sub G1 percentage in Hep 3B cells. Hep 3B cells (1 × 105 cells/well) were pretreated with or without 25 nM Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h. The cells were stained with PI (40 g/ml) for 30 min before flow cytometry. The percentages in the figure indicate the proportion of apoptotic cells. Data are presented as mean ± SEMs. Means without a common letter differ, p＜0.05. Results are representative of three independent experiments. 56.

(71) Fig. 9 BAF increased JA-induced cleavage caspase 3 expression in Hep 3B cells. Hep 3B cells (1 × 106 cells/dish) were pretreated with or without 25 nM BAF for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-caspase 3 antibody. -actin antibody was used as an internal control. Quantification of cleavage-caspase 3 protein expressions from three independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.. 57.

(72) Fig. 10 zVAD-fmk decreased JA-induced cleavage caspase 3 expression in Hep 3B cells. Hep 3B cells (1 × 106 cells/dish) were pretreated with or without 50 M zVAD-fmk for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis using anti-caspase 3 antibody. -actin antibody was used as an internal control. Quantification of cleavage-caspase 3 protein expressions from three independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.. 58.