計畫性細胞死亡

第三節 計畫性細胞死亡（Programmed cell death，PCD）

計畫性細胞死亡在器官發育的過程中扮演著關鍵且重要的角色，

能控制細胞的數量，讓受損的細胞死亡，維持細胞的動態平衡。細胞 死亡可分為三種：細胞凋亡（Apoptosis，Type I）、細胞自噬（Autophagy，

Type II）、細胞壞死（Necrosis，Type III）(Lockshin & Zakeri, 2004)。

計畫性細胞死亡包括細胞凋亡及細胞自噬(Debnath, Baehrecke, &

Kroemer, 2005)，因細胞壞死會造成周邊組織產生發炎反應，所以在 癌症治療上會以導致細胞凋亡的死亡方式為目標。

一、細胞凋亡

細胞凋亡是生物體內主要的計畫性細胞死亡方式，當細胞受到無 法回復的損傷時就會進行細胞凋亡讓細胞走向死亡(Kerr, Wyllie, &

Currie, 1972)。主要特徵包括：細胞膜上的 phosphatidylserine（PS）

外翻、細胞膜皺縮（Shrinkage）、細胞核濃縮（Nuclear condensation）、

細胞膜萎縮成空泡狀（Membrane blebbing）、細胞凋亡小體（Apoptotic body）產生，最後被鄰近的巨噬細胞吞噬(Hengartner, 2000)。其訊息 傳遞路徑分為兩種：外在路徑 （Extrinsic pathway）和內在路徑

（Intrinsic pathway）（Appendix Fig. 2）。

外在路徑是藉由 death ligand 如：Fas ligand、CD95 ligand、

TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）與 death receptor，如：

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Fas、CD95、Tumor necrosis factor receptor（TNFR）結合後形成 Death complex 再與 adaptor（如：Fas-associated death domain，FADD）以及 initiator caspase（如：procaspase-8）結合形成更大的複合體，稱為 Death inducing signaling complex（DISC），誘發 caspase-8 活化後引發一連 串 pro-caspase 活化，最後活化 caspase-3 而走向細胞凋亡 (Lavrik, Golks, & Krammer, 2005; Walczak & Krammer, 2000; Zapata et al., 2001)。內在路徑則是以粒線體為主要中心，當細胞受到刺激（如：

UV 光照射、藥物刺激），粒線體外膜變得可通透時，細胞色素 c

（Cytochrome c）、Smac/DIABLO、AIF、endonuclease G 會被釋放出 來(Saelens et al., 2004)，細胞色素 c 被釋放出後與 Apaf-1 及

procaspase-9 結合，形成 apoptosome，進而活化 caspase-9 及 caspase-3，

最後導致細胞凋亡(Reed, 1997)。

其它與細胞凋亡相關的蛋白質還有 p53、NF-B、Bcl-2 家族蛋白、

MAPK 家族蛋白。Bcl-2 家族蛋白對於細胞凋亡的調控扮演重要的角 色，主要分為三類：促進細胞凋亡蛋白（如：Bax、Bak），抑制細胞 凋亡蛋白（如：Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1）及 Bcl-2 Homology (BH) domains(Adams & Cory, 2007; Youle & Strasser, 2008)。Bax 及 Bak 蛋 白主要存在於細胞質中，粒線體受到刺激後 Bax 及 Bak 蛋白會聚集 在粒線體外膜上，形成通道讓粒線體內的細胞色素 c 能穿過通道釋放

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至細胞質中(Kroemer, Galluzzi, & Brenner, 2007); Bcl-2 及 Bcl-XL則會 抑制 Bax 移到粒線體外膜上，避免形成通道因而抑制細胞色素 c 的釋 放。而只有 BH3 結構的蛋白質（如：Bid、Bad、PUMA）會增進促 凋亡蛋白質 Bax、Bak 的活性(Giam, Huang, & Bouillet, 2008)。p53 會 活化 Bcl-2 家族蛋白中的促凋亡蛋白如：Bid、PUMA，間接調控內在 路徑或是直接活化 Bax 或 Bak 讓粒線體外膜通透性增加來促進細胞 凋亡進行(Moll, Wolff, Speidel, & Deppert, 2005)。Extracellular

signal-regulated kinase（ERK）屬於 MAPK 家族蛋白，其上游蛋白還 有 Mitogen-activated protein kinase/ERK kinase（MEK）、Raf 及 Ras；

Raf/MEK/ERK 路徑會影響細胞凋亡的內在及外在路徑相關蛋白質，

對於細胞凋亡的調控有促進及抑制的功能。活化的 ERK 會降低粒線 體膜電位促進細胞色素 c 的釋放，活化 caspase 9 來促進細胞凋亡進 行並且調控 Bcl-2 家族蛋白，正調控促凋亡蛋白質：Bax、PUMA、

Bak、Bim，使促凋亡蛋白表現量增加，負調控抑凋亡蛋白質：Bcl-2 及 Bcl-XL，來促進細胞凋亡。但也會活化抑凋亡蛋白質 Mcl-1，抑制 Bax 活化與合成 homodimers，以及磷酸化 Bad S112 的位置，抑制 Bad 促凋亡功能，進而抑制細胞凋亡(Harada, Quearry, Ruiz-Vela, &

Korsmeyer, 2004; H. Li et al., 2007; J. Liu, Mao, Ding, & Liang, 2008;

Schweyer et al., 2004)。對於外在路徑則能藉由增加 death ligand 及促

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進 death receptor 與 adaptor 結合來活化 caspase-8 促進細胞凋亡進行 (Tewari, Sharma, Koul, & Sen, 2008) 。

二、細胞自噬

細胞自噬在 1963 年首先被提出，為受損細胞內藉由溶酶體

（Lysosome）降解的過程，普遍存在於真核細胞內，是一種維持細胞 動態平衡的機制，在細胞受到壓力或營養缺乏時，細胞為了自救而產 生雙層膜的自噬體 （Autophagosome）包裹受損或老化的胞器，再與 溶酶體結合，由溶酶體內的酵素分解自噬體內的物質後，釋放出胺基 酸讓細胞利用而能存活(Mizushima, Yoshimori, & Levine, 2010)。

細胞自噬的形成及降解分為五個階段：起始（Initiation）、延展

（Enlogation）、包覆（Closure）、融合（Fusion）、降解（Degradatoin）

(Huett, Goel, & Xavier, 2010)（Appendix Fig. 3）。起始的階段是由一系 列 Atg （Autophagy related gene）蛋白以及 LC3 蛋白所構成，當 Atg8/LC3-I 與 phosphatydylethanolamine （PE）結合形成 Atg8/LC3-II，

與 Atg7、Atg12-Atg5-Atg16L 蛋白質複合體及 Beclin1、class III PI3K 共同作用即可繼續延展自噬體雙層膜構造，雙層膜形成後

Atg12-Atg5-Atg16L 蛋白質複合體便脫離雙層膜，保留 LC3-II 蛋白在 膜上，雙層膜內包裹大量蛋白質及其它胞器，溶酶體靠近結合形成自 噬溶酶體（Autolysosome）並呈酸性，因此也稱為酸性囊狀胞器（Acidic

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Vesicular organelles，AVOs），內部的物質藉由酶的分解後，可再被細 胞利用，使細胞獲得養份(Baehrecke, 2005; Mizushima, Ohsumi, &

Yoshimori, 2002; Z. Xie & Klionsky, 2007)。近年來的研究也發現細胞 自噬也與 ubiquitin pathway 有交互作用，其中 p62/SQSTM1 蛋白，會 與 Atg8/LC3 蛋白結合，當細胞自噬被誘發並且細胞自噬流程進行至 後期與溶酶體結合後，p62 的含量會下降，反之若抑制了細胞自噬進 行，p62 就會累積在細胞中，此現象可利用西方墨點法來觀察藉由使 用 Bafilomycin A1（BAF）抑制溶酶體與自噬小體結合，讓 p62 無法 被降解，因此 p62 也可作為細胞自噬流程的一個指標(Komatsu et al., 2007; Larsen et al., 2010)。

細胞自噬訊息傳遞路徑主要分為兩條：（1） Class I

phosphoinositide 3-kinase（Class I PI3K）/AKT/mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway 以及（2）Class III PI3K/Beclin-1 signaling pathway(Pattingre, Espert, Biard-Piechaczyk, & Codogno, 2008)。Class I PI3K 由生長因子（Growth factor）活化後，會促進 PIP2 磷酸化成 PIP3 能誘發其下游分子 Akt 活化，最後活化 mTOR 而抑制 細胞自噬進行(Gonzalez-Polo et al., 2005)。另一條路徑 Class III PI3K 與 Beclin-1 結合形成複合體，誘發細胞自噬發生並參與了自噬小體的 形成(Itakura, Kishi, Inoue, & Mizushima, 2008)。Beclin-1 是屬於 BH3

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結構家族蛋白的一員，目前也有研究顯示 Bcl-2 及 Bcl-XL也會與 Beclin 1 交互作用來抑制細胞自噬(Maiuri, Zalckvar, Kimchi, &

Kroemer, 2007)。致癌基因 Ras 能活化 Class I PI3K 路徑來抑制細胞 自噬，但也能經由活化 Raf/MEK/ERK 路徑來誘發細胞自噬，ERK 的 活化能促使 LC3-I 轉變成 LC3-II 來幫助自噬小體的形成，也能誘發 Beclin 1 活化來促進細胞自噬進行(Y. Cheng, Qiu, Tashiro, Onodera, &

Ikejima, 2008; Pattingre, Bauvy, & Codogno, 2003)。

細胞自噬被視為一種細胞自救的行為，在正常細胞中，若處於飢 餓或代謝壓力的環境下，細胞自噬會產生來幫助細胞在惡劣環境中存 活。但持續處於惡劣環境下導致細胞自噬過度表現，則會讓細胞走向 死亡(Levine, 2007)。在細胞凋亡及細胞自噬路徑中，發現有許多共同 的上游分子；所誘發的下游蛋白中，也有許多蛋白彼此交互作用；在 不同的刺激下，兩者之間可能會互相促進或互相抑制。內質網壓力能 誘發細胞凋亡的內在路徑也會誘發細胞自噬的產生，但在某些研究中 則發現，抑制了內質網壓力所誘發的細胞自噬能促進細胞凋亡進行 (Ogata et al., 2006; Xu, Bailly-Maitre, & Reed, 2005; Yorimitsu, Nair, Yang, & Klionsky, 2006)；另外 Atg5 不只能促進細胞自噬產生，也會 與 FADD 產生交互作用，促進 caspase 相關的細胞凋亡路徑進行(Pyo et al., 2005; Yousefi et al., 2006)。

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在治療癌症方面，部分實驗發現抗癌藥物可藉由誘發細胞自噬來 抑制癌細胞生長，像是 Perhexilin、Niclosamide 會抑制 mTORC1 來促 進細胞自噬進行，(Balgi et al., 2009; Salazar et al., 2009; Turcotte et al., 2008)。然而近年研究也發現，某些癌細胞上，化學藥物治療及放射 線治療所誘發的細胞自噬會抑制細胞凋亡的進行，造成治療效果不佳 (Boya et al., 2005a)，因此細胞自噬抑制劑則需考慮使用。在乳癌細胞 株上則發現，將化療藥物 Ixabepilone 與細胞自噬抑制劑

Hydroxy-chloroquine（HCQ）合併使用治療，效果較佳。也有研究發 現將細胞自噬抑制劑 3-methyladenine（3-MA）與抗癌藥物 5-FU 合併 使用在大腸直腸癌細胞株上，可提高抗癌藥物的療效(Chen &

Karantza-Wadsworth, 2009; J. Li et al., 2009)。因此，在癌症治療上，

細胞自噬與細胞凋亡之間，釐清其互相抑制或促進的關係，越來越重 要。

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