肝細胞培養結果

4.2.1 利用不同分離步驟來採取小型肝細胞之比較

經過多天培養後，在未調整步驟前 (Chen, Q 及其團隊之採取方式) (150 g、5 分鐘、4 ^oC，取上清液) ，以相同細胞密度在 Dish 上培養 1 天後，貼附的細胞 數較少 (圖 4-2 A) ；相較我們將步驟調整後 (150 g、5 分鐘、4 ^oC，取 cell pellet) 培養一天的結果後，有貼附並有生長之細胞數較多 (圖 4-2 D) 。此外，在未調整 步驟下培養的細胞在經過 3 天的培養下，其生長型態與前人提及之形成聚落之結 構有明顯的不同 (圖 4-2 B) (Ishii et al., 2017) ，且在培養 5 天後，生長型態大多 呈現類似纖維細胞之型態 (圖 4-2 C)；另外一方面，我們將步驟進行調整後所取得 之細胞在培養 3 天時有較多貼附之型態 (圖 4-2 E) ，而在培養 6 天後細胞會形 成聚落之結構 (圖 4-2 F) ，與前人提及小型肝細胞之型態相近 (Ishii et al., 2017) ， 因此我們推測在調整採取步驟後所得之細胞可能為小型肝細胞。而這個結果亦與 細胞懸浮液組成分析的結果 (圖 4-1) 相符合。

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圖 4-2 利用不同分離步驟來採取小型肝細胞並培養於 Dish 上之比較； (A) 為 Chen, Q 及其團隊之採取方式 (150 g、5 分鐘、4 ^oC，取上清液) 下培養 1 天之 結果， (B) 為 Chen, Q 及其團隊之採取方式下培養 3 天之結果， (C) 為 Chen, Q 及其團隊之採取方式下培養 5 天之結果； (D) 為本研究將 Chen, Q 的方法進行 調整後之採取方式 (150 g、5 分鐘、4 ^oC，取 cell pellet) 下培養 1 天之結果， (E) 為調整後之採取方式下培養 3 天之結果， (F) 為調整後之採取方式下培養 6 天 之結果，以上皆使用相位差顯微鏡所觀察的結果 (Scale bar = 200 μm) 。

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4.2.2 小型肝細胞與成熟肝細胞於體外培養之型態比較

由肝細胞在 Dish 培養下使用相位差顯微鏡所觀察的結果可知，初代肝細胞於 培養 3 天後 (圖 4-3 B) ，細胞型態較為貼附並延伸，邊緣輪廓清晰且有約半數的 細胞呈現多核的情況，為較具功能之肝細胞型態 (Hou et al., 2010) 。但由於初代 肝細胞是藉肝臟切除取得，因此肝細胞在體外培養會因為 EMT 的機制而使肝細 胞逐漸失去其特徵，最後會發現肝細胞由原本具功能的間葉型態 (Mesenchymal) (圖 4-3 A, B) 轉為支持性的表皮型態 (Epithelial) (圖 4-3 C, D) (Choi and Diehl, 2009; Zeisberg et al., 2007) 。

另外一方面，小型肝細胞在培養 3 天後 (圖 4-3 E, F) ，細胞型態上也較為 貼附且呈多核之型態，但在培養 5 天後 (圖 4-3 G) ，細胞除了仍然維持具有功 能的間葉型態之外，細胞亦有群聚 (Colony) 的趨勢。而這樣的細胞聚落在相位差 顯微鏡觀察下除了發現具有平面的群聚外 (圖 4-3 H) ，隨著培養時間的增加，細 胞仍會繼續往上堆疊最後於 Colony 上形成肝細胞的三次元球 (Spheroid) ，且能 維持相同型態至少 3 週 (圖 4-4) 。而這樣的三次元球的形成亦是一般認為肝細胞 能夠維持其機能的重要證據之一。

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圖 4-3 肝細胞在 Dish 培養下使用相位差顯微鏡所觀察的結果； (A) 為培養 1 天的成熟肝細胞， (B) 為培養 3 天的成熟肝細胞， (C) 為培養 5 天的成熟肝細 胞， (D) 為培養 7 天的成熟肝細胞； (E) 為培養 1 天的小型肝細胞， (F) 為培 養 3 天的小型肝細胞， (G) 為培養 6 天的小型肝細胞， (H) 為培養 9 天的小 型肝細胞。 (Scale bar = 200 μm) 。

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圖 4-4 小型肝細胞在 Dish 長時間培養下，在相近位置 (如圖 3-2 所示) 使用相 位差顯微鏡所觀察的結果； (A) 為培養 1 天的小型肝細胞， (B) 為培養 3 天的 小型肝細胞， (C) 為培養 6 天的小型肝細胞， (D) 為培養 9 天的小型肝細胞，

(E) 為培養 12 天的小型肝細胞， (F) 為培養 15 天的小型肝細胞， (G) 為培養 18 天的小型肝細胞， (H) 為培養 21 天的小型肝細胞， (I) 為培養 24 天的小型 肝細胞。(Scale bar = 500 μm)

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