PDMS 微流道系統應用於肝細胞培養

2007 年 Philip J. Lee 的團隊利用微流道結構來模擬體內養份的供給路徑： 養 分會先經過肝竇內皮細胞屏障後，才到達成熟肝細胞的情形 (圖 2-6) 。因此其微 流道之設計初代肝細胞培養通道為 50 × 30 × 300 μm，而屏壁間寬 2 μm，其供 培養基之擴散之孔隙為 1 × 2 μm，流速為 10 nL/min，此流動擴散系統可使初代 肝細胞即便在沒有修飾膠原蛋白之流道表面下培養 7 天後仍能維持 94 ± 15 % 之生存率。其後，P. J. Lee 團隊利用此微流道系統測試雙氯芬酸 (Diclofenac，為 一發炎抑制劑) 之肝毒性，結果顯示在加入藥品並培養 4 小時後對肝細胞並沒有 顯著的肝毒性，但在藥物作用 24 小時後其 IC50 為 334 ± 41 µM。此研究成功以 微米級培養系統來模擬肝血竇之質量傳遞性質，如組織和流體的運輸區域以及連 續的營養物交換等。此外，初代大鼠和人類肝細胞在此裝置皆能維持超過 7 天之 生存率 (Lee et al., 2007) 。而這平台使用之細胞量較傳統培養皿所需的細胞量少約 100 倍，因此在相同的細胞量下，可以使用此平台做更大量之藥物測試。

圖 2-6 Microfluidic endothelial-like barrier properties (Lee et al., 2007) .

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2010 年 Chien-Yu Fu 與其團隊在微流道上以 U-Shape 之設計將肝癌細胞三 次元球 (HepG2 Spheroid) 限制在流道內進行 3D 培養 (圖 2-7) ，因細胞三次元 球能提高 cell-cell interaction ，因此其功能和結構會與真實體內組織較為相似。而 一般製作細胞三次元球方式為利用細胞懸滴法、或透過在不易讓細胞黏附的培養 皿中培養細胞，進而產生此三次元球，然而三次元球由於是懸浮在培養液中，所 以容易在培養基交換時而一併流失。此研究利用 U-Shape 之設計來改善細胞三次 元球在微流道中會隨培養液交換而離開微流道系統的劣勢，藉由 U-Shape 的形狀 來固定住培養中的三次元球，因此相較於傳統的懸滴法能作更長時間培養，此外，

細胞三次元球之尺寸亦能根據 U-Shape 之大小來微調。 U-Shape 的厚度約為 100 μm，內部空間為 250 × 200 × 700 μm， 將肝癌細胞液 (HepG2 cell suspension) 以 8.4 × 10⁶ cells/mL 之密度，2 μL/min 流速下注入此微流道系統中，

5 分鐘後將培養液注入，以洗脫未捕獲在 U-Shape 中之殘留於微流道中的 HepG2 。其系統最後流速為 2 μL/min。此研究接著利用阿黴素 (Doxorubicin，為 一種使 DNA 發生嵌入作用及為拓撲異構酶抑制劑) 來測試此平台是否可做藥物 測試平台，並由結果得知，相較 HepG2 在 2D 培養下結果 (以 3.0 μg/mL 作用 HepG2 兩天後即大多數凋亡) ，肝癌細胞三次元球在濃度 48 及 96 μg/mL 的藥 物環境下作用五天，其代謝活性仍然與藥物處理前相同，證明肝癌細胞三次元球 之耐藥物能力相較 2D 培養有所上升。這樣的結果表示 3D 培養系統在腫瘤藥物 篩選中的重要性，也證明常規藥物在此微流道系統中進行分析與探討是可行的，

並且由於此裝置能讓細胞簡易形成細胞三次元球，所以比起其他微流道的設計更 能長時間進行培養。

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圖 2-7 The flowchart of U-shaped microstructure fabrication, cell trapping and spheroid formation (Fu et al., 2010) .

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在 臺 灣 清 華 大 學 劉 承 賢 教 授 的 團 隊 以 介 電 泳 式 的 細 胞 分 離 技 術 (Dielectrophoresis Force，DEP) 應用於微流道晶片中之細胞排列，進一步模擬出肝 小葉中之細胞排列情況 (圖 2-8) 。此裝置是將 HepG2 及人類臍靜脈內皮細胞株 (Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs) 於流道中進行共培養，在晶片 製作的過程中設計兩種不同圖樣的電極，在兩種不同之細胞注入時分別施加電場，

使其能分別吸附在微流道上原先所設計之位置，最後成功透過介電泳使細胞能分 別排列成為類肝小葉中細胞之分佈。而透過介電泳的排列後，細胞仍然 95 % 的 生存率，證明介電泳分離下對其生存率無顯著影響。實驗結果亦顯示利用介電泳 來模擬肝小葉排列，和未經排列的細胞相比之下，在培養兩天之後 CYP 1A1 的活

性提高了約80 %，此結果不僅證明細胞間分泌之物質會影響其生長及活性之外，

細胞的活性與機能在不同排列方式下亦會有不同的表現。

圖 2-8 Liver-cell patterning Lab Chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue (Liu et al., 2013) .

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Ljupcho Prodanov 之哈佛團隊，成功透過雙層 PDMS 微流道系統來模仿肝臟 中不同細胞之分佈情形。於此系統下，肝細胞能夠維持 28 天的活性及機能，相 較於一般培養皿環境下培養的單層肝細胞只能維持 7 天之生長，肝細胞在此系統

培養後有顯著的活性及機能提升。此系統設計為雙層PDMS 結構，中間以聚對苯

二甲酸乙二酯 (Polyethylene terephthalate，PET) 之多孔通透膜來區隔，同時將四 種細胞共培養於微流道上： 分別為人類初代肝細胞、人類臍靜脈內皮細胞株 (EA.hy926 cell) 、人類巨噬細胞株 (U937) 及人類肝臟星狀細胞株 (LX-2 cells) 。 其注入細胞之步驟為：先注入人類初代肝細胞靜置一天使其貼附於最下層微流道 之玻璃上，再接著注入與膠原蛋白水膠混合之 LX-2 於下層微流道中，並將晶片 翻轉放置一天，以增加 LX-2 於水膠中的分佈深度。之後再注入 EA.hy926 於上 層微流道中，在晶片培養七天後注入 U937 於前述相同的上層微流道中 (圖 2-9) 。 由結果可以發現： (1) 肝細胞在體外培養可長達 28 天； (2) 在流動的系統中可 維持良好的肝臟機能 (白蛋白和尿素之分泌量) ； (3) CYP3A4 的代謝活性可以維 持。由此研究結果可以確認 Liver-on chip 在體外長期培養的可能性，也使我們可 以更進一步了解藥物在人類肝臟系統中所產生的藥物代謝反應，也為 Liver-on chip 在藥物檢測平台的應用下有著極高的發展潛能。

圖 2-9 Long-term maintenance of a microfluidic 3D human liver sinusoid (Prodanov et al., 2016) .

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