脂肪細胞生合成 Adipogenesis

脂肪組織(Adipose tissue)的形成與身體能量恆定調節相關，當能量攝取超過能 量消耗時，會使脂肪組織重量增加最後造成肥胖(Obesity)。在細胞層次上，正的能 量平衡會刺激成熟脂肪細胞(Adipocytes)，經由增加三酸甘油酯的儲存來調節過多的 能 量 ， 當 脂 肪 細 胞 達 到 一 個 臨 界 大 小 閾 值 時 ， 會 傳 送 訊 息 給 前 脂 肪 細 胞 (Preadipocytes)去刺激新的脂肪細胞產生，來儲存過多的能量。在幼年期，主要是 經由新的脂肪細胞形成或脂肪細胞增生(Hyperplasia)使脂肪組織擴大，人與囓齒類 動物在生命期中具有從前脂肪細胞形成新脂肪細胞的能力，與瘦的動物相比較下，

肥胖的動物有較多且較大的脂肪細胞。脂肪組織重量在肥胖和 Lipodystrophy 中扮 演重要角色，而肥胖又與第二型糖尿病和胰島素抗性息息相關。因此，對於了解脂 肪細胞生合成的正向與負向調節是必要的。

(一) 脂肪細胞生合成的 In vitro 模式

在研究脂肪細胞生合成的 In vitro 模式中，最常用的是分離自 Swiss 3T3 cells 的3T3 - L1 和 3T3 - F442A 齧齒類前脂肪細胞株(Preadipocyte cell lines)(93, 94)。另 外，衍生自 ob / ob mice 副睪脂肪的 ob17 cell line 也是常被使用到的(95)。在 1970 年間，Green 與其團隊發展出 3T3 - L1 system 來研究脂肪細胞生合成(94)，這些鼠 科細胞的形態與增殖類似纖維母細胞(Fibroblasts)。研究顯示，細胞在長滿之前會在 擴 大 生 長 的 階 段 ， 當 長 滿 時 接 著 給 予 Proadipogenic agents 如 胰 島 素 、 Dexamethasone 和 Phosphodiesterase inhibitor，就會停止生長然後進入分化階段。

在分化非常早期時，因為細胞外基質和Cytoskeleton proteins 使細胞從纖維狀變成 圓 形 ， 未 成 熟 的 脂 肪 細 胞 需 要 有 絲 分 裂 信 號(Mitogenic signals) 的 Clonal expansion，此作用可增加最後已分化的脂肪細胞比例，之後接著進入最後成熟階段 變成脂肪細胞。此分化作用的In vitro 模式與 In vivo 的過程極為相似，因為培養的 細胞會堆積脂質，表現出成熟脂肪細胞的特徵並且具有胰島素敏感性。相反的，因 為Catecholamine - sensitive lipolytic pathway 的調節，在能量喪失時脂肪細胞也會

水解三酸甘油酯，最後成熟的脂肪細胞具有生合成並分泌許多 Factors 的能力，其 中這些Factors 與 Endocrine control 的能量恆定有關。

在 In vivo 研究指出，注射 3T3 - L1 或 Ob17 preadipocyte cell lines 到 Nude mice 體內中，形成的脂肪組織與正常小鼠體內的脂肪組織是無法區分的(96)，此結果表 示In vitro – differentiated adipocytes 與 In vivo adipocytes 具有相似的機制來發生脂 肪細胞生合成。近來也發展出Human preadipocyte cell lines，例如有分別衍生自脂 肪肉瘤以及Simpson – Golabi - Behmel syndrome 嬰孩的 Human preadipocyte cell strains (97, 98)，還有新生兒肩胛骨棕色脂肪的 SV40 T - Ag transformation 來的 Brown preadipocyte cell line PAZ1 (99)。將重組的 Telomerase activity 結合 Human papillomavirus - E7 表現，可使 Human preadipocyte 在 Immortalization 之後保留 其分化能力(100)。

更近來，也發展出分離自年幼捐贈者脂肪組織的Multipotent adipose - derived stem (MADS) cells，這些細胞可以維持Ex vivo的特性，表示在體內有Self - renewal 的能力，因此可表現出正常的二倍體染色體(Diploid karyotype)，且保持有分化為許 多Mesenchymal cell types作用的能力(101, 102)。

In vivo 中，脂肪組織分布在許多部位，包括在生殖器周邊的、腹膜後的以及皮 下的脂肪，分離自不同部位的前脂肪細胞有不同的脂質生合成潛力，這個問題至今 仍是未知的。除此之外，不同部位的成熟脂肪細胞其代謝反應也不同，例如內臟脂 肪與皮下脂肪對腎上腺素所刺激的脂解反應就有所差異。因此，建立前脂肪細胞的 細胞株來研究脂肪細胞生合成是必要的。

(二) 脂肪組織來自 Multipotent stem cells

進來研究指出脂肪組織來自是Multipotent stem cells，根據接收不同的信號 Multipotent stem cells可分化為不同的細胞類型。在In vitro中Mouse embryonic stem (ES) cells的分化是脂肪細胞的來源之一，可用來了解早期脂肪細胞生合成以及 對調節基因和環境因子的鑑定(103)。Multipotent stem cells也存在於成熟的組織 中 ， 最 早 是 從 骨 髓 中 被 分 離 出 來 (104) 。 在 現 在 ， 脂 肪 組 織 也 可 分 離 出 Stem

cells(105)。從人脂肪組織來的Multipotent stem cells可被誘導分化成為其它細胞類 型，包括有軟骨(Cartilage)、骨頭和肌肉(106, 107)。hMADS cells也可形成脂肪細胞，

將hMADS cells培養在無血清促脂肪細胞生成的培養基下，會有脂質油滴堆積以及 脂肪細胞分化指標和轉錄因子的表現(101)，特別的是會像人的脂肪細胞一樣有 Lipolytic pathway，而能分泌出Leptin和Adiponectin。人脂肪組織中的Stroma vascular fraction可衍生出具功能的Cardiomyocyte - like cells、Endotheliallike cells 和Insulin - secreting cells (108-110)。脂肪組織衍生的細胞也能參與骨骼肌的再生以 及促進新血管形成(111, 112)，這些顯示出衍生自脂肪組織的Multipotent stem cells 可能對疾病的治療是重要的。

(三) 脂肪細胞生合成的過程

前脂肪細胞在轉變成脂肪細胞前具維持生長的能力，在脂肪細胞分化期間，脂 肪細胞的表型(Phenotype)是許多基因的表現，此反映在早期、中期和晚期 mRNA / protein markers 的表現以及三酸甘油酯堆積(113, 114)。這些變化主要是發生在轉錄 層次(Transcriptional level)上，除了基因的活化之外，這些抑制脂肪細胞生合成的或 對脂肪細胞功能不需要的基因會被抑制。

1. Growth arrest

前脂肪細胞株和初代前脂肪細胞一樣，當長滿時就會停止生長。已知的兩個轉 錄因子，CCAAT / enhancer binding protein - α (C / EBPα)和 PPARγ 是有轉錄活性 的脂肪細胞專一性基因(Transactivate adipocyte specific genes) ，C / EBPα 和 PPARγ 似乎都與停止生長有關且對於脂肪細胞分化是需要的。McKnight 和其團隊 利用C / EBPα - estrogen receptor fusion protein 使 C / EBPα 具抗有絲分裂活性 (Antimitotic activity)，在給予 Estrogen 的活化作用下，觀察細胞數目和 DNA 合成 的結果顯示出有細胞會停止生長(115)。Darlington 等人的研究中發現 C / EBPα 會 增加p21 / SDI - 1 mRNA 和蛋白質的表現，因為 Antisense p21 / SDI - 1 可削減 C / EBPα 的生長抑制作用，這表示 C / EBPα 具有增加 p21 / SDI - 1 表現的功能。

Spiegelman 和其團隊指出 PPARγ 可誘發纖維母細胞和 Adipogenic simian virus 40 large T antigen – transformed cells 停止生長，在這些表現有 PPARγ 的細胞中，因 為DP – 1 的磷酸化和 Serine / threonine phosphatase PP2A catalytic subunit 表現減 少而使細胞週期退去，並伴隨E2F / DP - 1 complex 的轉錄活性和 DNA 結合活性的 減少(116)。因此，C / EBPα 和 PPARγ 可能共同作用來使生長停止，雖然 C / EBPα 和 PPARγ 在脂肪細胞分化期間顯著地增加表現，但在前脂肪細胞中的低表現能夠 在分化之前調節使細胞停止生長。

2. Clonal expansion

當長滿時而停止生長之後，前脂肪細胞必須受到適當的 Mitigenic signals 和 Adipogenic signals 的組合來繼續之後的分化步驟。在前脂肪細胞株的研究顯示，停 止生長的細胞會進行細胞分裂發生 DNA 複製和細胞增殖，來使細胞複製放大。對 3T3 - F442A 和 Ob17 細胞而言，細胞分裂增加與晚期 mRNA markers 的表現有關，

而抑制細胞分裂會防止脂肪細胞的形成，但是Primary human preadipocytes 即使 培養在含有絲分裂抑制劑條件下，還是能正常發生分化作用(117)。這表示了對培養 的Cell line system 而言，需要依賴外來的刺激使長滿後的細胞進行有絲分裂，但對 分離自脂肪塊的前脂肪細胞，其在In vivo 就已發生了與之後脂肪細胞發展階段相關 的細胞分裂。

3. Early changes in gene expression

Lipoprotein lipase (LPL) mRNA 的表現通常作為脂肪細胞分化的早期指標，

LPL 是由成熟的脂肪細胞所分泌且在控制脂質堆積上扮演重要的角色(118)。C / EBPs 和 PPARγ 這兩個轉錄因子在脂肪細胞分化早期就被誘導，C / EBPs 和 PPARγ 的早期表現與之後參與最後分化的Adipocyte specific genes 有關(119)。PPARγ 的表 現在荷爾蒙誘導分化作用之後會快速地增加，在3T3 - L1 脂肪細胞分化的第 2 天期 間就能測得PPARγ 而且在成熟脂肪細胞中達到最大的表現。PPARδ 的誘導似乎在 PPARγ 之前，但是 PPARδ 的表現是廣泛分佈的，在各種組織中和一些培養的細胞

株中包括CH310T1 / 2、3T3 - C2 和 NIH 3T3 都能測得。C / EBPβ 和 C / EBPδ 短 暫的增加是在PPARγ 表現增加之前，C / EBPβ 和 C / EBPδ 在早期和中期分化階段 之後會減少並伴隨誘導C / EBPα mRNA 的表現，在 Adipocyte specific genes 表現 之前C / EBPα 會輕微地增加表現(120)。

在脂肪細胞分化期間，細胞從纖維狀變成圓形並且在形態上、Cytoskeletal components 和 Extracellular matrix (ECM) components 的濃度和型式有明顯的改 變。許多Cytoskeletal 和 ECM components 對脂肪細胞分化影響的研究指出脂肪細 胞轉錄因子的特徵，這些變化可能是影響脂肪細胞分化期間PPAR 或 C / EBPs 的表 現和作用。

4. Late events and terminal differentiation

在分化的最後階段，培養中的脂肪細胞主要增加 De novo lipogenesis (脂質生合 成)和對胰島素的敏感性。一些參與三酸甘油酯代謝的酵素包括有 ATP citrate lyase、Malic enzyme、Acetyl - CoA carboxylase (ACC)、Stearoyl - CoA desaturase (SCD1)、Glycerol – 3 - phosphate acyltransferase、Glycerol – 3 - phosphate

dehydrogenase (G3PDH) 、 Fatty acid synthase (FAS) 和 Glyceraldehyde – 3 - phosphate dehydrogenase，它們的活性、蛋白質和 mRNA 表現增加了 10 ~ 100 倍 (121)，Glucose transporters、Insulin receptor 的數量和胰島素敏感性也都增加。在 脂肪細胞分化期間，β1 - adrenergic receptors 的減少以及 β2 - 和 β3 - subtypes 的 增加，增加了 Total adrenergic receptor 的數量。除了與脂質代謝相關蛋白質的 mRNA 增加外，脂肪細胞也合成其它脂肪組織專一性產物，包括 Adipocyte specific fatty acid binding protein (aP2)，FAT / CD36 這個 Fatty acid transporter 以及 Perilipin 這種 Lipid droplet - associated protein。除此，脂肪細胞還生成一些 Secreted products 包括有作為 Angiogenic agent 的 Monobutyrin、屬於 Serine protease complement factor D 的 Adipsin、Acrp30 / AdipoQ、PAI - 1 和 Angiotensiongen II (122)。PPARγ 和 C / EBPα 共同活化一些基因的表現包括了 aP2、GLUT4、SCD1、

Phosphenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)和 Leptin (123)。

圖2 - 3 脂肪細胞生合成的過程 資料來源：Feve., 2005 (120)

(四) 脂肪細胞生合成的轉錄調控

已知有許多促進或抑制脂肪細胞生合成的轉錄因子會影響脂肪細胞生合成，一 些 In vitro 和 In vivo 的 研 究 顯 示 出 ， 脂 肪 細 胞 生 合 成 的 調 控 是 一 連 串 的 Transcription cascade。在脂肪細胞發展過程中，有三個主要直接影響脂肪細胞生合 成的轉錄因子，分別是PPARγ、C / EBPs 和 The basic helix – loop - helix family (ADD1 / SREBP1c)。

1. 轉錄因子

(1) PPARγ

○¹ Role of PPARγ in adipocyte differentiation

先前已知TZD是PPARγ的Ligands，而Kletzien等人發現TZD可以啟動脂肪細胞 生合成(124)。PPARγ最早是在哺乳動物中被發現(125)，但Spiegelman發現脂肪細胞 專一的PPARγ並在其團隊的研究也顯示出PPARγ主要在脂肪細胞生合成期間被誘 導，而且大量表現在脂肪組織中(126, 127)，因此Lehmann等人鑑定出TZD是PPARγ 高親和力的Ligand (21)。Tontonoz等人將纖維母細胞利用Retrovirus異位表現 PPARγ的Gain – of – function研究最先指出，PPARγ在脂肪細胞生合成中的重要角 色(128)。除此，在脂肪細胞生合成的過程中需要有PPARγ的存在，當C / EBPα在沒

先前已知TZD是PPARγ的Ligands，而Kletzien等人發現TZD可以啟動脂肪細胞 生合成(124)。PPARγ最早是在哺乳動物中被發現(125)，但Spiegelman發現脂肪細胞 專一的PPARγ並在其團隊的研究也顯示出PPARγ主要在脂肪細胞生合成期間被誘 導，而且大量表現在脂肪組織中(126, 127)，因此Lehmann等人鑑定出TZD是PPARγ 高親和力的Ligand (21)。Tontonoz等人將纖維母細胞利用Retrovirus異位表現 PPARγ的Gain – of – function研究最先指出，PPARγ在脂肪細胞生合成中的重要角 色(128)。除此，在脂肪細胞生合成的過程中需要有PPARγ的存在，當C / EBPα在沒