鋨酸染色固定

A：比對標準曲線換算的濃度 (μg / mL) V：去脂步驟所取的均質液體積

十二、 鋨酸染色固定

(一) 原理：

此測定方法為參考 Hirsch & Gallian (1968)、Etherton 等人(1977)與 Mersmann 等人(1986)(353, 354)。利用鋨酸(OSO4)能與脂肪酸形成鍵結將脂肪細胞固定並染 色，並以Urea 將固定的細胞從脂肪組織中釋放出來。

(二) 藥品配製：

1. 0.2 M Collidine

溶解後以0.9％ NaCl 定量至 1L。

2. 0.05 M Collidine - HCl buffer (pH 7.4 )

藥品 需要量 最終濃度

0.2 M Collidine 25 mL 0.05 M 0.1 N HCl 22.5 mL

混合均勻之後將pH 值調至 7.4。再以 0.9％ NaCl 定量至 100 mL。

藥品 需要量 最終濃度

Collidine ( ACROS ) (Xd = 0.91)

24.236 g (26.63 mL) 0.22 M

3. 8 M Urea

藥品 需要量 最終濃度

Urea (plusone) 480 g 8 M

溶解後以0.9％ NaCl 定量至 1 L (稍加熱來溶解)。

4. 0.01％ Triton X - 100 (in 0.9％ NaCl)

藥品 需要量 最終濃度

Triton X - 100 (MERCK) 0.1 mL 0.01％

以0.9％ NaCl 定量至 1 L。

5. 3％ Osmium Tetroxide

藥品 需要量 最終濃度

OSO4 (PGM) 0.15 g 3％

0.05 M Collidine - HCl buffer (pH 7.4 )

5 mL

因OSO4具揮發性及致癌，需戴手套於抽風櫥中配製。將一瓶OSO4取出後，先用酒 精噴一噴後擦乾淨，從頂端將瓶子折斷全部丟入加有所需量0.05 M Collidine - HCl buffer (pH 7.4 )的玻璃瓶中(例如 1 g OSO4對33 mL Buffer)，於室溫下放置 2-3 天溶 解，溶解完為黃色澄清液體，用錫箔紙將瓶身包住藏放於密封罐子中，存放於4℃。

(三) 方法：

1. Cell Fixation

取脂肪組織(＜ 200 mg)以 37℃、0.9％ NaCl 浸潤三次，將 Tissue slice 放入含 有2 mL 之 0.05 M Collidine - HCl buffer (pH 7.4 )的 Counting vial 內，移至抽風櫥 內再加入2 mL 之 3％ OSO4，蓋緊後於室溫下放置三到四天。

2. Urea - solubilzation of connective tissue

吸出 OSO4 – collidine - HCl buffer，以約 5 mL 之 0.9％ NaCl 沖洗後吸出，再 加入5 mL 之 0.9％ NaCl 於室溫下放置一天。吸出 0.9％ NaCl 後改加 10 mL 之 8 M Urea，於室溫下放置一天，期間偶爾旋轉 Vial 促使細胞從 Connective tissue 釋放出 來，可在顯微鏡下看見由OSO4染成黑色的細胞。將Urea freed particles 倒在 335 μm Nylon mesh net 上，用玻棒磨一磨使脂肪組織通過 Net 而過濾到燒杯中並以 0.9％

NaCl 沖洗 Nylon mesh net 數次，收集的濾液再用 10 μm Nylon mesh net 來抽氣過 濾並以0.01％ Triton x - 100 (in 0.9％ NaCl)沖洗數次。過濾完後，脂肪細胞會像沙 子一樣附著在10 μm Nylon mesh net 上，小心取下 10 μm Nylon mesh net，在乾淨 燒杯上方倒轉10 μm Nylon mesh net，用 0.01％ Triton x - 100 (in 0.9％ NaCl)將附 在10 μm Nylon mesh net 上的脂肪細胞沖到 Counting vial。

3. 脂肪細胞計數

吸 出 少 許 的 脂 肪 細 胞 至 載 玻 片 上 ， 蓋 上 蓋 玻 片 ， 用 螢 光 倒 立 式 顯 微 鏡

（OLYMPUS I × 71）以 10 × 10 之倍率觀察。將每個 Sample 以相機(Diagnostic)將 所得影像拍攝數張，再使用影像處理軟體(SPOT Advanced)來計算細胞大小，每個 Sample 總共至少要算到 100 個細胞以上。測量每個細胞的直徑大小並作記錄，若是 有橢圓形的細胞時，以(最長直徑 ＋ 最短直徑) / 2 做為細胞直徑大小。

十三、 口服葡萄糖耐受測試 Oral Glucose Tolerance Test (OGTT)

(一) 藥品配製：

Glucose solution

1. 3.5 M Glucose solution（用於 3 - 6 週之大鼠）

取63 g Glucose (Riedel - deHaën)以 2 次水定量至 100 mL。

2. 4.5 M Glucose solution (用於 6 - 9 週之大鼠)

取 81 g Glucose (Riedel - deHaën)以 2 次水定量至 100 mL。

Note：葡萄糖濃度可隨大鼠週數來作調整

(二) 方法：

大鼠在給予試驗飼料第 3、6、9 週時進行口服葡萄糖耐受測試，於採血前一天 6：00 pm 將大鼠禁食。採血當天先採集 0 分鐘血液，將大鼠以保定器或 45 cm × 45 cm 見方之紗布固定住，使大鼠的尾巴外露，並盡可能的使大鼠不受到驚嚇。以解 剖刀片將尾巴末端約0.1 cm 處截斷，以手指順著尾巴將血液推出，滴少量血至血糖 試紙(MediSense Optium^TM)上測定其血糖值，再收集約 0.15 mL 血液於 1.5 mL 離心 管中，並保持在冰浴上。葡萄糖的劑量為每公斤體重給予 1.5 克葡萄糖，將葡萄糖 溶液以胃管直接從大鼠口腔給予，再給予葡萄糖後第30、60、90、120 分鐘，以同 樣的方法採集血液並測定血糖值。將所收集的0 分鐘全血，以 3,000 ×g、20 分鐘、

4℃離心(himac CR21, Hitachi)，取血清至另一個 1.5 mL 離心管中，以供禁食血清 胰島素測定。