葉片氰醣苷含量分析

本研究所使用的方法為苦味酸鈉法(Picric acid method)，方法修改自 AOAC (1984)及 Bradbury 等 (1999)之方法。本分析原理是利用氰醣苷裂解後 產生氫氰酸，以苦味酸(Picric acid, C6H3N3O7)吸收氫氰酸後，形成異氰紫酸鈉 (isopurpuric acid)，顏色會由黃色變為橘色至磚紅色，變色深淺與氫氰酸含量 多寡有顯著相關，因此可利用分光光度計測定吸光值，並以標準品製作檢量 線，推估氫氰酸含量(附錄圖 8)。

a. 苦味酸鈉溶液配置：秤取 1.5g 苦味酸(Picric acid)及 2.5g 碳酸鈉(Sodium carbonate, Na2CO3)，並將兩藥品分別溶於約 30 mL 去離子水中。將碳酸鈉 水溶液緩慢加入苦味酸水溶液中。混和均勻後，以定量瓶定量至100 mL。

b. 苦味酸鈉試紙製作：將試紙(Whatman ^® NO.1)浸漬到苦味酸鈉溶液，取出 後於室溫下陰乾，即為苦味酸鈉試紙。將苦味酸鈉試紙裁成 3×3 cm 後，

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放置低溫下以備分析。分析時，將裁切後的試紙放入LC vial (Agilent Co.) 中。

c. 分析：乾燥磨粉之樣品秤取約 0.1 g；鮮葉樣品則秤取 0.05 g，並放入玻璃 離心管，加入0.3 M pH 值 3.73 醋酸緩衝溶液，每管加入 2 mL，並把裝 有試紙的LC vial 倒扣於離心管瓶口，使兩者密合。為了增加接合處的密合，

以石蠟膜(Parafilm)包裹接合處。將分析裝置置入 30℃水浴，至少反應一天 (附錄圖 9)。

d. 配置 100 mL 0.3 M 的醋酸緩衝液。首先，取 1.76 mL 冰醋酸加入定量的水 中。再加入2.56 mL 1 N 的氫氧化鈉。將溶液定量至 100 mL。

e. 製作檢量線：本實驗以氰化鉀標準品製作檢量線。精秤 0.1g 氰化鉀，以去 離子水溶解後定量至100 mL，配置成 1000 mg/L 之氰化鉀標準液。將標準 液稀釋成500、250、125、61.5、31.25、15.125 mg/L 之氰化鉀標準液，分 別取2 mL 標準液於離心管中，再加入 2 mL 緩衝液，將離心管與樣品一 同放置於 30℃水浴，利用氰離子(CN-)於 26℃即到達沸點，苦味酸鈉試紙 可與汽化的氰離子產生顏色變化。

f. 分光光度計測定：取平底試管，將反應後的試紙放入，加入 10 mL 去離子 水，靜置30 min.。以波長 510 nm 測定吸光值。

3.2.2.2.氰醣苷及其衍生物氫氰酸之分析條件 3.2.2.2.1.葉片節位與氰醣苷含量之關係

於2013 年 11 月 9 日採集位於陽明山竹子湖地區同一株墨點櫻桃枝 葉片，採集未萌發二次梢的枝梢，依葉片所屬節位分為1 至 7 節上之葉片 (由枝條頂芽開始計算)，並以 50℃熱風烘乾至恆重，將乾燥葉片磨粉，將 乾燥葉片磨粉經20 目篩，精秤 0.1±3% g。以苦味酸鈉法(見 3.2.2.1)分析其 總氫氰酸含量。

3.2.2.2.2.烘乾溫度對葉片氰醣苷含量之影響

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葉片採集自同一株墨點櫻桃植株，取植株最新生長且成熟的枝條上第 3 至 5 片葉，並將葉片以 50、60、70、80 及 90℃熱風烘乾至恆重，將乾 葉分為一半，其中一半以 105℃烘乾至恆重秤取乾重，了解不同溫度烘乾 後剩餘含水量。一半乾燥葉片磨粉後經20 目篩，精秤 0.1±3% g。以苦味 酸鈉法(見 3.2.2.1)分析其總氫氰酸含量，並於分析時，加入額外的水解酶 以確保氰醣苷能完全反應生成氫氰酸。

3.2.2.2.3.烘乾溫度對葉片氰醣苷水解酵素活性之影響

葉片狀態及採集方式如3.2.1.2 節。樣品分為鮮葉與乾葉兩部分，採集 後直接以鮮葉秤取 0.05 g；將同批葉片以 50 ℃烘乾至恆重將乾燥葉片磨 粉經20 目篩，精秤 0.1±3% g 間。兩份樣品以苦味酸鈉法分析(見 3.2.2.1)，

分析樣品中氰醣苷水解酵素活性。

3.2.2.2.4.氰醣苷水解酵素反應最適 pH 值

葉片狀態及採集方式如3.2.1.2 節。葉片以 50℃熱風烘乾至恆重，將乾 燥葉片磨粉經20 目篩，精秤精秤 0.1±3% g。並分別加入 pH 值 1.11、2.11、

3.11、3.78、4.78、5.7 及 6.8，並以苦味酸鈉法(見 3.2.2.1)分析其總氫氰酸 含量。緩衝溶液配置如下：pH 值 1.11、2.11、3.11 及 6.8，利用磷酸配置，

將0.3 mL 的磷酸加入 30 mL 的水中，利用 pH 酸鹼度計測定溶液 pH 值，

並以1 N 的氫氧化鈉 調整至目標 pH 值，後定量至 50 mL，配置成 0.3 N 的磷酸緩衝溶液；pH 值 3.78、4.78 及 5.7 利用醋酸配置，將約 0.9 mL 的 冰醋酸加入30 mL 的水中，利用 pH 酸鹼度計測定溶液 pH 值，並以 1 N 的氫氧化鈉 調整至目標 pH 值，後定量至 50 mL，配置成 0.3 N 的醋酸緩 衝溶液(王等, 1987)。

3.2.2.2.5.氰醣苷水解酵素活性測定

酵素活性以測定初始反應速率(V0)作為代表，初始反應速率以接近反 應起始點(t=0)的產物生成速率。葉片狀態及採集方式如 3.2.1.2 節。鮮葉以

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葉圓片秤取0.05 g，在反應 10、20、40、60、80、160、320、640 及 1280 min.後，以苦味酸鈉法分析(見 3.2.2.1)其總氫氰酸含量。

3.2.2.3.葉齡與葉片總氰醣苷含量之影響

目的為了解葉片年齡與氰醣苷含量之影響，以期得到適宜採集葉片之時 機。調查時間由2013 年 3 月至 2014 年 7 月，調查 2013 年萌發之一次及二次 梢，2014 年萌發之一次梢上之葉片，葉片年齡與氰醣苷之關係。葉片採自陽 明山竹子湖頂湖地區已標定之芽。 2013 年一、二次梢標定的時間點分別在 2013 年 2 月 21 日及 2013 年 9 月 6 日；2014 年一次梢標定時間，B 組為於 2 月16 日， A 組為 2 月 22 日。標定後，待芽體抽出枝條後，採集枝條中段 3 至5 節上的葉片。

將採集之葉片調查葉長寬後，以去離子水擦拭乾淨並秤取鮮重，放入烘 箱以50℃烘乾至恆重(約需兩天)，秤取乾重，以磨粉機打碎至可以通過 20 目 篩網。過篩之粉末以塑膠連接盒封裝後放置於-20℃凍箱保存，以供後續分析 工作之用。另有以鮮葉分析，則將葉片擦拭乾淨後，以打洞機打出葉圓片(0.34 cm²)，秤取定量的葉圓片進行分析。本研究之分析方法分為苦味酸鈉法(見 3.2.3.2 節)。