第一章 緒論
第四節 藥理活性試驗原理簡介
一、抗癌作用
癌症的發生，往往是由於細胞本身失去了正常調控細胞增殖的 機制，而導致細胞不斷增生，不斷的複製。因此目前抗癌的研究方向 之ㄧ，在於如何阻斷不正常的增殖作用，或將細胞導回正軌而成熟分 化，恢復原有的生理功能。
本研究之藥理實驗的模式，首先以 HL-60 cell line 之抑制細胞增 殖為主，進行抗癌活性追蹤，藉以確認活性成分為何。係利用
3-(4,5-dimethyl- thiazol-2-diphenyl)tetrazolium bromide (MTT)之氧化 還原反應，測試葡萄籽抽出物及所分離之化合物對 HL-60 cell line 增 殖的影響。另外，所得的粗抽物也進行了誘導細胞分化之實驗。
MTT assay 是一種應用於分析細胞增生(cell proliferation)和細 胞毒性(cytotoxicity)之分析方法。分析方法是利用檢測活細胞之粒腺 體內的酵素琥珀酸鹽去氫酶(succinate dehydrogenase)活性來測定細 胞的存活狀態，進而得知相對的活細胞比例。活細胞內的琥珀酸鹽 去氫酶可與MTT發生氧化還原作用，而使MTT由淡黃色還原成紫 色之formazan，其反應式如下 (20)：
N
MTT Formazan
NADH
NAD +
Proliferation（%）＝ ( Sample OD570 /Control OD570)×100%
而進行誘導細胞分化活性測試是使用硝基藍四氮唑(nitroblue tetrazolium；NBT )溶液，原理在於白血病細胞分化成熟時可恢復其吞 噬功能，而細胞內酵素活性因而大量增加並釋放出超氧化物(如：
superoxide)以防禦外來物質的侵犯。於是利用其還原能力將NBT還原 成藍黑色的 formazan 鹽類沉著於細胞內。並於顯微鏡鏡檢 200 個 左右的細胞，計算其呈藍黑色細胞相對於總數所佔百分比即為誘導分 化的比例。Differentiation (%) =
(細胞質呈紫黑色的細胞總數/全部的細胞總數) × 100 %
進行一連串抗癌活性追蹤後，所分離出的化合物，再進行其他癌 細胞株之篩檢，測試是否具有抑制細胞增殖的作用。
二、美白作用
皮膚的癌症是所有癌症中最普遍的一種，黑色素細胞瘤約佔皮膚 癌的 4%，但它卻佔皮膚癌死亡率的 79%，黑色素細胞瘤會導致黑色 素（melanin）不正常增生，若有藥物能抑制黑色素瘤細胞的增殖，
也許亦具有抑制黑色素生成的功能，而美白的關鍵在於能抑制黑色素 生成。
（1）美白機轉
決定人類的皮膚、眼睛和頭髮顏色，重要因素是黑色素，黑色素 的生合成是黑色素細胞的一種氧化反應，反應過強，可引起黑色素過 多症，如：雀斑、褐斑、老年斑甚至黑色素細胞瘤等；反應過弱或缺 乏反應，則可引發白髮症等病。要想達到美白的效果，就是抑制黑色 素的生成。
a. 黑色素細胞之基本性質
黑色素是一種廣泛存在於動植物的生化聚合物（biopolymers）
(21)，能在人體及動物內生合成，主要分布於皮膚、毛髮、眼睛、羽毛、
昆蟲外殼、黴菌、細菌等(22)。依據分類，黑色素共分成三類：異黑色 素（allomelanins）、真黑色素（eumelanin）和嗜黑色素（pheo- melanin）， 真黑色素和嗜黑色素以不同的比例組合，存在於動物中。
(23)真黑色素為棕黑色含氮色素，不溶於所有溶劑中。由酪胺 酸產生 dopa，再形成 5,6-dihydroxyindole（DHI），DHI 經氧化聚合形 成真黑色素（eumelanins）真黑色素存在的範圍包含無脊椎動物之皮、
膜與體液，到高等脊椎動物的特殊細胞與組織中。真黑色素的另外ㄧ 個特性則會與許多二價或三價的金屬離子，或一些臨床常用的陰離子 性藥物結合，如 chloropromazine、chloroquine 和 haloperidol 等。真黑 色素與 chloropromazine 具有高度親合力。
嗜黑色素為可溶於鹼的色素，顏色由黃色到淡紅色，除了含有 氮之外還有硫。由生合成中間產物 dopaquinone 與 cysteine 結合，形 成 5-S-cysteinyl dopa。Cysteinyl dopa 經氧化環化反應產生
1,4-benothiazine，只存在於一些黃橙色或淡紅色毛髮或羽毛上。
b. 黑色素生合成之機轉
圖六表示黑色素生合成途徑(24)，此色素形成的過程，有酶與氧 分子的參與。首先，酪胺酸（tyrosine）在酪胺酸酶（tyrosinase）催 化下，氧化成 dihydroxyphenylalanine，即 dopa。酪胺酸酶繼續產生催 化作用，將 dopa 轉變為 dopachrome，再形成 indoles，最後形成黑色 素。其中酪胺酸酶催化 dopa 轉為 dopachrome 為速率決定步驟，而 dopachrome 經由氧化反應轉變為黑色素。
圖六、黑色素生合成途徑
（2）自由基、美白與抗氧化(1)
生物體內存在內源性的自由基，為人體生化循環中的代謝產物，
它們的蓄積對生物體的細胞膜、核酸、膠原蛋白和生物酶等會造成多 種傷害。我們通常研究的自由基為氧自由基及其活性衍生物（Reactive oxygen species；ROS），其中最常見的有 O2
．
-、．OH、NO 和 H2O2， 具有未配對電子的物質，統稱自由基（free radical）。過多的自由基會 造成細胞內核 DNA、細胞膜的損傷，而產生各種疾病，甚至造成癌 症的發生。抗氧化劑會與氧反應，而降低自由基的生成，能達到預防 疾病產生的效果(25)。
美白，就是抑制黑色素的生成，黑色素的生合成是黑色素細胞的 一種氧化反應，抗氧化劑若能阻斷黑色素細胞氧化反應，便能達到美 白的效果。含多酚類化合物的食物，也多具有抗氧化的功能(26) (27)。
抗氧化 發炎物質
－ 1. IL-1 及 IL-6 抑制黑色素細胞形成
＋ ＋ 2. PGE2、PGF2、PGD2會刺激黑色素
細胞生成
美白 3. ＋：促進美白； －：抑制美白
＋ ＋
酪胺酸酶抑制劑 降低黑色素形成
（3）目前美白評估的試驗方法
1. 抑制黑色素含量試驗－體外培養 B16-F0黑色素瘤細胞(28)(29)
老鼠 B16-F0cell 種入培養皿中（細胞數為 1×106cells/dish），於 Dulbecco’smedified Eagle’smedium培養 1 天後，將測試樣品溶於 DMSO 後，加入培養皿中繼續培養。兩天後，將細胞取出，使用強鹼 溶出黑色素，於 405 nm 下偵測吸光值，與控制組對照。
2. 酪胺酸酶活性抑制試驗－Mason 和 Perterson 法(30)(31)
將 L-dopa、酪胺酸酶混合，於 37 ℃下培養 10 分鐘，產生
dopachrome，dopachrome 為一有色物質，於 492 nm 下可偵測。加入 測試樣品，偵測培養前後之吸光值，與控制組對照（不加測試樣品）
對照，計算出 dopachrome 生成的抑制率，此即為酪胺酸酶活性之抑 制率，以維他命 C 作為 positive control。
第二章 巨峰葡萄籽成分分離研究
第一節 巨峰葡萄籽成分之抽取與分離
將乾燥的巨峰葡萄籽（2 kg）經粉碎機粉碎後，以甲醇用冷浸 法反覆抽提數次，最後一次甲醇抽提液減壓濃縮，所得的量＜0.2 mg/
ml，然後依照 Scheme 1~ Scheme 3 流程圖所述之方法分離。共得到四 個化合物，經光譜解析及化學方法確認為：gallic acid、epi-catechin、
catechin 、dilinoleyl stearyl glyceride。
第二節 巨峰葡萄籽成分之結構鑑定
一、化合物 I—gallic acid
化合物 I 為白色針狀結晶，熔點 253 ℃。其 TLC 片經溶媒（ethyl acetate）展開後 Rf 值為 0.83，噴氯化鐵試液後，顏色呈紫黑色。噴 10% H2SO4加熱後，顏色呈紅褐色，初步推斷為多酚類的化合物。
紅外光光譜（圖八）顯示，在 3400~3200 cm-1為 OH 基的吸收，
1706 cm-1為羧基（C＝O）的吸收，1620、1543 及 1450 cm-1為 benzene ring 的吸收。
紫外光光譜（圖九）在 272 nm、245 nm 有最大吸收波長，272 nm 是 3,4,5-trihydroxybenzoic acid 的π π*吸收。
由 EIMS m/z（rel. int. %）圖譜（圖十）顯示其 m/z 170 (100)
1H-NMR 光譜（圖十一；acetone-d6）顯示δ8.20（br）為 benzene ring 上 OH 的氫訊號，δ 7.20 為 benzene ring 上氫的訊號。氫譜顯示 化合物的對稱性很高。
13C-NMR 光譜（圖十二；acetone-d6）也顯示在結構上有對稱性，
在δ166.6 為羧酸上的 C 訊號，δ144.9 (C-3,5)、137.6 (C-1)、121.0 (C-4)、109.0 (C-2,6)皆為 benzene ring 上 C 的訊號，經與標準品的光 譜比對，得知此化合物為 3,4,5-trihydroxybenzoic acid ( gallic acid )。
OH OH
COOH
O H
1 2
3 4
5 6
圖八、化合物 I 之 IR 光譜
圖九、化合物 I 之 UV 光譜
圖十、化合物 I 之 EI 質譜
圖十一、化合物 I 之質子核磁共振光譜( 200 MHz, acetone-d6)
圖十二、化合物 I 之碳十三核磁共振光譜( 200 MHz, acetone-d6)
二、化合物 II—epi-catechin
化合物 II 為白色粉末，熔點 224-226 ℃。其 TLC 片經溶媒（ethyl acetate）展開後 Rf 值為 0.71，噴氯化鐵試液後，顏色呈紫黑色。噴 10% H2SO4加熱後，顏色呈紅褐色，初步推斷為多酚類的化合物。
紅外線光譜（圖十三）顯示，在 3500~3200 cm-1為 OH 基的吸 收， 1620、1520 及 1466 cm-1為 benzene ring（C＝C）的吸收。
紫外光光譜（圖十四）在 280 nm、261 nm 有最大吸收波長，
1H-NMR 光譜（圖十六；acetone-d6）顯示δ7.8-8.5 為 5 個 OH 基上氫的訊號，7.05 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2΄)，6.82 (2H, m, H-5΄,6΄)，
6.02 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-6)，5.91 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8)，4.87 (1H, s, H-2)，3.59 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-3)，2.84 (1H, dd, J =16.6, 3.6 Hz, Heq-4)，2.77 (1H, dd, J =16.6, 3.4 Hz, Hax-4)。
13C-NMR 光譜（圖十七；acetone-d6）顯示，δ156.4-156.0
(C-5,7,8a)，144.2 (C-3΄, 4΄)，131.1 (C-1΄)，118.2 (C-6΄)，114.4 (C-5΄)，
114.1 (C-2΄)，98.7 (C-4a)，95.1 (C-6)，94.6 (C-8)，78.3 (C-2)，65.8 (C-3)，28.0 (C-4)，與標準品光譜比對，得知此化合物為 epi-catechin。
O
圖十三、化合物 II 之 IR 光譜
圖十四、化合物 II 之 UV 光譜
圖十五、化合物 II 之 EI 質譜
圖十六、化合物 II 之質子核磁共振光譜( 200 MHz, acetone-d6)
三、化合物 III—catechin
化合物 III 為白色粉末，熔點 212-214℃。其 TLC 片經溶媒（ethyl acetate）展開後 Rf 值為 0.71，噴氯化鐵試液後，顏色呈紫黑色。噴 10% H2SO4加熱後，顏色呈紅褐色，初步推斷為多酚類的化合物。
紅外線光譜（圖十八）顯示，在 3500~3200 cm-1為 OH 基的吸 收訊號， 1620 、1520 及 1466 cm-1為 benzene ring 的吸收，與 epi-catechin 相似。
紫外光光譜（圖十九）在 280 nm、263 nm 有最大吸收波長，
與 epi-catechin 相似。
由 EIMS m/z（rel. int. %）圖譜（圖二十）顯示其 m/z 290（14）
[M＋]為主要的分子離子峰，所以分子量為 290。裂解模式與 epi-catechin 相似，m/z 152 (17)與 139 (0.2) 。
1H-NMR 光譜（圖二十一；acetone-d6），顯示δ7.9-8.2 為 OH 基 上氫的訊號，δ7.05 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2΄)，6.79 (2H, m, H-5΄,6΄)，
6.02 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-6) ，5.86 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8)，4.55 (1H, d,
J = 7.5 Hz, H-2)，3.99 (1H, m, H-3)，2.90 (1H, dd, J =16.0, 5.1 Hz,
Heq-4)，2.52 (1H, dd, J =14.5, 6.8 Hz, Hax-4)。
13C-NMR 光譜（圖二十二；acetone-d6）顯示，δ156.6、156.1 、 155.8 (C-5,7,8a)，144.6 (C-3΄, 4΄)，131.0 (C-1΄)，118.9 (C-6΄)，114.5 (C-5΄)、114.1 (C-2΄)，99.5 (C-4a)，95.0 (C-6)，94.3 (C-8)，81.6 (C-2)，
67.2 (C-3)，27.7 (C-4)，與標準品光譜比對，得知此化合物為 catechin。
O
圖十八、化合物 III 之 IR 光譜
圖十九、化合物 III 之 UV 光譜
圖二十、化合物 III 之 EI 質譜
圖二十一、化合物 III 之質子核磁共振光譜( 200 MHz, acetone-d6)
圖二十二、化合物 III 之碳十三核磁共振光譜( 200 MHz, acetone-d6)
四、化合物 IV—dilinoleyl stearyl glyceride
化合物 IV 為透明液體。其 TLC 片經溶媒（n-hexane）展開後 Rf 值為 0.85，噴 10% H2SO4加熱後，顏色呈淡黃色，初步推斷為不 飽和脂肪酸。
紅外線光譜（圖二十三）顯示，在 3009 cm-1有不飽和 CH 的 伸縮振動，3000~2800 cm-1為飽和 CH2的吸收， 1744 cm-1為 ester 的 C＝O 吸收，1620 、1659 cm-1為 C＝C 的吸收，1459、1374、1165 cm-1 為-CH2、-CH3的變角振動吸收，結構上似乎沒有苯環。
紫外光光譜（圖二十四）在 210 nm 有最大吸收波長，顯示沒 有共軛系或苯環結構。
由 EIMS m/z (rel. int. %)圖譜（圖二十五）顯示其 m/z 262 (0.4) 為 linoleic acid 從 ester 斷裂產生的(RC+＝O)離子。
1H-NMR 光譜( 圖二十六；CDCl3)，顯示 δ5.37 (9H, m)為雙鍵
｜
上及 OCH2-HC-CH2O 之氫的訊號，4.29 (2H, dd, J = 11.9, 4.3 Hz, H-1, 3)，4.13 (2H, dd, J = 11.9, 5.9 Hz, H-1,3) ，2.76 (4H, t, J = 5.8 Hz,
Hz, H-8΄,14΄,8˝΄,14˝΄)，1.23 (br, -(CH2)n-) ，0.89 (9H, t, -CH3)。
13C-NMR 光譜（圖二十七；CDCl3）顯示在δ172.8 為 carboxylic ester 上(C-1΄,1˝΄)，172.6 (C-1˝)，129.5~130.0 (C-9΄,13΄,9˝΄, 13˝΄)，127.8、
127.6 (C-10΄,12΄,10˝΄,12˝΄)，68.6 (C-2)，61.9 (C-1,3)，22~33 為-CH2 -的訊號，13.9 為-CH3的訊號，經與文獻比對(32)，得知此化合物為 dilinoleyl stearyl glyceride。
1
圖二十三、化合物 VI 之 IR 光譜
圖二十五、化合物 VI 之 EI 質譜
圖二十六、化合物 IV 之質子核磁共振光譜( 200 MHz, CDCl3)
圖二十八、化合物 IV 之1H-1H COSY 核磁共振光譜( 200 MHz, CDCl3)
第三節 抽出物之抑制細胞增殖活性 Samples Concentration
（μg/ml）
Cell dead Cell dead
巨峰葡萄肉 177 51.0 ± 3.8* 2.3 ± 0.4
從表三可以得知，在這七樣初篩蔬果中，以巨峰葡萄籽的抑制細 胞增殖活性很好，對於巨峰葡萄籽誘導分化方面，從 NBT 的百分比 例值來看，在濃度 0.1μg/ml下具有不錯的分化能力。但巨峰葡萄籽的
從表三可以得知，在這七樣初篩蔬果中，以巨峰葡萄籽的抑制細 胞增殖活性很好，對於巨峰葡萄籽誘導分化方面，從 NBT 的百分比 例值來看，在濃度 0.1μg/ml下具有不錯的分化能力。但巨峰葡萄籽的