第三章 實驗部分
第二節 藥理活性試驗
（1）儀器
a. 流式細胞儀( Becton Dickinson, Flow Cytometry ) b. 垂直式無菌操作台( Laminar Flow )
c. 直立式光學顯微鏡( Olympus CH-20 ) d. 倒立式光學顯微鏡( Nikon Ellipse TE 300 ) e. 高速離心機( Hettich zentrifugen )
f. 可控溫式二氧化碳培養箱( NUAIRE, Air-Jacketed DH Autoflow Automatic CO2Incubator )
a. 控溫培養箱( TKS, Incubator LT 1600 ) b. 血球計算盤( Hemocytometer )
c. 酵素免疫分析儀 ( Anthos Labtec Instruments, 2001 )
（2）試藥
a. Catechin（Sigma Chemical Co.）
b. epi-Catechin（Sigma Chemical Co.）
c. Gallic acid（Sigma Chemical Co.）
d. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)（Sigma Chemical Co.）
e. Trypan blue solution, 0.4 % （Sigma Chemical Co.）
f. MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）（Sigma Chemical Co.）
g. RPMI 1640 culture medium（BIOWEST）
h. DMEM（Dulbecco’smedified Eagle’smedium）culture medium i. Fetal bovine serum（FBS）（Gibco laboratories）
j. Antibiotics（Penicillin, Streptomycin）（Gibco laboratories k. L-glutamine（Gibco laboratories）
l. 10×Dulbecco’sHanksbalanced saltsolution（HBSS）（Gibco laboratories）
m. Dimethyl sulfoxide（DMSO）（Merck）
n. Ascorbic acid
（3）溶液的配製
a. NBT solution：秤取 NBT 粉末 20 mg 溶於 20 ml 1×HBSS 中，
最後再加入 PMA 100 μg。
b. MTT solution：秤取 MTT 粉末溶於去離子水中使最後濃度分 別為 5 mg/ ml 與 1 mg/ ml。
MTT 濃度 用途
5 mg/ml HL-60 cell 用
1 mg/ml 貼附性細胞用
（4）細胞株
a. HL-60 cell line
Human promyelocytic leukemia cells（人類前骨髓性血癌細胞）
屬於懸浮性細胞，可用 RPMI-1640 culture medium 培養之；本 細胞株來自美國 American Type Culture Collection（Manassas, VA USA）。
b. B16-F0cell line
Mouse melanoma cell line（老鼠黑色素細胞瘤細胞）
，屬於貼
附性細胞，使用 DMEM culture medium 培養之；本細胞株來 自台灣食品工業發展研究所菌種中心。c. NCI-H226 cell line
Human lung tumor cell line（人類肺癌細胞）
，屬於貼附性細
胞，使用 DMEM culture medium 培養之；本細胞株來自美國 American Type Culture Collection（Manassas, VA USA）。d. J5 cell line
Human liver tumor cell line（人類肝癌細胞），屬於貼附性細 胞，使用 DMEM culture medium 培養之；本細胞株由本校醫 學研究所鍾景光教授提供。
e. MDA KB-231 cell line
Human mammary gland tumor cell line（人類乳癌細胞），屬於 貼附性細胞，使用 DMEM culture medium 培養之；本細胞株 來自美國 American Type Culture Collection（Manassas, VA USA）。
二、抽出物及分離所得的化合物之加藥處理
將ㄧ系列欲測的天然物抽出物及分離得的化合物以 DMSO 溶 解，檢品皆為新鮮配製。加藥時，DMSO 的濃度需控制在 0.1％以下，
以避免 DMSO 本身對於細胞的影響(33)。
三、細胞培養
冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞 造成傷害，導致細胞之死亡。細胞活化後，約需數日，或繼代ㄧ至二 代，其細胞生長或特性才會表現（如產生單株抗體或其他蛋白質）。
解凍細胞步驟：將新鮮培養基置於 37 ℃水槽中回溫，回溫後噴 以 70％酒精並擦拭容器，移入無菌操作台內。自液氮或乾冰容器中 取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由於熱脹冷縮過程，此時蓋子易鬆 掉。取出冷凍管，立即放入 37 ℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其 在 3 分鐘內全部融化，以 70％酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作 台內。取出解凍之細胞懸浮液，去除含有抗凍劑（10％ DMSO）之 上清液後，緩緩加入有培養基之培養容器內，混合均勻，放入 CO2
培養箱培養。在解凍培養後隔日更換培養基。
繼代細胞培養：先將培養瓶之培養液以無菌吸管吸出，以 PBS 清洗數次，再加入 0.25％ Tyrpsin/EDTA，置入 37 ℃培養箱約兩分鐘，
再左右輕拍培養瓶，讓細胞脫落，然後使用 pipet 均勻沖散細胞，移 至無菌離心管，以 1200 r.p.m (Hettich zentrifugen)離心五分鐘，去除 上清液，加入生長培養液後打散細胞，計算細胞數目。依實驗需要分 配細胞至其他培養瓶中。
（1）血癌細胞( HL-60 )之培養
HL-60 cell（血癌細胞）培養在溫度 37 ℃、溼度 95%、5% CO2
之無菌培養箱中。含有 10% 胎牛血清（fetal bovine serum；FBS）、
1% L-glutamine、100 unit/ml pennicillin 及 100 μl/mlstreptomycin的培 養基（RPMI-1640 medium）培養之。
培養期間及實驗前，不定期以色素錐藍（trypan blue）染色，於 顯微鏡下觀察並使用血球計數盤計數之，以確定細胞的存活率大約 95%以上，並將細胞濃度維持在 2-5 × 105（cells/25T flask）。在進行 每次實驗之前，細胞至少先培養 2~8 天，以維持細胞生長穩定度。(34)
（2）貼附性細胞的培養
本實驗所使用之貼附性細胞株有 B16-F0cell、NCI-H226 cell、J5 cell、MDA KB-231 cell。這些貼附性細胞分別培養於含有 10%
胎牛血清、1% L-glutamine、100 unit/ml pennicillin 及 100 μl/ml streptomycin 的培養基（DMEM 或 RPMI medium）中。
當細胞長滿培養皿之後，用胰蛋白酶（0.25％ Trypsin/
EDTA）使貼附的細胞脫離培養皿表層，呈現懸浮狀。離心之後，取 定量細胞再繼代培養之，約 24 小時後細胞貼附完全，才具有生理活 性。
（3）貼附性細胞株之生長曲線圖
貼附性細胞打散之後，將細胞密度分別稀釋成 1.6×105、 0.8×105、0.4×105、0.2×105、0.1×105、0.05×105、2.5×103、1.25×103、 0.625×103、0.3125×103cells/well，接著將 cells 分別種入 96 well 的培 養盤中，培養 72 小時後，取出 96 well 用 PBS 清洗ㄧ次，再加入 50 μl MTT solution（1 mg/ml），於 37 ℃培養箱中反應 2 小時，最後用 DMSO
（150 μl/well）溶解細胞中之紫黑色顆粒，以 ELISA reader 於波長 570 nm 的條件下測得 OD570值，由於細胞在一定的數量中，MTT 的吸光 值與細胞量呈正比，但超過一定的數量，細胞生長曲線趨於平緩，此 時 MTT 的吸光值與細胞量不成正比，因此針對不同細胞株做其生長 曲線測定，取線性範圍內之最大的細胞數。其目的在決定出最適合種 入之細胞數，結果如圖二十四所示。
B16-F0cell 選擇種入的細胞數為 0.1×105cells/well； J5 cell 選擇種入的細胞數為 0.1×105 cells/well； MDA KB-231 cell 選擇種入 的細胞數為 0.4×105cells/well； NCI-H226 cell 選擇種入的細胞數為 0.2×105cells/well。
0
cell number
O.D.值
NCI-H226 cell
圖二十四、
B16-F0cell、H226 cell、J5 cell、MDA-KB 231 cell 之生長曲線圖
B16-F0 cell
0
cell number
O.D.值
J5 cell
0
cell number
O.D.值
MDA KB-231 cell
0
cell number
O.D.值
四、細胞增殖抑制實驗 ( MTT Proliferation Assay )(35) (36)
（1）懸浮性細胞：將 HL-60 cells 培養於 24 wells 培養皿中，每 well 的細胞數為 2×104cells/well，體積為 1 ml，培養液為 RPMI medium。每 well 中並加入各種檢品，置於溫度 37 ℃、溼度 95%、5%
CO2的培養箱中培養 72 小時後，分別取出做 MTT proliferation assay 實驗。首先自每 well 取出已去除培養基之 50 μl細胞液置入 96 well plate 中，加入 10 μlMTT solution 於 37 ℃培養箱中放置 4 小時，接 著用 DMSO ( 150 μl/well)溶解細胞中之紫黑色顆粒，最後以 ELISA reader 於波長 570 nm 的條件下測得 OD570值。
（2）貼附性細胞：將各細胞株培養於 96 wells 培養皿中，每 well 的細胞數按各細胞株的生長曲線而定，體積為 100 μl，培養液為 DMEM。培養 24 小時，待細胞貼附好以後，於每 well 中加入各種檢 品，置於溫度 37 ℃、溼度 95%、5% CO2的培養箱中培養。48 小時 後，分別取出做 MTT proliferation assay 實驗。首先自每 well 去除培 養基，用 PBS 洗一次，加入 50 μlMTT solution（1 mg/ml）， 於 37 ℃ 培養箱中放置 2 小時，接著用 DMSO（150 μl/well）溶解細胞中之紫 黑色顆粒，最後以 ELISA reader 於波長 570 nm 的條件下測得 OD570
五、誘導細胞分化實驗 ( NBT Reduction Assay )(37) (38) (39)
HL-60 cells ( 2×104cells/well )培養於24 well 之培養皿，使最後體 積為1 ml/well；並分別加入各種檢品於37 ℃、溼度95%、5% CO2 之 培養箱中，培養固定時間之後，分別取出做NBT reduction asaay 實驗。
首先將每well中取出850 μl細胞液離心(1200 r.p.m., 5 mins;
Hettich zentrifugen)後去除上清液；再用 400 μlHBSS洗之，接著再次 離心(1200 r.p.m., 5 mins; Hettich zentrifugen)去除上清液。然後加入50 μlNBT solution，於溫度37 ℃的培養箱中培養30分鐘；取出後至於冰 上，在顯微鏡下以細胞計數盤計數其分化細胞比率。
Differentiation (%) =
( 細胞質呈紫黑色的細胞總數/全部的細胞總數 ) × 100 %
六、美白試驗
酪胺酸酶活性測試(Tyrosinase Activity Test )
(1) 酪胺酸酶濃度選擇
酪胺酸與酪胺酸酶反應生成 dopachrome，在 492 nm 下有吸光。
1000、2000、3000、4000、5000 U/ml 五種不同濃度之酪胺酸酶，於 實驗條件下，37 ℃中反應，測得反應 60 分鐘之吸光值變化。如圖二 十五所示，此五種濃度於反應 25 分鐘後皆可達飽和。由於 2000、
3000、4000、5000 U/ml 之酪胺酸酶濃度曲線相近，因此選擇最小的 酵素濃度（2000 U/ml），應用於酪胺酸酶活性抑制實驗。
37度時間-吸光值之酵素動力學關係圖
(2) 化合物對酪胺酸酶活性抑制的測定
在 96 well 中，每 well 加入濃度 10 mM 的 L-dopa 10 μl、70 μl PBS、10 μl不同濃度化合物（1000, 100, 10 μM），振搖混合，最後加 入 10 μl之 20 U 的酪胺酸酶，放入 37 ℃下反應 10 分鐘，於波長 492 nm 的條件下測其吸光值得變化量，總測 30 分鐘，與控制組對照（不 加測試樣品）對照，計算出 dopachrome 生成的抑制率，此即為酪胺 酸酶活性之抑制率，以維他命 C 作為 positive control。
(3) 計算
利用下列公式計算酪胺酸酶活性的抑制率：
Inh (%) = [1 － ( A/B ) ] × 100%
A：加入測試樣品所偵測的吸光値 B：不加測試樣品所偵測的吸光値