標的化合物 ITP 之預估與細胞致毒活性相對應性
第二節 藥理活性試驗結果
壹、細胞致毒活性
（一）人類腫瘤細胞株之複製抑制活性(HTCL replication, human tumor cell lines replication)
著者將標的化合物（54, 56-59）及其酯類中間體（38, 40-43）在體外以 人類腫瘤細胞株（human tumor cell lines, HTCL）測試其對 cancer cell lines U87-MG (brain cancer cell)、A549 (lung cancer cell)、HT-29 (colon cancer cell) 的 replication 抑制活性，結果如 Table 9 所示，所有的酯類中間體都不具活性。
至於標的化合物中 2-phenyl group 之 m-位為 OCH3（59）時亦不呈現活性，
只有 F 及 Cl 取代者（57、58）呈現明顯活性；其中以 F 取代者（57）之活性 最強。進而廣泛篩選對其他細胞株之抑制性，結果如 Table 10 所示，對 MCF7 (breast adenocarcinoma；乳癌細胞)、CAKI (kidney carcinoma；腎癌細胞)、
HOS (bone osteosarcoma；骨癌細胞)、KB (nasopharyngeal carcinoma；鼻咽癌 細胞)、KB-VIN（對 vincristine 產生抗藥性之鼻咽癌細胞）、SK-MEL-2 (skin malignant melanoma；惡性黑色素瘤 )、HCT-8 ( ileocecal adenocarcinoma；迴 盲腸癌細胞)、PC-3 (prostate adenocarcinoma；前列腺癌細胞) 及 IA9（ovarian cancer；卵巢癌細胞）等細胞株都具有強力的抑制活性，其中最值得一提的 是不僅對 epidermoid carcinoma of nasopharynx（KB）細胞株具有明顯抑制活 性，同時對 vincristine-resistant 之 KB 細胞株也維持相同的活性強度。另外對 富含 glycoprotein 之 human ovarian cancer cell (IA9)具極強的抑制活性，IC50
達到 0.03?µM，也就是對容易產生抗藥性的卵巢癌細胞也可能有很強的抑制活 性。
另外由化學性質及結構的觀點來分析上述的生物活性，我們將結構上同為 -COOH 的化合物 58、59 及 57 與過去本實驗發現抗微管蛋白聚合活性相當優越 的化合物 A (ITP IC50 = 0.57?µM)比較各化合物之間的 log P 值(如 Table 11 所示)，
發現 log P 的大小與活性的差異相關性並不大。另一方面由化學立體結構上觀 察，我們發現若將 quinolone 的 A、B 環固定，三個化合物重疊後所得的結果如 Fig. 19 所示，三個化合物之第二位的苯環（C 環）彼此間與 quinolone 環相接的 角度並不完全相同。再者我們將化合物 57、59 及 58 與抑制癌細胞活性頗強的化 合物 A 做立體結構的重疊，結果發現與化合物 57 與化合物 A 除 A、B 環外，兩
者之 C 環重疊度相當好，如 Fig. 20 所示，而化合物 58、59 的 C 環與化合物 A 的重疊度皆不如化合物 57 (Fig. 21, Fig. 22)。因此化合物 57、58 及 59 三者結構 相當，活性差異卻大，故推測 C 環與 quinolone A、B 環相接的角度可能是影響 化合物與受器結合時的重要關鍵。
Table 9. Activity of 3',6-disubstituted-2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid derivatives against HTCL replication
N R1
O
R2 H
R3
Compound R1 R2 R3 U87-MG a A549b HT-29c 38 Cl F COOC2H5 NA >20 ND 40 Cl OCH3 COOC2H5 >20 >20 ND
41 OCH3 F COOC2H5 NA NA ND
42 OCH3 Cl COOC2H5 >20 >20 ND 43 OCH3 OCH3 COOC2H5 >20 >20 ND
54 Cl F COOH 2.0 <2 ND
56 Cl OCH3 COOH >20 >20 ND 57d OCH3 F COOH 1.50 0.19 ND
58 OCH3 Cl COOH - 26 5.7
59 OCH3 OCH3 COOH >20 >20 ND
aU87-MG: brain cancer cell; b A549: lung cancer cell; c HT-29: colon cancer cell; d試驗細胞株的抑制活性，在此 HTCL replication 實驗進行中發現化合物 57 在溶解時有一半的量無法溶於 culture medium，但對所選擇的腫瘤細胞株卻依然 有相當強之抑制活性。
57
Table 10. Activity of compound 57 against HTCL replication
N
MCF7 (breast adenocarcinoma) 0.14 CAKI (kidney carcinoma) 39.0 HOS (bone osteosarcoma) 0.14 KB-VIN (KB resistant to vincristine) 0.13 KB (nasopharyngeal carcinoma) 0.13 SK-MEL-2 (skin malignant melanoma) 0.16 HCT-8 (ileocecal adenocarcinoma) 0.14 IA9 (ovarian cancer) 0.03 PC-3 (prostate adenocarcinoma) 0.21
Table 11.化合物 34 –44、50 –60 的 log P 計算值 Compound Calculated
log P a
Compound Calculated log P a
a Calculated log P by I-Lab Service: ACD/Log P v6. Experimental data not available
N O
H
F O
O
A
N O
H
COOH
F H3CO
N O
H
COOH
Cl H3CO
N O
H
COOH
OCH3 H3CO
57
58 59
Fig. 18 化合物 57、58 及 59 的平面化學結構
59
（二）、利用人類癌細胞（human cancer cell line panel）評估化合物 57 之抗癌活 性
由上述細胞致毒活性初步篩選結果得知，化合物 57 具有相當優越的活性，
於是進而委託日本癌研究會癌化學療法中心，以 human cancer cell line panel
（HCCP）之篩選方法作進一步的探討。
遂將其結果敘述如下：
HCCP 所使用之癌細胞共有 39 種，包括乳癌（breast cancer）5 種、中樞神 經系統癌（CNS cancer）6 種、大腸癌（colon cancer）6 種、肺癌（lung cancer）
7 種、黑色素瘤（melanoma）1 種、卵巢癌（ovarian cancer）5 種、腎臟癌（renal cancer）2 種、胃癌（stomach cancer）6 種、前列腺癌（prostate cancer）2 種。將 39 種癌細胞混入 96 wells plate 中，翌日以 10-4~10-8 M 五種不同劑量之化合物 57 溶液加入，並培養 48 小時後，用 sulfo rhodamine 染色，以比色法定量。將結果 輸入電腦處理後，作成劑量－反應曲線圖（dose-response curves），如 Fig. 23 所 示。由這些曲線中得知 GI50 (50 % growth inhibition)、TGI (total growth inhibition) 及 LC50 (50 % lethal concentration)等數據，然後將這些數據作成 mean graphs（Fig.
24-A, Fig. 24-B, Fig. 24-C）。Mean graph 是以化合物對 39 種細胞株抑制濃度(log GI50、log TGI 或 log LC50)之平均值為中心，也就是 MG-MID（mean graph midpoint）；若對某一細胞株抑制活性較好時，所需的抑制濃度較低，柱狀圖會在 右邊依數值大小凸起不同的高度，反之若對某一細胞株活性較差的柱狀圖會依數 值大小往左邊凸起不同的高度，每個化合物所構成的 mean graph 其整體圖形都 是相當獨特的，因此亦可將之稱為該化合物的 finger print。
從 Fig. 24-A 得知化合物 57 對大部分之 cancer cell lines 都具有相當強的抑制活性，
log GI50之 MG-MID（mean graph midpoint）為-6.22 M，化合物 57 對 HGC2998 之 cell line 之抑制活性最強，log GI50為-6.86 M；其次為OVCAR-4 之 ovarian cancer cell line，log GI50
為-6.76 M。再以 log TGI 的尺度來衡量，如 Fig. 24-B 所示，化合物 57 之 MG-MID 為 -4.61 M，對 breast cancer 之 BSY-1、CNS cancer 之 SF-539、colon cancer 之 HGC2998、
lung cancer 之 NCI-H552、Ovarian cancer 之 OVCAR-4 及 SK-OV-3、renal cancer 之 RXF-631L 以及 prostate cancer 之 DU-145 等癌細胞株都呈現很強之抑制活性。若以 log LC50之尺度加以衡量，則如 Fig. 24-C 所示，MG-MID 為-4.05 M，而出現一個特殊現象
就是對 OVCAR-4 具有非常高的選擇性抑制活性，其 log LC50為-6.02 M，與 MG-MID 相差 100 倍，頗具開發價值。因為一般而言，癌細胞之間的差異小於癌細胞與正常細 胞，所以對某種癌細胞具有選擇性的化合物往往對正常細胞之傷害較少，可能是副作 用較少之抗癌物質。
因為作用機轉相同的藥物都擁有相似之 finger print，在本測試模式中，將具 有 DNA intercalation、tubulin inhibition、topoisomerase inhibition 等各種不同作用 機轉的抗癌作用之 finger print 輸入電腦中以 COMPARE program 進行比對。
如 Fig. 25 所示，將化合物 57 之 finger print 輸入 database 中，經與已知抗癌 藥物之 finger print 進行比對後，結果發現與三種 antimitotic agents 有類似性。與 navelbine 有些類似（r = 0.512），其次為 vindesine（r = 0.461）及 taxol（r = 0.452）。
綜合以上篩選結果得知，化合物 57 在很低的濃度下就具有 significant differential growth inhibition。因為經 COMPARE program 比較結果發現化合物 57 與 navelbine 等 antimitotic agent 相比，接近 COMPARE negative（r≦0.5）。因此 著者推測其作用機轉與 navelbine 有些類似但不盡相同，是屬於作用機轉新穎的 抗癌物質，值得深入探討。
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Database