一、3',6-Substituted 2-Phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid衍生物之合成及其抗癌、抗血小板、抗過敏與抗發炎活性二、生薑成分Gingerdione及Ferulamide衍生物之抗癌活性與抗幽門桿菌活性; Part I . Synthesis and Activities of Anticancer, Anti-platelet, Anti-allergy and Anti-inflammatory of 3',6-Substitu

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(1)PART I 3',6-Substituted 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid 衍生物之合成及其抗癌、抗血小板凝集、抗發炎與抗過敏活性. 1.

(2) 第一章緒論本研究之標的化合物為 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid 類緣化合物，評估之生理活性為微管蛋白聚合抑制、細胞致毒活性（抑制腫瘤細胞增殖）、細胞週期、抗血小板凝集、抗腫瘤壞死因子、抗發炎、抗過敏等，故著者在此先將 2-phenyl-4-quinolone 類緣化合物相關之研究概況及試驗活性標的物之生理功能加以敘述，作為本論文之研究背景。. 第一節 2-Phenyl-4-quinolone 類化合物之研究概況壹、天然植物中 2-phenyl-4-quinolone 類生物鹼成分的研究. 自然界中 2-phenyl-4-quinolone 類生物鹼植物成分主要存在於芸香科(Rutaceae)的植物，最早在 1891 年 Beckurts 等學者從芸香科之芸香屬植物中單離出 graveoline1 (Fig. 1)。 1943 年 Steldt 等學者由 Lunasia quercifolia 的樹皮單離出 lunamarine 的植物成分 2 ， 1959 年 Sidney Goodwin 等學者也由菲律賓產的 Lunasia amara 葉子中分離到此化合物 3 (Fig. 1)。爾後陸續有多位植物化學家又從芸香科等各屬植物中的葉子、樹皮單離出 2-phenyl-4-quinolone 類生物鹼，目前已發現之各成分之名稱、基原及化學結構歸納於 Table 14 。. O. N CH3. O. O. H3CO. N CH3. O. Graveoline. Lunamarine. Fig. 1. Graveoline 及 lunamarine 的結構. 2. O. O. ..

(3) Table 1. 由芸香科植物單離的 2-phenyl-4-quinolone 類生物鹼 4 O 5. 4 3. 6. 2. 7. 1. 8. 2' 1'. N CH 3. 3' 4'. 6' 5'. Alkaloid Name. Origin of Plants. Positions of Substituents 4a. Methyl-2-phenyl-4- Balfourodendron riedelianum quinolone. 3. 5. 6. 7. 8. 3'. 4'. 5'. H. H. H. H. H. H. H. H. H. H. H. OCH3. H. H. H. H. H. H. OCH3. H. H. H. H. H. OCH3. H. OCH3. H. H. H. H. H. H. OH. H. H. H. H. H. H. H. H. H. H. H. O-CH2 -O. H. OH. H. H. H. H. O-CH2 -O. H. H. H. H. OCH3. H. O-CH2 -O. H. OCH3. H. H. O-CH2 -O. H. 4b. Haplophyllum foliosum. Flinderssia fournieri (bark) 4c Casimiroa edulis (leaves & twigs) 4d Casimiroa edulis (bark) 4e. Edulein. Casimiroa edulis (leaves & twigs). 4d. Lunasia quercifolia (bark) 4 f Casimiroa edulis4g. Edulin. Skimmia japonica (thumb) Japonine. 4h. Orixa japonica (leaves) 4i Orixa japonica (thumb) 4j, 5. 5-Hydroxy -1-. Lunasia quercifolia 4k 6. methyl-2-phenyl-4- Casimiroa edulis quinolone. Skimmia japonica7. Graveoline. Ruta graveolens4l 6, 7. Ruta chalepensis. Ruta angustifolia 8 3-Hydroxy -. Ruta graveolens4m. graveoline Lunamarine Lunasia Base-1. Lunasia amara (leaves)2. H. H. Reevesianine-A. Skimmia reevesiana (stem bark). 4n. H. H. H. H. H. H. OH. H. Reevesianine-B. Skimmia reevesiana (stem bark) 4n. H. H. OCH3. H. H. H. H. H. H. H. H. H. H. OCH3. OH. H. H. H. OCH3. H. H. H. OH. H. H. H. H. H. H. OCH3. O-CH2 -O. H. H. H. H. OCH3. OCH3. O-CH2 -O. Folimidine 2-(4’-Hydroxy -6-. Lunasia amara. 2, 9. 4b. Haplophyllum foliosum 4n. Skimmia reevesiana. methoxyphenyl)-1methyl-4-quinolone 2-(3' -Methoxy -4',5'- Esenbeckia almawillia10 methylenedioxyphe nyl)-1-methyl-4quinolone 8-Methoxy -2-(3'-. Esenbeckia almawillia10. methoxy -4',5'-meth ylenedioxyphenyl)1-methyl-4-quinolo ne. 貳、天然 2-phenyl-4-quinolone 類生物鹼之生物活性 3.

(4) 將有關 2-phenyl-4-quinolone 類生物鹼之生物活性列舉如下：（一）昆蟲抑食活性(feeding inhibitory) 11 以 Orixa japonica thumb 分離出的 japonine，化學結構為 3,6-dimethoxy-1-methyl2-phenyl-4-quinolone，在測試 larvae Spodoptera litura 昆蟲(polyphagoeus pest insect)的抑食活性（feeding inhibitory），japonine 呈現中等抑制強度，其 threshold 濃度為 300 ppm。 O H3 CO. OCH 3. N CH3. Japonine. （二）腫瘤化學防禦活性(cancer chemopreventive activity)；突變抑制活性(antimutagenic activity) 6 從 Casimiroa edulis 的種子所單離之 5-hydroxy-1-methy-2-phenyl-4-quinolone 在 S. typhimurium strain TM677 以 7, 12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)誘發的突變抑制及從 Aroclor 1254 前處理之肝臟中取得的微小體來測試 ethoxyresorufin O-deethylase (EROD)的活性實驗中，皆呈現明顯之活性，IC 50 分別為 10.5 µg/mL 及 16.3 µg/mL 。但是以 mouse mammary organ culture (MMOC)來試驗由 DMBA 所誘發的腫瘤生成前的損害(preneoplastic lesions)試驗中卻幾無活性，於 10 µ g/mL 的濃度只達抑制 36%（抑制活性必須 > 60 %才有意義）。. 參、合成 2-phenyl-4-quinolone 類化合物之生物活性（一）抗癌活性本實驗室對於 2-phenyl-4-quinolone 類緣化合物之抗微管聚合(inhibition of tubulin polymerization ; ITP)之研究已有多年，取代官能基的變化亦相當多，茲於此僅將 2-phenyl-4-quinolone 類緣化合物 (PQ, DHPQ, PN) 在微管聚合抑制之構效關係分別敘述如下：. 4.

(5) O 5. O 4. 6 R. R6. 3. A. B. 8. N1. 7. R1. O 5 6. 2'. 2. 3'. C 6'. R. 2' R7. 3'. N. R' 4'. R' 4'. H. N. 3'. N1 R1. 5'. 2-phenyl-4-quinolones (PQ). 2' 7. R' 4'. 6' 5'. 2,3-dihydro-2-phenyl-4-quinolones (DHPQ). 2-phenyl-1,8-naphthyridine-4-ones (PN). Fig. 2. 2-Phenyl-4-quinolones (PQ)、2,3-dihydro-2-phenyl-4-quinolones (DHPQ)及 2-phenyl1,8-naphthyridin-4-ones (PN)的化學結構. (A) 2-Phenyl-4-quinolone 類衍生物(PQ, DHPQ) 12-15 之結構與抑制微管蛋白聚合活性的關係近年來本實驗室設計並合成一系列 2-phenyl-4-quinolones 類緣化合物(Fig. 2)，以作為新穎之抗有絲分裂劑，這系列化合物之細胞致毒活性(cytotoxicity)與抑制微管蛋白聚合作用活性有相對應之關係。這類 PQ 類緣化合物結構上都具有一個由 A 環和 C 環組成之 biaryl 系統，A、C 環之間的銜接是插入一個 B 環或有時是由一碳氫鍵橋連接在一起。當 A 環的第 6 位置及 C 環的第 3' 位置取代為含有未共用電子對的官能基取代時（如-OCH3、-OCH2O-、-NRR’、-Cl、-F 等），具有優越之細胞致毒活性。而且這兩個官能基間的距離約為 10-11Å，這樣的結構特性可能是化合物藉由這些官能基與微管作用部位產生氫鍵鍵結，故這些官能基在 PQ 類化合物之活性上具有顯著之貢獻。在 2,3-dihydro-2-phenyl-4-quinolones (DHPQ) 16-17 系列中，也有不少衍生物具有微管蛋白聚合抑制活性，且對腫瘤細胞[例如迴盲腸癌(HCT-8)、乳癌(MCF-7)、肺癌(A-549)、鼻咽表皮樣癌(KB)、前列腺癌(PC-3)、人類卵巢癌(1A9)、骨癌(HOS)、神經膠母細胞癌(U-87-MG)、P-gp-表現之鼻咽表皮樣癌(KB-VIN)、黑色素瘤 (SK-MEL-2)等]也具有 cytotoxicity。一旦改變第 6 位置及第 3' 位置的取代，則會和 PQ 系列一樣對其活性也有明顯之影響。這類結構第二位置上有一個 chiral center，所以都有兩個 enantiomers。從藥理數據看來，optically pure (-) isomers 比 racemate 或(+) isomers 具有較強的 antitubulin 活性及 cytotoxicity。 (B) 2-Phenyl-1,8-naphthyridin-4-ones (PN)衍生物之結構與抑制微管蛋白聚合活性的關係 18-20. 5.

(6) PN 類化合物也具有很強之 cytotoxicity，同時也都有相當強的微管蛋白聚合抑制活性。然而一旦第 3' 位置的取代被固定，如-OCH3 ，則第 6 位置的取代基對活性之重要性似乎就不那麼明顯。以上的發現對 PN 衍生物而言是特有的，這和 PQ 及 DHPQ 系列不同。. （二）抑制經由血清素(serotonin)誘發之內皮細胞的通透性 21 serotonin 會引起老鼠心臟內皮細胞單層的外細胞(endothelial monolayer paracellular) 的滲透性增加。在此試驗中 2-phenyl-4-quinolone 會經由影響 actin 及 myosin microfilaments 來防止因 serotonin 誘發的滲透性。所以當內皮細胞受到 serotonin 等血管活化劑 (vasoactive agents)的破壞時，2-phenyl-4-quinolone 會增強內皮細胞的防禦功能。. （三）抑制老鼠中性白血球的呼吸爆發作用(respiratory burst) 22 2-Phenyl-4-quinolone 會抑制老鼠中性白血球的 respiratory burst，其作用主要經由 fMLP (N-formylmethionyl- leucyl-phenylalanine)而非經由 PMA (phorbol 12- myristate 13acetate)；同時也會對 phosphodiesterase (PDE；可能是 PDE4 )抑制而增加細胞內 cyclic AMP 的含量，卻不是直接活化 adenylate cyclase (AC)。換句話說，2-phenyl-4-quinolone 會活化 protein kinase A (PKA)而抑制受到 fMLP 活化之中性白血球所引起的 respiratory burst。. PDE. AC ATP. AMP. cAMP. 23-24. （四）抗血小板活性如 Table 2 、 3 所示， 2-phenyl-4-quinolone 在抗血小板活性有很好的表現。 2-phenyl-4-quinolone (PQ1)抑制 arachidonic acid (100 µM) 引發之血小板凝集活性強度為 aspirin 的 2.1 倍，而當第五位為 C2 H5 取代時，活性大增為 aspirin 的 133 倍，亦相當於 indomethacin 強度之 1.7 倍，是一個頗具開發潛力的先導化合物。. Table 2. The inhibitory effect of monosubstituted 2-phenyl-4-quinolone derivatives on platelet aggregation induced by arachidonic acid. R5. O. R6. R3 R2' R 3'. R7. N R8. H R 4'. 6.

(7) compound R3 PQ1 H PQ 2 Cl PQ 3 Br PQ 4 H PQ 5 H PQ 6 H PQ 7 H PQ 8 H PQ 9 H PQ 10 H PQ 11 H PQ 12 H PQ 13 H PQ 14 H PQ 15 H PQ 16 H PQ 17 H PQ 18 H PQ 19 H PQ 20 H PQ 21 H PQ 22 H PQ 23 H PQ 24 H PQ 25 H PQ 26 H aspirin indomethacin. R5 H H H F CH3 C2 H5 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H. R6 H H H H H H F Cl OCH3 OH H H H H H H H H H H H H H H H H. R7 H H H H H H H H H H F Cl CH3 OCH3 H H H H H H H H H H H H. R8 H H H H H H H H H H H H H H F Cl CH3 OCH3 H H H H H H H H. R2’ H H H H H H H H H H H H H H H H H H Cl CH3 OCH3 H H H H H. R3’ H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H OCH3 H H H H. R4’ H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H Cl CH3 OCH3 OH. IC 50 (µM) 9.63 392.16 41.43 15.82 0.98 0.15 9.07 20.20 5.84 23.77 3.60 1.08 27.58 23.35 169.18 39.50 36.56 68.19 12.39 34.68 20.08 7.90 12.39 4.89 8.08 17.95 20.00 0.25. Platelets were incubated with a test sample or 0.5 % DMSO at 37 ℃ for 1 min, then arachidonic acid (100 µM) was added to trigger the aggregation. Aspirin is a positive control.. Table 3. The inhibitory effect of disubstituted 2-phenyl-4-quinolone derivatives on platelet aggregation induced by arachidonic acid. R5. O. R6. R3 R2' R3 '. R7. N R8. H R4 '. compound PQ27 PQ28 PQ29 PQ30 PQ31 PQ32 PQ33 PQ34 PQ35 PQ36 PQ37. R3 Br Br H H H H H H H H H. R5 H H F F F F Cl Cl Cl CH3 CH3. R6 H H F H H H H H H H H. R7 Cl H H F H H Cl H H CH3 H. R8 H H H H F CH3 H Cl CH3 H F 7. R2 ' H CH3 H H H H H H H H H. R3 ' H H H H H H H H H H H. R4 ' H H H H H H H H H H H. IC 50 (µM) 9.26 137.08 15.00 389.11 130.96 58.90 3.55 30.02 6.98 1.03 16.11.

(8) PQ38 PQ39 PQ40 PQ41 PQ42 PQ43 PQ44 PQ45 PQ46 Aspirin. H H H H H H H H H. CH3 CH3 CH3 OCH3 OCH3 OH H H H. H H H H H H H OCH3 H H H H F F H Cl -OCH2 O-. Cl CH3 OCH3 H OCH3 OH H Cl H. H H H H H H H H H. H H H H H H H H H. H H H H H H H H H. 13.65 9.03 7.86 38.77 138.97 395.26 389.11 24.41 7.40 20.00. Platelets were incubated with a test sample or 0.5 % DMSO at 37 ℃ for 1 min, then arachidonic acid (100 µM) was added to trigger the aggregation. Aspirin is a positive control.. 8.

(9) 肆、2-Phenyl-4-quinolone 類緣化合物相關之電腦分子模擬(molecular modeling) 微管是一種非常不穩定的蛋白質，所以很難利用 X-ray 結晶方式取得其蛋白質結晶結構，但近來已有學者利用 electron crystallography 方式將微管蛋白與 taxol 結合時的蛋白質結晶出來。已有數篇文獻運用電腦分子模擬來研究微管蛋白聚合作用抑制劑 25-37 。近年來本實驗室與李國雄教授合作所合成一系列之 PQ 衍生物，這類化合物對微管聚合作用有顯著且強效之結果，然而其作用於微管的位置仍未相當明確。因此著者欲藉由電腦分子模擬方法來設計更具潛力的化合物。. 茲於此將較常用二套 3D QSAR (three-dimensional quantitative structure-activity relationships)電腦分子模擬軟體 38 簡單介紹如下：（一）Comparative Molecular Field Analysis (CoMFA) 以 3D QSAR 分子模擬來設計 new lead compound 的領域中，CoMFA 是相當廣泛地使用的方法。CoMFA 的分析是以傳統分子模擬配合藥效基團接合(pharmacophore mapping)的分析來建立每個化合物的生物活性構型(bioactive conformation)及分子的模式，並提供每個分子之靜電力(electrostatic field)與立體結構的空間關係(steric field)。由生物活性的強弱及 electrostatic 及 steric field，經由 PLS (partial least square)39 的特殊多變異統計方式來評估構效間的關係。其中 PLS 的分析是採交叉印證(cross- validation)－即每次將無法配合 model 之化合物數據排除在外，從 leave-n-out 的過程中被略去的化合物活性仍可被預估出來。最後在每個晶格點(lattice point)中會呈現每個化合物所計算之能量大小及以 3D 方式勾畫出分子構型與受體間的輪廓，一來可幫助研究者易於評估構效間的關係是否合理，再者可進一步用來設計新型先導化合物(new lead compound)。我們的共同研究者李國雄博士於 2000 年也以 CoMFA 及 CoMFA/q2 -GRS 方法來探討 104 個作用於秋水仙素鍵結位置(colchicines-binding site)化合物的 3D QSAR37 ，就 PQ 化合物而言，大部分之空間關係及靜電力繞著 PQ 的 C 環，顯示在 PQ 的 C 環基團在活性親和力上扮演極為重要的角色。（二）Catalyst38 Catalyst 是一套建構藥效基團(pharmacophore)的 3D QSAR 電腦分子模擬軟體，可經由輸入 2 D 分子結構，經程式運算將結構最適化(optimization)後產生分子所有可能之合理 3D 構型(conformation)，再配合選定的分子化學結構上基團的特性(features)，如氫鍵 9.

(10) 提供者(hydrogen-bond donor)、氫鍵接受者(hydrogen-bond acceptor)、可離子化基團 (ionizable group)、厭水性基團(hydrophobic group)等，依活性與結構的關係進行計算後可獲知化合物與受體間可能的作用力，最後結果以 3 D 方式之 Hypothesis 呈現出活性基團的空間位置及向量，可使研究者瞭解有效的作用分子所必須具備的官能基和官能基之間的距離、角度等。最後可將較為合理之假設性活性藥效基團(Hypothesis)結合化學資料庫可進一步搜尋到可能有相同生物活性或活性更強且結構特異之新型先導化合物。. 10.

(11) 第二節 2-Phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid ethyl esters 衍生物之化學合成本研究之標的化合物為 2-phenyl-4-quinolones 之第 3 位導入一親水性基團(-COOH) ，在此先將 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid ethyl esters 衍生物其文獻上既有之合成方法介紹如下：關於 3-substituted 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid ethyl esters 之合成，早在 1946 年 Robert C. Elderfield 等學者以 benzo-p-anisidide 為起始原料與 PCl5 氯化反應形成 iminochlorides 後，接著與 sodium diethyl malonate 反應及熱環化形成第 3 位 COOEt 取代之 2-phenyl-4-quinolones 衍生物(Scheme 1) 40 。. Oliver Kappe 等學者 41 於 1992 年 2,3-dihydropyrrole-2,3-diones 在 diphenyl ether 存在下，在 240℃加熱脫去 C＝O 得到 imidoyl ketenes，再進行環化反應而得到相對應之 2-phenyl-4-quinolones。其中 3 位 COOEt 取代衍生物在反應速率及產率方面都相當不錯 (Scheme 2, Table 3)。. 接著 1997 年 El-Nabi H. A.等學者 42 提出與 Oliver 相似的合成方法，同樣以 2,3-dihydropyrrole-2,3-diones 為起始原料合成第 6 位 CH3 、第 3 位 COOEt 取代之 2-phenyl-4-quinolones 衍生物。. 2001 年韓國學者 Jae-Chul Jung 等學者 43 以 3,4-difluorobenzoic acid 為起始原料，經硝化後再與 ethyl acetoacetate 反應得到 keto ester，接著在 palladium-on-charcoal (Pd/C) 催化下進行氫化反應形成 N-hydroxy-2-substituted quinolones，繼而將其氮上之 OH 還原，最後再以氫氧化鈉水溶液或氫氧化鋰的 THF 溶液水解，即得第 3’位 COOH 取代之 2-phenyl-4-quinolone 衍生物。(Scheme 3, 4). 11.

(12) R1. R1. Cl. PCl5 R2. N. R2. N. OH R1. COOC 2H5. NaCH(COOC 2H5 )2 R2. N H. OH. Cl. R1. R1 POCl3 N. R2. R2. N. H. H R1 = OCH3 , R2 = H R1 = H, R2 = Cl R1 = H, R2 = OCH 3. Scheme 1 O. O. R. R O. C. Ph-O-Ph 240 ℃. N. N. -CO. O R. N H R = H, Me, Et, Br, CN, COOEt. Scheme 2 Table 3. The reaction time and yields of 3-substituted 2-phenyl-4-quinolones R. Reaction time/h 12. Yield (%).

(13) H Me Et Br CN COOEt. R1. 3 8 8 5 0.5 0.25. COOH. 94 90 92 72 83 91. COOH. R1. ii, iii. i R3. R3. O. NO2 R1 = R3 = H R1 = R3 = F. O. R2. OEt. OH. O. R1. OEt. iv OH. O. R1. N. R3. O. H OEt. R3. NO 2 R1 H F H F F. R2 OEt OEt Me Me Ph. R1 = R3 = H R1 = R3 = F. COR 2. O R3 H F H F F. v. O. R1. OEt N. R3. R2. OH R1 H F F. R2 Me Me Ph. R3 H F F. i) HNO3/H2 SO 4 ; ii) SOCl 2, urea/toluene; iii) Mg, EtOH/toluene; iv) NaBH4 , Pd/C, NaOH (aq), 1,4-dioxane; v) H2 , Pd/C, EtOH, 1bar. Scheme 3. 13.

(14) O. O. O. F. F. OEt F. N. O. i. OEt. R2. F. OH. N. R2. H R2 = Me, Ph. R2 = Me, Ph. ii. O. O. O. F. F OH. N N R4. O. N. OH. iii. R2. F. H. N. R2. H. R2 = Me, R4= H R2 = Me, R4= Me R2 = Ph, R4= H R2 = Ph, R4= Me. R2 = Me, Ph. i) Na2S2O 4, EtOH/H2O; ii) 2N NaOH or LiOH/THF; iii) piperazine or N -methylpiperazine/pyridine. Scheme 4. 14.

(15) 第三節微管蛋白聚合抑制劑之概述 44 壹、微管的結構與功能微管結構微管是一中空的管狀結構，從橫切面可見，有 13 個原纖維（protofilaments），每一個原纖維是由管蛋白（tubulin）二聚體α和β微管蛋白組成。微管的外徑為 2 5 nm，內徑為 15 nm，壁厚為 10 nm。微管長度從 1 µ m 至數 µ m 不等。α及β單位的分子量約為 55000 道爾頓，所以微管蛋白的分子量為 110000 道爾頓。微管相關蛋白（microtubulie-associated ptoteins）被稱為 MAP1、MAP2 及 Tau 蛋白，常伴隨著微管蛋白存在，能促進微管聚合。微管蛋白具有兩個 GTP(guanosine triphosphate)結合位點，一為 N 位點（N-site），另一個為 E 位點（E-site）。N 位點結合一分子 GTP，在微管聚合過程中，不被水解，也不與游離的 GTP 進行交換（Non-exchangeable）。E 位點結合一分子 GTP，可以與溶液中 GTP 進行交換。當微管蛋白結合到微管時，這 GTP 被水解為 GDP 45 。(Fig. 3). 微管的主要功能 46,47 1. 微管構成了細胞的網架，維持細胞型態，固定與支持細胞器的位置。 2. 參與細胞的收縮與偽足運動，是纖毛與鞭毛等細胞運動器官的基本結構成分。 3. 參加細胞器的位移活動，尤其是染色體的分裂和位移需要在牽引絲（微管）的幫助下進行。 4. 參與細胞內物質運輸，微管在細胞內可能起著運輸大分子顆粒的作用，已證明病毒與色素顆粒可沿著微管移動，而且速度很快。 5. 微管與其他細胞器的關係密切：微管在核周圍特別密集，並由此向細胞質的外圍伸展，同時與核膜有接觸聯繫。核孔的生理功能與微管有關。微管在粒腺體的周圍常可見，並與粒腺體的長軸平行排列，有「橋」與粒腺體相連。有人還發現微管與高爾基體的小泡相連，並認為與物質運輸有關。當甲狀腺細胞微管破壞後，高基氏體也消失。微管與細胞病理關係明顯，如老年性痴呆病人腦細胞微管呈彎曲狀態；微管做為細胞穩定性條件之一，它的功能損傷或控制失調與腫瘤發生可能存在關聯性，如腫瘤細胞或病毒轉化的細胞，微管相應發生改變。. 15.

(16) 貳、以微管為靶點的抗癌藥研究多數抗微管類抗癌藥是從高等植物提取的天然產物及其衍生物。許多藥物與微管的特異結合在疾病治療中有著重要作用。當前臨床上常用的抗癌藥如秋水仙鹼，秋水仙醯胺，長春花生物鹼類等，均對微管有抑制作用，這說明微管是這類藥物的作用靶點。根據藥物與微管結合的位點不同，可將現有的抗微管化合物分為四類：（一）在微管蛋白上有一個結合位點的藥物，包括秋水仙鹼(colchicine)，秋水仙醯胺(colcemid)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、五加前胡素（steganacin）及合成的 nocodazole 等。這些藥物或化合物均抑制微管聚合，並具有相同的結合位點。（二）在微管蛋白上有兩個結合位點的藥物或化合物，包括長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、美登素(maytansine)等。在微管蛋白上有兩個結合位點，而且均與秋水仙鹼的結合位置不同，也是抑制微管聚合。（三）紫杉醇（taxol; paclitaxel）類抗癌藥之作用機理與上述二類均不相同，為促進微管聚合、抑制微管解聚的抗微管物。（四）5,6-diphenylpyridazin-3-one 類衍生物，其抑制微管聚合，但結合位點與上述幾類抗微管物不同。. Fig. 4. 微管蛋白上各抗微管類抗癌藥之作用靶點 48 。有兩個 GTP 結合位點，一為 N 位點（ GTP），另一個為 E 位點（GDP）；taxol 結合點位於β管蛋白；colchicine 結合點位於β管蛋白上，靠近α管蛋白處。 +end. GTP TAXOL (binding site on β). GDP Colchicine (binding site on β). 16. - end.

(17) 下面介紹各類抗微管物與其靶點的相互作用：(Fig. 4) 1. 秋水仙鹼、鬼臼毒素：秋水仙鹼是一古老的抗癌藥，由於毒性大，臨床上已不用，但作為一個工具藥在細胞生物學研究中應用很多。它抑制微管聚合或裝配，使分裂細胞不能形成紡錘體而停止於分裂中期。用標記的秋水仙鹼證明，其在管蛋白二聚體上有一個高親和位點；實驗證明這個結合位點在β－亞單位與α－亞單位之間 (fig. 5)。Taylor 等曾計算當細胞內 3~5%的管蛋白與秋水仙鹼結合成複合物時，細胞就被阻斷在分裂中期。根據電子顯微鏡觀察及其他實驗結果，曾對秋水仙鹼抑制微管體外聚合的機理進行解釋。首先，秋水仙鹼分子與微管蛋白二聚體結合，形成秋水仙鹼－微管蛋白複合物（CD, colchicine－tubulin dimer），這複合物參入到正在延伸的微管末端，則微管進一步聚合作用被阻斷。Wilson 於 1978 年證明，達到穩態（動態平衡）的微管，其一端為淨聚合端，而另一端為淨解聚端。達到穩態時，聚合的速度與解聚的速度相等。這時如 CD 加到微管的淨聚合端，則阻斷了新的游離微管蛋白二聚體再加到聚合端。但另外一端的淨解聚作用仍在進行，因此微管最終完全解聚。(Fig. 5) 秋水仙醯胺是合成的秋水仙鹼衍生物•其作用機理與秋水仙鹼相同，但是毒性比秋水仙鹼低，臨床上對乳腺癌有效。鬼臼毒素（podophyllotoxin）本身有很強的微管抑制作用，同時對細胞核. u酸轉運也有阻斷作用，但後者所需的藥物濃度比對微管的抑制要. 高很多倍。由於毒性大，鬼臼毒素的臨床應用受限制。 2. 長春花生物鹼和美登素，長春花生物鹼是唯一的使細胞內微管形成高度有組織的棒狀結晶的抗微管物。這種結晶呈短棒狀，橫切面似六角形結構。其中有許多沿長軸排列的微管形成的聚集體。體外實驗證明，低濃度時，長春新鹼對微管聚合有抑制作用，而高濃度時，引起聚集反應，濁度增加，從聚合曲線看好像增加了微管的聚合。在細胞內，長春新鹼在低濃度時也引起解聚，高濃度時形成短棒狀微管結晶。這種結品與細胞骨架連在一起，而且對鈣離子的解聚作用不敏感，說明鈣離子在微管蛋白上的結合位點或者被阻斷，或者是由於結晶形成使結合位點發生了變化。長春新鹼在微管蛋白上有兩個結合位點。美登素抑制微管聚合，但是它與微管蛋白結合不導致微管形成結晶。美登素使細胞分裂停止，有絲分裂指數明顯增加，當 P388 白血病細胞的有絲分裂指數（MI）為 1~2%時，給藥組 P388 白血病細胞的 MI 可達 60%，並具有抗癌活性。 3. 紫杉醇(taxol)對微管的作用：taxol 是新的 diterpene 化合物，其結構新穎，作用 17.

(18) 機理與已知抗微管物不同，是唯一能促進微管聚合的藥物 49。Taxol 對微管作用的機理： taxo1 導致細胞內及細胞外形成結構和功能完全不同的微管，其機理十分複雜。報導指出，taxol 的結合位點是在已成為聚合狀態的微管上，不是在游離的微管蛋白二聚體上。 Taxol 對微管體外聚合的影響：它明顯地提高微管體外聚合的速度和產量；taxol 雖能提高微管產量，但微管的長度變短。關於 taxol 使細胞內微管形成短的微管束，DeBraband er 於 1981 年指出，隨著微管束的形成，伴隨行原來微管的解聚。後來 Horwitz 等報導，用 0.3 µ mo1/L 處理 J477.2 細胞 1 小時，細胞內不形成微管束。但如果先用解聚藥 nocodezole 處理 1 小時，然後洗去藥物，再用 0.3 µmo1/L taxol 處理，則微管束很快形成。Breune 等用秋水仙醯胺預先處理也得到類似的結果。上述結果說明 taxo1 使胞漿內微管發生了重組。 4. 合成的 5,6-diphenyl-pyridazin-3-one（DPP）類衍生物：DPP 類衍生物對動物高血壓有降壓作用，為研究其結構活性關係，合成了一系列衍生物，其中某些化合物經美國國立腫瘤研究所篩選，發現具有抗 L1210 和 P388 白血病的活性。Hamel 等進行了抗微管作用的研究，認為它是一類新的抗有絲分裂劑，它能與微管結合，且具有新的結合位點 50 。中國大陸於 1990 年也合成了一系列 DPP 衍生物，並進行了抗微管抗腫瘤活性的研究 51 。某些化合物有較強的抗微管抗腫瘤作用，細胞週期動力學實驗表明，藥物作用後，G1 期細胞減少，G2 / M 期細胞明顯增加，細胞有絲分裂指數增加。. 18.

(19) 第四節細胞週期(cell cycle) 由幹細胞(stem cell)分化到完整的細胞，真核細胞(eukaryotic cell)不是處於有絲分裂就是停止在休眠狀態。大致而言，我們可將複雜的細胞增殖現象分為三個時期：細胞生長期、DNA 複製期、細胞分裂期，這個過程稱為細胞週期(Fig. 7)。細胞週期可分為 Interphase (G0, G1, S phase, G2)及 M phase52 。 Gap 0 (G0)：細胞處於休眠期，可能為暫時性或永久性的停止生長，若細胞已發展到最後階段便不再生長。（如神經細胞；neuron） Gap 1 (G1)：此期之細胞開始生長，細胞大小增加，同時產生 RNA 及合成蛋白質，目的是為 DNA 複製做好準備。 Synthesis (S) phase：為了使分裂後的二個子細胞相似，DNA 必須複製使含量增加一倍。此期有許多作用於 DNA 的專一性藥物，如 5-Fu、methotrexate 等。 Gap 2 (G2)： DNA 複製到有絲分裂的間期，細胞會持續生長並產生新的蛋白質。 Mitosis (M) phase：這個階段的細胞停止生長及蛋白質合成，所有細胞的能量集中在複雜而有規律性的細胞分裂以期得到兩個相似之子細胞。M phase 比 Interphase 作用時間短很多，大約 1-2 小時。本研究焦點即是尋找作用於 M phase 的新穎藥物，以期有效阻斷不正常癌細胞分裂。. 如 Fig.7 及 Table 4 所示 53，調控細胞週期的因子主要是 cyclin 和 cyclin-dependent kinase (CDKs)，不同時期的細胞受到不同 cyclin 及 CDKs 所調控，然而當 CDK 過度活化時會受到 CDKI (cyclin-dependent kinase inhibitor)的抑制以維持正常之細胞週期， CDKI 分為 INK4 (Inhibition kinase：p16ink, p15 ink , p18 ink, et al) 和 CIP (p12,p27, et al)。 INK4 family 有 P16、P15、P18、P19 等，主要調控 CDK 4 與 CDK6 之活性；CIP family 有 P21、P27 等，主要調控 CDK 2、CDK 4 與 CDK6 之活性。例如在 G1 phase，CDK 4,6/ cyclin D1,2,3 被活化時，會促使 Rb (retinoblastoma protein)磷酸化而與 E2 F (E2 factor；轉譯活化因子)分離，使 E2 F 可將訊息傳遞下去以利細胞進入 S phase。合成之 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid 類緣化合物在預期的生物活性主要是抑制微管蛋白聚合，因此對細胞週期的影響應呈現在 G2/M phase，故著者欲將細胞增殖抑制較顯著之化合物進行細胞週期的試驗，以期盼更確知這類衍生物在細胞週期的影響。 19.

(20) Table 4. 調控細胞週期的因子 cyclin 和 cyclin-dependent kinase (CDKs) cyclin cyclin-dependent kinase process regulated Cyclin D Cdk4,6 G1-phase progression Cyclin E Cdk2 G1 to S-phase Cyclin A Cdk2 S-phase progression Cyclin A cdc2 (Cdk1) S through G2 Cyclin B cdc2 M-phase. 20.

(21) 第五節腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor; TNF) 腫瘤壞死因子(TNF)的研究可追溯到十九世紀末，人們發現有些惡性腫瘤患者在伴有細菌感染時，可導致腫瘤的自發消退。1975 年，Carswell 等鑑於其主要生物活性是導致腫瘤出血壞死而正式提出用 TNF 來命名。TNF 在生理、病理上扮演著重要角色，對有機體具有保護作用，包括細胞增殖、分化、凋亡、免疫反應的活化、調節發炎反應的凝血作用及殺傷腫瘤細胞等。 TNF 對多數腫瘤細胞有細胞毒殺作用、細胞溶解和細胞抑制作用。其機轉涉及：（1）介導免疫反應；（2）對腫瘤細胞的直接殺傷作用。首先，免疫反應的介導主要是監視和殺滅腫瘤細胞。TNF 不僅活化巨噬細胞而且能誘導多種免疫調節介質，如 IL-1、IL-6、 IL-8 等參與各種免疫反應，亦能刺激 T 細胞、NK 細胞活性，調節 B 細胞的分化和增殖，並抑制腫瘤血管形成，引起腫瘤組織微血管內皮細胞凋亡，繼而導致腫瘤組織出血壞死。TNF 透過兩條途徑直接作用於腫瘤細胞：(i) TNF 與靶細胞膜上特異接受器結合，並進入細胞中，作用於溶. r體，使溶. r體通透性增加並受損，溶. r體的擴散導致靶細胞. 病理性壞死，出現細胞腫脹、細胞膜破潰、細胞核及胞器溶解等病理變化。(ii) TNF 與靶細胞接受器結合後，引起細胞內一連串訊號傳導而導致細胞凋亡，出現核固縮成顆粒狀凝集於核膜下、細胞膜氣泡化、在核小體連接處斷裂等病理型態或生化改變。 TNF 可經由二種受器(TNFR1 & TNFR2 )分別造成細胞凋亡、存活 68 及慢性、急性發炎 69。在人類所有組織都有 TNFR1，其受質為 TNF-a，會活化誘導細胞凋亡，也可經由另一途徑作用，活化 NF-?B，使基因表現讓細胞存活，但卻會加強發炎的效應。TNFR2 則大多分佈在免疫細胞（如單核細胞、淋巴細胞），其受質包括 TNF-a 及 TNF-ß，與發炎有關。(Fig. 8) TNF-a 過度表現會造成老化、基因缺陷等與發炎相關的現象、Crohn’s Disease。如類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)就是 TNF-a 誘發軟骨細胞(cartilage cells)凋亡所引起的疾病。治療 Crohn’s Disease 作用機制為抑制 PDE4 56，使 cAMP 轉變為 AMP 的途徑受阻，因而使 cAMP 的濃度增加而活化 PKA，進一步降低 NF-?B 的轉譯，減少 TNF-a 的生成 57 。除上述疾病外，與 TNF-a 相關的尚有多發性硬化(multiple sclerosis)58 、阿茲海默症 (Alzheimer’s disease)59 等。 1997 年 Pruzanski 提到微管蛋白聚合抑制劑(microtubule depolymerizing agents)可降低 TNF-a 細胞表面受器的表現 60；因為 TNF-a 與 IL-1B 的結合會增強基因表現及 sPLA2 21.

(22) (proinflammatory secretory nonpancreatic phospholipase A2)的釋放而可選擇性抑制 sPLA2 的表現及釋放，並非作用於細胞表面的受器；所以微管在 sPLA2 的合成扮演重要的角色，可解釋微管蛋白聚合抑制劑在抗發炎活性上的影響。本論文對所合成 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid 類化合物主要針對抑制微管蛋白聚合作用，因此將此類化合物進行 TNF-a 活性抑制之篩選，以期對是否亦對 TNF-a 有調節作用做進一步了解。. 22.

(23) 第六節肥胖細胞（mast cells）與嗜中性白血球（neutrophils）之生理功能如 Fig. 9 所示，肥胖細胞在過敏反應（anaphylaxis）中扮演相當重要的角色，當肥胖細胞受到外來的刺激被活化後，會釋放出多種發炎誘導物質（ inflammatory mediators） 61-62. ，如 vasoactive mediators（如 histamine，kininogenese，PAF）及 spasmogens（如. histamine，PGD2 ，LTC4 ，LTD4 ），這些物質分別會導致血管擴張、通透性增加，或引發支氣管平滑肌、黏膜水腫及分泌增加，造成過敏及氣喘的發生 63-64 。另外也會釋放出化學誘引劑（chemoattractants），例如過敏性嗜伊紅性血球化學趨化因子(eosinophil chemotactic factor of anaphylaxis; ECF-A)及嗜中性白血球化學趨化因子(neutrophil chemotactic factor; NCF)，這些化學媒介物會活化嗜中性白血球，當嗜中性白血球被活化後，會產生高反應性之超氧自由基（superoxide anion O2 ·-）、羥基自由基（hydroxy radical； OH·）及過氧化氫（hydrogen peroxide；H2 O2）等具有細胞毒性的 oxygen species65，而導致細胞損傷，這些細胞損傷包括老化（aging）66 、缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury)67-69、類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis）70-71 及腸炎（inflammatory bowel disease） 72-73. ；同時當嗜中性白血球被活化時，也會釋放大量的 lysosomal enzymes，這些酵素會. 對組織進行蛋白質分解 74 ，而導致肺氣腫（pulmonary emphysema）、類風濕性關節炎、動脈硬化（arteriosclerosis）及腎小球腎炎（glomerulonephritis）等疾病的發生與惡化 75-77。控制嗜中性白血球活化的機制有很多種，當化學誘引劑活化細胞時這些機制同時也快速地啟動。反應的抑制包括接受體的敏感度降低、接受體回到細胞內被分解或化學誘引劑被代謝成無活性的物質。另外接受體的敏感度降低也包括細胞內 cAMP 增加，或 PKC 活化阻斷 PLC 與 G protein 間的結合，形成回饋抑制。而細胞內抑制性的訊息傳遞分子，PGE1 (prostaglandin E1 )、histamine、adenosine 及刺激 ß-adrenoceptor 的藥物，可經由與細胞表面的接受體以結合以及 G protein 的活化，來增加 cAMP，達到抑制呼吸爆發的作用(respiratory brust)78-82 。cAMP 對嗜中性白血球活化的早期及晚期有不同的調控，一般認為可抑制嗜中性白血球經化學誘引劑刺激所引起的 adhension83、migration84 、 chemotaxis85 及超氧自由基的生成，對於抑制顆粒酵素的釋出與吞噬作用則較不明顯 86 。嗜中性白血球適量的生成超氧自由基有助於保護個體免於遭受感染或侵襲。但若產生超氧自由基不足，會使個體溶液受病菌感染；而過多的超氧自由基則會傷害鄰近的細胞或組織，產生疾病 87 。藥物若能控制嗜中性白血球產生適量的超氧自由基，則有助於減少組織的傷害。因此，若能研發出抑制肥胖細胞及活化嗜中性白血球之藥物，即可減緩發炎症狀之 23.

(24) 痛苦，對過敏及發炎的預防與治療將有莫大的助益。本論文亦將所合成之 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid 衍生物，利用此模式篩選抗過敏及抗發炎物質，以 compound 48/80（a polymer of N-(p-methoxyphenylethyl) methyl-amine with formaldehyde）誘發肥大細胞釋放β- glucuronidase 及 histamine，測試化合物抑制反應的程度。同時測試化合物對 fMLP（N- formylmethionyl- leucyl-phenyl alanine）引起嗜中性白血球釋放β- glucuronidase 及 lysozyme 反應之抑制作用。另外也測試化合物對因 fMLP 及 PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）引起嗜中性白血球超氧自由基形成之抑制作用，其中 fMLP 與 PMA 是分別作用在細胞膜之接受體及細胞內之 protein kinase C (PKC)上。. 24.

(25) 第七節小神經膠質細胞（microglial cells）之生理小神經膠質細胞是腦中的巨噬細胞（macrophage），它對周圍的細胞有益處也有害處，而且與大部分的發炎、感染及中樞神經系統的退化性疾病有關 88-89 ，其中中樞神經系統疾病會造成多發性硬化症（ multiple sclerosis）90、阿茲海默症（Alzheimer’s disease） 91. 、巴金森氏症（Parkinson’s disease）92 及愛滋症所引起的癡呆症（AIDS dementia）93 。在小神經膠質細胞中，藉由誘導型一氧化氮合成酵素（inducible nitric oxidase. synthetase；iNOS）可將 L-阿金氨基酸（L-arginine）轉換成一氧化氮及瓜氨酸（citrulline），所生成之一氧化氮可導致延遲性的神經毒性，或者可加強 N-甲基-D-天門冬酸（N-methyl-D-aspartic acid）所引起的神經傷亡。當小神經膠質細胞被細菌性內毒素脂多醣（lipopolysaccharide；LPS）活化時，就會釋放出一氧化氮（nitric oxide；NO）及腫瘤壞死因子等物質 94-95 ，而這些物質在中樞神經系統中，可能對於小神經膠質細胞與其他細胞之間的交互作用扮演著決定性的角色。小神經膠質細胞產生的一氧化氮及活性的氮氧化物（ nitrogen oxides），在缺血性及神經退化性疾病中會造成神經元細胞的死亡 96 ，而在多發性硬化症中也會造成寡樹突膠質細胞（oligodendrocyte）的損傷 97 。此外在神經元退化的病源中，活性的含氮中間體（nitrogen intermediates）及 TNF-. ，會造成老. 化及阿茲海默症 98 。綜合前述可知，抑制小神經膠質細胞產生一氧化氮及 TNF樞神經系統疾病的藥物。. 25. ，可當作治療各種中.

(26) 第九節. 抗血小板藥物之概述. 近年來血栓栓塞疾病包括動脈硬化、心肌梗塞、腦中風與腎血管疾病，被列為世界十大死亡原因之一。而血小板在血栓之形成中扮演非常重要的角色，因此血栓栓塞疾病之預防與治療均需要利用抗血小板藥物，所以此類新藥之開發乃成為醫藥界重要的課題之一。而第一節曾述 2-phenyl-4-quinolone 衍生物對於 arachidonic acid 誘發血小板凝集有很好的抑制活性，著者也將所合成之 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid 衍生物測試其抗血小板凝集活性，故茲於此將血小板相關之生理機制、活化途徑及抗血小板藥物分類等分述如下。. 血小板之生理機制 99-103 血小板在血液中扮演的角色主要是藉由修復受傷的血管內皮細胞，來維持血管的完整以抑制持續出血。正常情況下血小板在血液中是呈平圓型的，其細胞膜有許多受器與像受器的蛋白質。為維持血小板在正常生理狀態下不活化，體內也有抑制血小板活化之機制。血管內皮細胞(endothelial cell)不僅提供物理性屏障，以避免血小板附著到內皮下的基質外，也會分泌 prostaglandin (PG)、EDRF (endothelim-drived relaxing factor)及 nitric oxide (NO)，分別活化 adenylate cyclase 與 soluble guanylate cyclase，來增加 cAMP 及 cGMP 濃度，抑制所有刺激引發血小板活化反應，使血小板不會與內皮細胞或其它血小板的作用，以避免血栓的形成。血管受傷破裂後，血小板會開始修復受傷的血管，其過程可分為四個步驟 101 ：(Fig. 10) （一）血小板的黏著：內皮細胞受損或血管受傷破裂後，血管會先收縮，使內皮細胞底層的膠原纖維 (collagen fiber)暴露出來接觸到血液時，會活化內在途徑的凝血因子，血小板會因而開始附著在血管壁。而血小板的附著是由 von Willebrand factor (vWF)先與膠原纖維結合後，vWF 構型發生改變，此時 vWF 能夠結合在血小板細胞膜的 glycoprotein Ib (GPIb)受器上，使血小板附著於血管壁。（二）血小板的變形及活化：附著於膠原纖維的血小板會釋出 ADP、thromboxane A2 (TXA2 )等物質，這些物質能夠促使更多的血小板聚集過來。蛋白質及可溶性物質（如 thrombin、ADP、. 26.

(27) catecholamines、serotonin、TXA2 、PAF 等），會作用在血小板表面的受器，造成血小板的活化，使原本平圓狀的血小板變成表面積較大的多刺狀，如此可讓更多受器暴露出來。（三）組織血激素(Tissue thromboplastin)會活化外在途徑的凝血因子，纖維蛋白原 (fibrinogen)會結合在血小板的 Glycoprotein IIb/IIIa (GP IIb/IIIa)受器，像膠水般把血小板黏在一起，使大量血小板及 fibrin 累積在受傷部位的血管，這過程即是血小板凝集。（四）纖維蛋白(fibrin)讓血小板增多，以形成堅固的塊狀物(血栓)作為血管修補時的保護者。此時的血小板已是無內涵物的空帶狀胞器。（五）凝塊的收縮，血小板中心嵌在 fibrin 束的節點上。. 血小板內部的活化可分成數個途徑 102 (Fig. 11) （一）Phosphoinositide pathway: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2 )會受到 phospholipase C (PLC)分解形成 inositol-1,4,5-triphosphate (IP3 )及 1,2-diacylglycerol (DG)。IP3 會使 Ca+2 增加，而 DG 會活化 protein kinase C (PKC)。（二）Eicosanoid pathway: Phospholipid (磷脂質)受到 phospholipase A2 (PLA2 )催化變成花生四烯酸 (arachidonic acid; AA)，再由 cyclooxygenase (COX)的酵素作用下形成 PGG2 、 PGH2 ，PGH2 會再形成 Thromboxane A2 (TXA2 )，TXA2 被釋放到血液後會活化其它血小板。（三）cAMP ATP 受到 adenylate cyclase 催化形成 cAMP，cAMP 的濃度增加會使血小板內的 Ca+2 濃度由 0.05-0.1µM 增高到大於 1µM，而血小板活化的最後關鍵者就是Ca+2 濃度。Ca+2 增強 PKC 的活性活化 PLA2 ，使 cytiskeletal 活化及 granule 的釋出。會活化 adenylate cyclase 的物質有 PGE1 、adenosine 及 PGI2 。另一方面，cAMP 會受到 phosphodiesterase 水解成 AMP，如此一來 cAMP 的量受到抑制，血小板的活化機能因此而降低。所以若能抑制 phosphodiesterase，即可讓 cAMP 的濃度增加而活化血小板。可抑制 phosphodiesterase 的物質有 caffeine、theophylline 及 dipyridamole。 27.

(28) 抗血小板藥物之分類 104-105 理論上能抑制血小板活化的任一步驟均可作為研發抗血小板藥物之標的。目前抗血小板凝集的藥物依其作用機轉可分為下列幾類：(如 Fig. 12、Table 6) （一）影響血管內皮細胞的功能(包括藉由抑制 phosphodiesterase 而阻斷 cAMP 轉變成 AMP 或增加 cAMP 的藥物)：phosphodiesterase inhibitors、PGs 與 NO 類似物、 dipyridamole、caffeine。（二）抑制血小板的黏著：GPIb/vWF antagonists。（三）血小板的活化：（A）抑制 Thrombin：thrombine-receptor antagonists、hirudin、argatroban。（B）抑制 Serotonin：ketanserin。（C）抑制 ADP：Ticlopidine、clopidogrel、P2T-receptor antagonists。（D）抑制 TXA2 受體：TXA2 受體拮抗劑－如 Ridogrel。（四）干擾血小板的釋放：（A）抑制 TXA2 之合成酵素(synthase)：dazoxiban。（B）抑制 Cyclooxygenase 酵素：NSAIDs。（五）抑制血小板凝集：Glycoprotein IIb/IIIa receptor blockers。目前臨床上最常被使用的抗血小板藥物aspirin乃抑制血小板cyclooxygenase而阻斷 TXA2 之生成。另一個用於臨床的抗血小板藥物ticlopidine則可選擇性抑制ADP引起的血小板活化。然而aspirin對細胞作用之選擇性差，會抑制內皮細胞合成prostacyclin。至於 ticlopidine有藥效產生緩慢，且可能引起白血球缺乏之缺點。近年來亦有不少新型抗血小板活性之化合物其作用點在於抑制TXA2 synthetase及其與TXA2 receptor結合之拮抗，其中oragrel sodium (xanbon, OKY-046) 已在日本被核准上市。然而到目前為止，aspirin仍然被認為是臨床上最安全之少數抗血小板藥物之一99 ，因此尋找更理想之抗血小板藥物仍是醫藥界急迫研發之方向。 Table 6. 調節血小板功能之物質 104 Pathways Platelet adhesion ? von Willebrand factor. Agents Glycoprotein GPIb-receptor antibody Antibody to von Willebrand factor Inactive von Willebrand factor fragments 28.

(29) Platelet aggregation ? Cyclooxygenase pathways Cyclooxygenase Thromboxane A2 synthase Thromboxane A2 receptor Thromboxane A2 synthase & receptor ? ADP ? Thrombin. ? Serotonin ? Platelet-activating factor ? Phosphodiesterase ? Glycoprotein IIb/IIIa receptor. Aspirin Dazoxiban Thromboxane A2 receptor blocker Ridogrel Ticloipidne, clopidogrel, P2T-receptor antagonists Hirudin, hirulag, argatroban, small- molecule inhibitors, thrombin-receptor antagonists Ketanserin Platelet-activating factor antagonists Dipyridamole, caffeine RGD- mimetics (intravenous & oral). 29.

(30) 第十節研究目的與動機如第一節所述，2-phenyl-4-quinolones (PQ)化合物是一類新型抗有絲分裂抗癌物質 ( novel antimitotic agents)。過去本實驗室合成了數以百計之 PQ 類緣化合物並檢討其 inhibition of tubulin polymerization (ITP)及 cytotoxicity，由所建立的結構與活性關係 (structure –activity relationships) 得知其基本骨架 2-phenyl-4-quinolone 的第 6 位與 3' -位上若有帶未共用電子對官能基，例如 OCH3 、Cl、F 等官能基，則其 ITP 及 cytotoxicity 均會大幅加強。然而過去文獻上所報導的 2-phenyl-4-quinolone 類 antimitotic agents，其脂溶性偏高，不易溶解於生物體內之水溶液，難以到達標的細胞，故進行動物試驗及將來臨床應用上均有不便之處。所以本研究中著者也企圖將標的化合物之第三位引進-COOH 親水性官能基，期待能獲得更具開發潛力的水溶性新型 PQ 類 antimitotic agents。另一方面，這類化合物對微管聚合作用有顯著且強效之結果，然而其作用於微管的位置雖有文獻指出是與 colchicine 結合位置相同，但是真正的結合點仍未相當明確。因此著者欲藉由電腦分子模擬方法(Catalyst)來探討 2-phenyl-4-quinolone 類衍生物與微管蛋白結合時的 pharmacophore，進而設計更具潛力的抗微管聚合類的抗癌化合物。另外亦將 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid 類化合物提供抗發炎、抗過敏及抗血小板活性測試。. 30.

(31) 第二章研究經過第一節化學合成為考量能在 3' 位及 6 位取代有較多之變化，因此本研究之標的化合物的合成途徑 (Scheme 5)係參照 1946 年 R. C. Elderfield 等學者所提之方法 40 而擬定，遂將各中間體及標的化合物之合成途徑及結構鑑定分述如下： R1. O R1. NH2. + Cl. O. R. T.. C. R2. Toluene. 1-4. 5-8. R1. 5. R 2 = F 6. R 2 = Cl 7. R 2 = OCH3. 1. =F 2. R1 = Cl 3. R1 = OCH3 4. R1 = H. NH. 9-20. R2. 9. R1 = F, R2 = F. 15. R1 16. R1 17. R1 18. R1 19. R1. 10. R1 = F, R2 = Cl 11. R1 = F, R2 = OCH3. 8. R 2 = H. 12. R1 = F, R2 = H 13. R1 = Cl, R2 = F 14. R1 = Cl, R2 = Cl. 20. R1 = H, R 2 = H. R1 Cl. = Cl, R2 = OCH3 = OCH3, R2 = F = OCH3, R2 = Cl = OCH3, R 2 = OCH3 = OCH3, R2 = H. H5C 2 O O C. R1. COOC2 H5. 110 ℃. PCl5 R2 110-140 ℃. N. reflux. R2 NH. 9a-20a. Na. +. C 2 H5OH. 22-33. Toluene. C 2 H5O N a. COOC2 H5. Diethyl malonate NaCH. 50 ℃. 150-170 ℃. COOC2 H5. 21 O. O R1. R1. COOC2 H5 + N. N. H. H. 34-45. 46-49. R2 34. R1 = F, R2 35. R1 = F, R2 36. R1 = F, R2 37. R1 = F, R2 10 % NaOH. =F = Cl = OCH3 =H. 38. R1 = Cl, R2 = F 39. R1 = Cl, R2 = Cl. 40. R1 = Cl, R2 = OCH3 41. R1 = OCH 3, R2 = F 42. R1 = OCH3, R2 = Cl 43. R1 = OCH 3, R2 = OCH3. R2. 46. R1 = F, R2 = F 47. R1 = F, R2 = Cl 48. R1 = F, R2 = OCH3 49. R1 = Cl, R2 = Cl. 44. R1 = OCH 3, R2 = H 45. R1 = H, R 2 = H O. O COOH. R1. R1. COOH3NC(CH2 O H )3. Tromethamine. 50-60. N. N. H. H. 61-71. R2 50, 61. R1 = F, R2 = F 51, 62. R1 = F, R2 = Cl 52, 63. R1 = F, R2 = OCH3 53, 64. R1 = F, R2 = H 54, 65. R1 = Cl, R2 = F 55, 66. R1 = Cl, R2 = Cl. 56, 67. R1 = Cl, R2 = OCH3 57, 68. R1 = OCH 3, R2 = F 58, 69. R1 = OCH3, R2 = Cl 59, 70. R1 = OCH 3, R2 = OCH3 60, 71. R1 = OCH 3, R2 = H. Scheme 5 31. R2.

(32) （一）3, 4'-Substituted N-phenylbenzamides (9-20)之合成 R1 O. O R1. NH 2. + Cl. R. T.. C. NH. Toluene. 5-8. 1-4. 9-20. R2. R2 1. R1 = F 2. R1 = Cl 3. R1 = OCH3 4. R1 = H. 9. R1 = F, R2 = F. 5. R2 = F 6. R2 = Cl 7. R2 = OCH3 8. R2 = H. 10. R1 = F, R2 = Cl 11. R1 = F, R2 = OCH3 12. R1 = F, R2 = H 13. R1 = Cl, R2 = F 14. R1 = Cl, R2 = Cl. 15. R1 = Cl, R2 = OCH3 16. R1 = OCH3, R2 = F 17. R1 = OCH3, R2 = Cl 18. R1 = OCH3, R2 = OCH3 19. R1 = OCH3, R2 = H 20. R1 = H, R2 = H. Schem. e6 此類化合物之合成以 3-chloro-N-(4-methoxyphenyl)benzamide (17)為例說明如下：如 Scheme 6 所示，以 4-methoxyaniline (3)為起始原料，甲苯為溶媒，滴加 3-chlorobenzoyl chloride (6)進行 amide linkage，過濾後取濾液，濃縮濾液所得之粗產物經 95％乙醇再結晶，即可得化合物 17 之白色固體。化合物 17 之結構鑑定：化合物 17 為針狀結晶，熔點為 146-148 ℃。質譜(Chart 17-1)：MS 圖譜上有分子離子峰 261 (M+• )、263 (M+2)等峰線，亦可由峰線中發現有 CH3 OC6 H4 NH (m/e 122)及 ClC 6 H4 CO (m/e 139)等斷裂，與預期相符。 IR 圖譜(Chart 17-2)：在波數 3345 cm-1 有二級醯胺官能基-NH 的伸展吸收, 在 1650 cm-1 有二級醯胺官能基-C=O 的吸收。 1. H NMR (DMSO-d6 , 200 MHz) δ(ppm)(Chart 17-3)：由積分值顯示此化合物有 12 個氫。從化學位移大致可確定化學位移δ3.73 (3H, s)為 4'-OCH3 ，最低磁場δ10.25 (1H, br)為 NH 之訊號，在δ6.90-8.03 為芳香環上的氫共 8 個。由訊號分裂模式、偶合常數及 H-H COSY 圖譜(Chart 17-5)可看出δ6.93 與δ7.71 有 3 JHH coupling correlation，因此再依誘導效應將δ6.93 (2H, d, J = 9.0 Hz)與δ7.71 (2H, d, J = 9.0 Hz)分別歸屬為 H-3'、H-5'及 H-2'、H-6'的訊號；δ7.51 分別與 δ7.60、δ7.93 皆有 JHH coupling correlation 的關係，故δ7.51 (1H, t, J = 7.5 Hz) 應為 H-5 之訊號，δ7.60 (1H, d, J = 6.5 Hz) 歸屬為 H-4 之訊號，而 7.93 (1H, d, J = 7.4 Hz) 的化學位移則屬於 H-6 的訊號，而最後將δ8.02 (1H, br-s)歸屬為 32.

(33) H-2 之訊號。 13. C NMR (DMSO-d6 , 50 MHz) δ(ppm) (Chart 17-4)：顯示有 12 個碳原子訊號，但由預期的分子式得知應有 14 個碳，推測可能是結構上有二組對稱碳(C-3'、C-5' & C-2'、C-6')且由峰線訊號高度為一般訊號二倍，因而在碳譜上顯現 12（= 14- 2）個碳原子訊號。初步判斷δ55.23 為 4'-OCH3 ；最低磁場的δ163.73 來自 C=O 而δ155.87 為 C-4’的訊號；芳香環上對稱的 C-3'、C-5'及 C-2'、C-6' 因分別受到 4'-OCH3 及 NH 的誘導效應故依序歸屬為δ113.84 及δ122.23。再由 13. C-1 H COSY 圖譜(Chart 17-6)依循與氫譜之 1 JCH correlation 將化學位移δ. 126.44、δ127.48、δ130.33、δ131.25 依序歸屬為 C-6、C-2、C-5、C-4 的訊號。由 HMBC 圖譜(Chart 17-7)可將與δ6.93 (2H, d, H-3’, H-5’)有 3 JCH coupling correlation 之δ132.08 訊號歸屬為 C-1’；δ133.37、δ137.13 皆與δ7.51 (1H, t, H-5) 有 3 JCH coupling correlation，因此δ133.37、δ137.13 是屬於 C-3、C-1 的訊號，但由以上圖譜仍無法確定 C-3 是否為δ133.37；δ155.87 與δ7.71 (2H, d, H-2’, H-6’)有 3 JCH coupling correlation，故歸屬為 C-4'。綜合以上圖譜數據分析，可以確定化合物 17 應為 3-chloro-N-(4-methoxyphenyl)benzamide。將其圖譜資料整理如下：. 33.

(34) MeO. 3' 4'. 2'. O. 1'. 5'. 2 N. 6'. H. 1. 3 4. 6 5. 17. Cl 1. position 1 2. H. C CH. 3 4 5 6 1' 2'. C CH CH CH C CH. 3' 4' 5' 6'. CH C CH CH. 6.93 (d, 9.0). 3'-OCH3 NH C=O. OCH3 NH C=O. 3.73 (s) 10.25(br). 8.02 (m). 7.60 (d, 6.5) 7.51 (t, 7.5) 7.93 (d, 7.4) 7.71 (d, 9.0). 6.93 (d, 9.0) 7.71 (d, 9.0). 13. C 137.37 127.48 133.37 132.08 130.33 126.44 131.25 122.23 113.84 155.87 113.84 122.23. 1. H-1 H COSY. HMBC C-6 (3 J), C-1 (2 J), C=O (3 J). H-5 H-4, H-6 H-5 H-3' H-2' H-6' H-5'. C-1 (3 J), C-3 (3 J) C-2 (3 J), C-4 (3 J) C-4' (3 J), C-6' (3 J), C-1' (2 J) C-1' (3 J), C-5' (3 J) C-1’ (3 J), C-3' (3 J) C-4' (3 J), C-2' (3 J), C-1' (2 J). 55.23 C=O (2 J) 163.73. 其餘 3, 4'-substituted N-phenylbenzamides 類中間產物之合成方法均仿照化合物 17，其物理常數及光譜數據記於 Table 28。. 34.

(35) （二）Ethyl 3',6-substitued-2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylate (34-49)之合成 R1. R1. O. Cl. PCl5 R2. NH. R2. 110-140 ℃ N. 9-20 9. R1 = F, R2 = F 10. R1 = F, R2 = Cl 11. R1 = F, R2 = OCH3 12. R1 = F, R2 = H 13. R1 = Cl, R2 = F 14. R1 = Cl, R2 = Cl. 9a-20a 15. 16. 17. 18. 19. 20.. R1 = R1 = R1 = R1 = R1 = R1 =. Cl, R2 = OCH3 OCH3, R2 = F OCH3, R2 = Cl OCH3, R2 = OCH3 OCH3, R2 = H H, R2 = H COOC 2H5. Na + C 2H5OH. C2H 5ONa. Diethyl malonate NaCH. 110 ℃. Toluene. reflux COOC2H 5. 21 H 5C2OOC. R1. COOC2H 5. R2 NH. 22-33. 150-170 ℃. 22. R1 = F, R2 = F 23. R1 = F, R2 = Cl 24. R1 = F, R2 = OCH3 25. R1 = F, R2 = H 26. R1 = Cl, R2 = F 27. R1 = Cl, R2 = Cl O R1. 28. R1 = Cl, R2 = OCH3 29. R1 = OCH3, R2 = F 30. R1 = OCH3, R2 = Cl 31. R1 = OCH3, R2 = OCH3 32. R1 = OCH3, R2 = H 33. R1 = H, R2 = H. O COOC2H 5. R1 +. N. N. H. H. 34-45 34. R1 = F, R2 = F 35. R1 = F, R2 = Cl 36. R1 = F, R2 = OCH3 37. R1 = F, R2 = H 38. R1 = Cl, R2 = F 39. R1 = Cl, R2 = Cl. 46-49 R2 40. R1 = Cl, R2 = OCH3 41. R1 = OCH3, R2 = F 42. R1 = OCH3, R2 = Cl 43. R1 = OCH3, R2 = OCH3 44. R1 = OCH3, R2 = H. R2 46. R1 = F, R2 = F 47. R1 = F, R2 = Cl 48. R1 = F, R2 = OCH3 49. R1 = Cl, R2 = Cl. 45. R1 = H, R2 = H. Scheme 7 如 Scheme 7 所示，此類化合物之合成以 ethyl 6-fluoro-3'-methoxy-2-phenyl-4quinolone-3-carboxylate (36)為例說明如下：秤取11與PCl5 加熱迴流進行氯化反應，得到橙黃色液體carboximidoyl chloride （11a）。另外秤取金屬鈉溶於無水乙醇製備乙醇鈉，爾後再與diethyl malonate形成白色膠狀的sodium diethyl malonate（21）。 35.

(36) 將化合物11a與21混合於無水甲苯中加熱迴流，得diethyl [[(4-fluorophenyl)amino](3-methoxyphenyl)methylene]malonate (24)深黃色液體。將未純化之粗產物24以加熱環化方式得到乳白色固體，經由管柱層析純化，依極性由小到大分別得二個白色固體化合物 36、化合物48。（壹）化合物 36 之結構鑑定：化合物 36 為白色綿絮狀晶形，熔點為 214-216 ℃。質譜(Chart 36-1)：MS 圖譜上有分子離子峰 341 (M+• )峰線，得知化合物 36 分子量與預期相符。 IR 圖譜(Chart 36-2)：在波數 1711 cm-1 有官能基-C=O 的吸收。 1. H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ(ppm) (Chart 36-3)：由積分值顯示此化合物有 16 個氫。由化學位移大致可確定在最高磁場的三個訊號中的δ0.95 (3H, t, J = 7.0 Hz) 及δ3.99 (2H, q, J = 7.0 Hz)分別歸屬為 CH3 及 CH2，δ3.86 (3H, s)為 3'-OCH3，最低磁場的δ12.20 (1H, br)為 NH。在δ7.12-7.79 的訊號為芳香環上的氫共有 7 個。由訊號分裂模式、偶合常數、誘導效應及 1 H-1 H COSY 圖譜(Chart 36-4, 36-5 )可看出δ7.12-7.15 (3H, m)為 H-2',4', 6'，δ7.47 (1H, dd, J = 9.1, 8.2 Hz) 為 H-5'，δ7.63 (1H, ddd, J = 8.8, 8.8, 3.1 Hz)為 H-7，δ7.75-7.79 (2H, m)則為 H-5、H-8 之訊號。. 13. C NMR (DMSO-d6 , 100 MHz) δ(ppm) (Chart 36-6)：顯示有 24 個碳原子訊號，但由預期的分子式得知應有 19 個碳，推測可能是鄰近氟原子的五個碳原子與氟產生偶合，故在碳譜上顯現 24（= 19 + 5）個訊號。首先初步判斷最高磁場的δ 13.85、δ60.52 為 CH3 及 CH2 的訊號，δ55.61 為 3'-OCH3 ，而最低磁場的δ 173.09 為 C=O（C-4）的訊號。. HMQC 圖譜(Chart 36-7)：依循與氫譜之相關性，推測δ121.53 (J = 25.5Hz)為 C-7，δ 130.17 為 C-5'的訊號；而δ120.61、δ116.17、δ113.97 由於受到 3'-OCH3 的影響，依序歸屬為 C-6'、C-4'及 C-2'。再者δ109.29 (J = 22.25 Hz)及δ121.52 (J = 8 Hz)，分別受到氟原子之 2 JCF coupling 及 3 JCF coupling correlation，呈現 double split 的訊號，故此二支訊號依偶合常數大小分別歸屬為 C-5 及 C-8。 HMBC 圖譜(Chart 36-8, 36-9)：用以推測其他三級碳與四級碳的碳訊號。首先，δ166.33 36.

(37) 與-COOEt 之 CH2 有 3 JCH 遠程偶合關係（3 JCH long-range coupling correlation），故歸屬為-COOEt 之 C=O；而 C-3'及 C-2 皆與 H-2'、H-4'及 H-6' (δ 7.12-7.15) 有 3 JCH correlation，其中 C-2 又受到鄰近氮原子的影響會出現在較低磁場且 C-2 與 H-5' (δ7.47)亦有 3 JCH correlation，所以分別將δ159.56、δ 149.46 歸屬為 C-2 及 C-3'。另外δ135.04 與 H-5' (δ7.47)有 3 JCH correlation，故歸屬為 C-1'之訊號。至於 4 個四級碳，其中與 H-5、H-7 有 3 JCH correlation 的δ136.51 為 C-9 的訊號；而與 H-8 有 3 JCH correlation 且受到氟原子之 3 JCF coupling 而分裂為二支訊號的δ126.06 (J = 6.75 Hz)，則歸屬為 C-10。其餘 2 個碳訊號中 C-6 因因受到氟原子拉電子與 1 JCF coupling 效應，偶合常數大至 241.6 Hz，故δ161.39 及δ159.39 皆屬於 C-6 的訊號。最後剩餘的一個碳訊號 δ114.98 應歸屬為 C-3。綜合以上圖譜數據分析，可以判定化合物 36 應為 ethyl 6-fluoro-3'-methoxy-2-phenyl-4-quinolone-3- carboxylate。將其圖譜資料整理如下：. 37.

(38) O F. 5. 4. 6 10 9 7 8. O 3. O. 2. CH2. CH3. 6'. 1 N. 1'. H. 2'. 5' 4' 3'. 36. OCH3. ' 13. NH C C C CH. H (400 MHz) 12.02 7.75-7.79 (m). 6 7 8 9 10 1' 2'. C CH CH C C C CH. 7.63 (ddd, 8.8, 8.8, 3.1) 7.75-7.79 (m) 7.12-7.15 (m). 159.63 (d, 1 J CF = 241.7 Hz) 122.17 (d, 2 J CF = 25.25 Hz) 122.61 (d, 3 J CF = 8.0 Hz) 137.15 126.75 (d, 3 J CF = 7.0 Hz) 135.68 114.61. 3' 4'. C CH. 7.12-7.15 (m). 150.11 116.81. H-5'. 5' 6'. CH CH. 7.47 (dd, 9.2, 8.3) 7.12-7.15 (m). 130.82 121.26. H-4', H-6' H-5'. 3'-OCH3 CH2 CH3 COO. OCH3 CH2 CH3 COO. 3.86 (s) 3.99 (m, 7.2) 0.95 (m, 7.2). 61.17 56.25 14.49 166.96. CH3 CH2. position 1 2 3 4 5. 1. 1. C (100 MHz). 160.03 115.63 173.73 109.94 (d, 2 J CF = 22.4 Hz). H-1 H COSY. H-5. H-8, H-5 H-7. HMBC. C-9 (3 J), C-6 (2 J), C-4 (3 J) C-9 (3 J) C-10 (3 J). C-4' (3 J), C-6' (3 J), C-2 (3 J), C-3' (2 J) C-2' (3 J), C-6' (3 J), C-3' (2 J) C-1' (3 J) C-2' (3 J), C-4' (3 J), C-2 (3 J) COO (3 J) CH2 (3 J). 其餘 ethyl 3',6-substitued-2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylate 化合物之合成方法均仿照化合物 36，其物理常數及光譜數據記於 Table 29。. 38.

(39) （貳）化合物 48 之結構鑑定：副產物化合物 48 為白色粉末，熔點為 236-238 ℃ (decomposition)。質譜圖譜(Chart 48-1)：MS 圖譜上有分子離子峰 269 (M+• )峰線。 IR 圖譜(Chart 48-2)：在波數 3455 cm-1 有二級官能基-NH 的伸展吸收, 在 1600 cm-1 附近未觀察到官能基-C=O 的吸收，推測可能是第 4 位置-C=O 形成 enol form。 1. H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ(ppm) (Chart 48-3)：由積分值顯示此化合物有 12 個氫。由化學位移大致可確定在高磁場的δ3.86 (3H, s)為 3'-OCH3 、δ11.84 為 NH (1H, br) 的訊號，而δ6.40 (1H, s)歸屬為 H-3 的訊號，在δ7.16-7.83 則為芳香環上的氫共 7 個。與化合物 36 相較結果發現氫譜上已無 COOEt 之乙基訊號，且在多了一個δ6.37(1H, s, H-3)的訊號，故由以上圖譜數據分析，大致可以判定化合物 48 應為 6-fluoro-3'-methoxy-2- phenylquinolin-4-one。將其圖譜資料整理如下： O F. 5. 4. 6. 3 10 9. 7 8. 2. 6'. 1 N. 1'. H. 2'. 5' 4' 3'. 48. OCH3. position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 3'-OCH3. NH C CH C CH C CH CH C C C CH C CH CH CH OCH3. H (400 MHz) 11.84. H-H COSY. 6.40 7.73. H-5. 7.59 7.82. H-8, H-5 H-7. 7.36-7.40 7.36-7.40 7.50 7.16 3.86. 39. H-5' H-4', H-6' H-5'.

(40) （參）反應結果之檢討：原本預期之產物為只有酯類化合物，但是在第 6 位如為 fluoro 或 chloro 取代，較容易有其他副產物（如 46-49）產生，將其可能之機轉闡述如下：由於溶媒中的水分未完全去除，使殘留的水分在鹼性下形成氫氧根離子，部分酯官能基因而變成酸的官能基，加熱環化形成第三位是酸基的 2-phenyl-4-quinolone，而部分之 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid 在高熱下脫去二氧化碳形成第三位沒有取代的 2-phenyl-4-quinolone。(Scheme 8) OH -. O. O R6. R6 Cl. H5C2OOC. CH 2CH3 O. 110 ℃ R3 '. R3 ' NH. N. R6. COOC 2H5. 150-170 ℃ N H. Toluene R3 ' COOC2H 5 Na + C2H 5OH. NaCH. C2H 5ONa. COOC 2H 5. 21. O R6. OH. H5C2OOC. CH 2CH3 O R3 '. NH. O R6. H5C2OOC OH R3 ' NH. 150-170 ℃ -CO 2 O R6. R6. H 5C2OOC. H. 150-170 ℃ R3 ' N. NH. H. R3 '. Sc heme 8. 為了證實我們的推想，著者將化合物 23 粗產物進行管柱層析法分離後，共獲得 2 個中間產物(I, II)，並初步以 1 H 及 1 H- 1 H COSY 確定其結構，分析結果如下：. 40.

(41) CH3. CH 3 O. O H. F. O. F. O. O. NH. (I). O. CH3. NH. ( II ). Cl. Cl. （A）N-[(E)-1-(3-chlorophenyl)-2-ethoxycarbonylvinyl]-N-(4-fluorophenyl)amine ( I) 1. H NMR 圖譜(Chart I-1)由積分值顯示化合物 I 含有 15 個氫，由化學位移大致可確. 定最高磁場的δ1.31(3H, t, J = 7.2 Hz)為 CH3 ，δ4.20 (2H, t, J = 7.2 Hz)為 CH2 的訊號， δ4.99 (1H, s)為 H-2，位於最低磁場的δ12.56 (1H, s)歸屬為 NH 的訊號，而在化學位移 δ6.64-7.36 附近為芳香環上的氫共 8 個。由於第 4'位為氟原子，而使的訊號分裂較為複雜難以觀察出偶合的情形，故再以 1. H- 1 H COSY 圖譜(Chart I-2, I-3)輔助芳香環上氫的訊號歸屬。由 1 H- 1 H COSY 可以看出. δ6.66 與δ6.81 互相偶合，δ7.16 與δ7.29 互相偶合，因此初步判斷δ6.66 為 H-3', H-5' 的訊號，δ6.81 (2H, m)為 H-2', H-6'的訊號，δ7.16-7.18 (2H, m)為 H-5, H-4 的訊號，而 7.27-7.30 (1H, m)則為 H-6 的訊號，最後將 H-2 歸屬為δ7.36 (1H, m)。故化合物 I 之化學結構應為 N-[(E)-1-(3-chlorophenyl)-2-ethoxycarbonylvinyl]-N-(4-fluorophenyl)amine。. （B）N-[1-(3-chlorophenyl)-2,2-diethoxycarbonylvinyl]-N-(4-fluorophenyl)amine ( II；23) 1. H NMR 圖譜(Chart 23-1)由積分值顯示化合物 II 含有 19 個氫，與化合物 I 相較結. 果，多了一套 OCH2 CH3 氫的訊號，而且屬於 H-2 的訊號δ4.99 (1H, s) 在此並不復見。故化合物 II 之化學結構應為 N-[1-(3-chlorophenyl)-2,2-diethoxy carbonylvinyl]-N-(4-fluorophenyl)amine。從上述結果可以得知在N-phenylbenzamides與sodium diethyl malonate反應為diethyl [anilino(phenyl)methylene]malonates時，易受到水解而有副產物的形成，而使產率降低。. （三）3',6-Substitued-2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acids (50-60)之合成. 41.

(42) O. O R1. R1. COOC 2H5. COOH. 10 % NaOH N. N. H. H. 50-60. 34-44. R2. R2 34, 50 R 1 = F, R 2 = F 35, 51 R 1 = F, R 2 = Cl 36, 52 R1 = F, R 2 = OCH 3 37, 53 R1 = F, R 2 = H 38, 54 R 1 = Cl, R 2 = F 39, 55 R 1 = Cl, R 2 = Cl. 40, 56 R1 = Cl, R 2 = OCH 3 41, 57 R 1 = OCH 3, R2 = F 42, 58 R 1 = OCH 3, R 2 = Cl 43, 59 R 1 = OCH 3, R 2 = OCH 3 44, 60 R 1 = OCH 3, R 2 = H. Scheme 9 此類化合物之合成以 6-fluoro-3'-methoxy-2-phenyl-4-quinolone-3- carboxylic acid (52) 為代表說明如下：如 Scheme 9 所示，化合物 36 在 10％ Sodium hydroxide 鹼性溶液催化下，將酯類水解成酸基後得化合物 52。化合物 52 之結構鑑定：化合物 52 為白色固體，熔點為 231-233 ℃ (decomposition)。質譜：由分子離子峰 313 (M+•)峰線，得知化合物 52 分子量與預期相符。 IR 圖譜(Chart 52-1)：在波數 3450 cm-1 有二級胺官能基-NH 或 OH 的伸展吸收, 在 1679, 1617 cm-1 有官能基-C=O 的吸收。 1. H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ(ppm) (Chart 52-2)：由積分值顯示此化合物有 10 個氫。與化合物 37 之氫譜比對後，可明顯看出高磁場部分缺乏乙酯基團之δ0.95 (3H, t, J = 7.0 Hz, CH3 )及δ3.99 (2H, q, J = 7.0 Hz, CH2 )的訊號，其餘訊號分裂模式大致與化合物 37 相同，故可初步判斷 COOEt 應該已經水解。另外在δ 7.05-8.20 為芳香環上的 7 個氫中，H-5 及 H-8 的訊號解析度較佳，其中 H-8 因受到氟原子之 meta coupling 及 H-7 之 ortho coupling，而 H-5 受到氟原子之 ortho coupling 及 H-7 之 meta coupling，比較二者之偶合常數後，遂將偶合常數較大之δ7.87 (1H, dd, J = 9.2, 4.8 Hz)歸屬為 H-8，而δ7.87 (1H, dd, J = 9.0, 42.

(43) 2.8 Hz)則屬於 H-5 之訊號。 13. C NMR (DMSO-d6 , 50 MHz) δ(ppm) (Chart 52-3)：顯示有 21 個碳原子訊號，但由預期的分子式得知應有 17 個碳，推測可能是鄰近氟原子的五個碳原子與氟產生偶合，故在碳譜上顯現 21（= 17 + 4）個訊號。然而與化合物 36 之碳譜比對後，可發現高磁場部分缺乏乙酯基團之δ13.85 (CH3 )、δ60.52 (CH2 )及低磁場 δ166.33 (COOEt)的訊號，其餘訊號以及在氟原子鄰近受到偶合而分裂的碳訊號，大致與化合物 36 相同，因而可確定-COOEt 已經水解完成。依據以上圖譜數據分析，可以確定化合物 52 為 6-fluoro-3'-methoxy-2phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid。其餘第三位為 COOH 衍生物之化學合成方法均仿照化合物 52，其物理常數及光譜. 數據記於 Table 31。. 43.

(44) （. 四. ） 3',6-disubstitued-2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic tromethamine salts (61-71)之合成. acid. O. O R1. R1. COOH. COOH3NC(CH2OH)3. Tromethamine n -BuCl. N. N H. H. 50-60. 61-71. R2 50, 61. R1 = F, R2 = F 51, 62. R1 = F, R2 = Cl 52, 63. R1 = F, R2 = OCH3 53, 64. R1 = F, R2 = H 54, 65. R1 = Cl, R2 = F 55, 66. R1 = Cl, R2 = Cl. R2. 56, 67. R1 = Cl, R2 = OCH3 57, 68. R1 = OCH3, R2 = F 58, 69. R1 = OCH3, R2 = Cl 59, 70. R1 = OCH3, R2 = OCH3 60, 71. R1 = OCH3, R2 = H. Scheme 10 此類化合物之合成方法係參照 1985 年 B. D. Anderson 製備 NSAIDs 藥物之 tromethamine 鹽類的方法 105 ，茲於此以 6- fluoro-3'-methoxy-2-phenyl-4-quinolone3-carboxylic acid tromethamine salt (63)為例說明如下：如 Scheme 10 所示，所示，化合物 52 滴加於 tromethamine 之 butyl chloride/methanol ( 4：1)溶液中攪拌均勻後，過濾除去溶媒即得鹽類化合物 63。化合物 63 之結構鑑定：化合物 63 為片狀固體，熔點為 222-224 ℃ (decomposition)。質譜：由於化合物 63 為鹽類，故無法由質譜判斷其分子量。 IR 圖譜(Chart 63-1)：在波數 3430 cm-1 有寬廣且 broad 的 NH 及 OH 的伸展吸收。 1. H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ(ppm) (Chart 63-2)：由積分值顯示此化合物有 16 個氫，雖然應有 23 個氫，其中分別接在第一位氮、第三位酸基的氫及 tromethamine 上 amine 的二個氫共有 4 個氫未在氫譜上觀察到。而δ5.13 (3H, br)為 tromethamine 之 OH 的三個氫，δ3.74(6H, br)為 tromethamine 之 CH2 的六個氫。其餘的訊號均與化合物 52 相似。. 13. C NMR (DMSO-d6 , 50 MHz) δ(ppm) (Chart 63-3)：顯示有 21 支碳峰線訊號，與 013-3 碳譜比對後，在高磁場部分多了一支高度為其他峰線 3 倍的δ59.87 及δ60.79 的訊號，將其歸屬為 tromethamine 之 3 個 CH2 及四級碳。綜合以上圖譜數據分析，可以確定化合物 63 應為 6-fluoro-3'-. 44.

(45) methoxy-2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid tromethamine salt。其餘 3',6-disubstitued 2-phenyl-4-quinolone-3-carboxylic acid tromethamine salt 類化合物之合成方法均仿照化合物 63，其物理常數及光譜數據記於 Table 32。. 45.

(46) 第二節 2-Phenyl-4-quinolone 類衍生物之藥效基團(pharmacophore)的建構研究背景由於電腦分子模擬的技術日新月異，利用電腦來輔助藥物的設計與開發，儼然成為時代之趨勢，不但可節省新藥開發之龐大經費，更可縮減開發的時間，是一種研發藥物的利器之一。將藥效基團 pharmacophore 的觀念應用於藥物開發之構想，最早為 Paul Ehrlich 為運用 chromophore 來發展染料 106 ，而意外地發現這些結構可用於治療因錐形蟲 (trypanosomones)所引起的非洲昏睡病(African sleeping sickness)。之後應用電腦分子模擬的技術來開發藥物的文獻 107 如雨後春筍般地被陸續報導出來。由 MSI 公司發展的 CatalystT M 軟體(San Diego-based Accelry’s program)已利用 ligand-base drug design 的方式 108-109 成功地建立 5-HT110 、a-adrenoceptor111 及 cyclooxygenase-2112 等藥物之 pharmacophore。反觀抑制微管蛋白聚合的抗癌物中結合位置較為確定的有 colchicine、taxol、vinca alkaloid，然而從過去本實驗室的研究結果看來，雖然 2-phenyl-4- quinolone 類對微管聚合抑制（ITP）有很強的作用，但是從測試這類化合物競爭性抑制 colchicine 結合（inhibition of colchicine binding; ICB）的數據看來，著者認為 2-phenyl-4-quinolones 類之 ITP 與 ICB 並沒有明顯相互對應的關係，所以我們推測此類化合物作用於微管的結合位置可能與 colchicine 不同，而引發我們對 PQ 類緣化合物作用在微管蛋白的藥效集團（pharmacophore）很大之興趣，因此我們從數百個化合物中挑出十六個化合物作為試驗模組（training set），利用分子電腦模擬軟體 CatalystT M 來架構其作用的 pharmacophore。. 46.

(47) 藥效集團的建立 113 （一）Training set 之化合物的篩選化合物的篩選相當重要，該如何選擇理想的 training set 之化合物有下列原則可以遵循： 1. 至少需要 14 個化合物以上才符合統計上的意義。選擇結構差異性大且具有活性的物質，或是抑制活性雖然不好但是結構特異具代表性的化合物。挑選出的每一個化合物結構應均能提供 Catalyst 最為新的資訊，故應避免重複無意義的物質，或是無法產生新的化學基團特性的化合物。 2. 化合物中活性最好與最差的大小數值要差距 4 個等級，也就是需差距 104 倍。而且每個等級的化合物至少要有 3 個代表性化合物。 3. 若兩個結構相近的化合物時，兩者活性差異必須要大些，否則只挑選兩者中活性表現好的。 4. 若兩個化合物的活性相近時，則兩者必須是結構差異大，否則只挑選兩者中活性表現好的。在廣泛網羅作用在微管蛋白抑制的物質，經過不斷的 training set 的多種組合後，我們發現結果並不理想，因此我們修正 2-phenyl-4-quinolones 類 training set 之化合物的篩選原則中結構差異性大的原則，我們的考量有下列二點： 1. 正如背景所提，微管的結合點有至少 3 個，雖然過去研究較傾向將 2-phenyl-4-quinolones 歸類於作用在 colchicine 結合位置，但是觀察抑制 colchicine 結合百分比(ICB)的數據如 Table 7 所示，似乎作用位置與 colchicine 並不完全相同 27 。故結構的選取未將 colchicine、podophyllotoxin 等作用在 colchicine binding site 的化合物列入考慮。 2. 文獻雖有許多結構相異卻同樣有抑制微管蛋白聚合作用的抑制劑，雖不是作用在已知的微管結合位置，但是其作用點亦不明確，故未將列入 training set。. 47.

(48) Table 7. Antitubulin effects of 2-phenyl-4-quinolones27 O R6. 5. 2' R7. 8. 3'. N H. R' 4'. 6' 5'. Compd. R6. R7. R2'. R3'. R4'. R5'. ITPa. R6'. ICBb. IC50 (µM) ± SD (% inhibition) ± SD. Q-13 OCH2 O H Q-14 OCH2 O H Q-15 OCH2 O H Q-16 OCH2 O OCH3 Q-17 OCH2 O H Q-18 OCH2 O H Q-19 OCH2 O H Q-20 OCH2 O H Q-21 OCH2 O H Q-22 OCH2 O H Q-23 OCH2 O OCH3 Q-24 OCH2 O OCH3 Q-25 OCH2 O H Q-28 OCH2 O F Q-29 OCH2 O Cl Q-30 H H H Q-31 H H H Q-32 H H H Q-33 H H H Q-34 OCH3 OCH3 H Q-35 OCH3 OCH3 H Q-36 OCH3 OCH3 H Q-39 OCH3 H H Q-42 OCH3 H H Q-43 OCH3 H H Colchicine Podophyllotoxin Combretastatin A-4 Dihydro Combretastatin A-4 a. H H H H OCH3 H OCH3 H H H H H H OPh H H N(CH3 )2 H N(CH3 )2 H H H CH3 H OCH3 OCH3 H OCH3 H OCH3 H OCH3 H H H OCH3 OCH2 O H H H H H H H N(CH3 )2 H H H N(CH3 )2 H OCH3 H H OCH3 OCH3 OCH3 H H H N(CH3 )2 H H OCH3 H H H OH H N(CH3 )2 H H OCH3 H H. H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H. 0.63 ± 0.2 > 40 0.57 ± 0.1 14 ± 0.5 > 40 > 40 0.7 ± 0.03 1.0 ± 0.2 > 40 0.62 ± 0.2 > 40 5.5 ± 0.8 1.1 ± 0.2 0.85 ± 1 0.89 ± 0.1 1.5 ± 0.3 > 40 1.4 ± 0.4 > 40 18 ± 1 15 ± 2 4.3 ± 1 5.6 ± 1 0.84 ± 0.2 0.74 ± 0.1 0.80 ± 0.07 0.46 ± 0.02 0.53 ± 0.05 0.63 ± 0.03. ITP: inhibition of tubulin polymerization; b ICB: inhibition of colchicine binding site. 48. 26 ± 10 39 ±8. 29 ± 7 12 ± 8 31 ± 2. 37 ± 3 24 ± 4. 18 ± 6 13 ± 2 86 ± 1 94 ± 2 65 ± 4 65 ± 4.

(49) 依據以上二點，因此從過去本實驗室所合成的化合物中挑出適當的做為 training set 的候選化合物(candidates)。. （二）Hypothesis 之建立將化合物在 View compound Workbench 的視窗下輸入 2D 結構，在經 2D beautify、3D beautify 及 3D minimization 後，初步得到能量最適化的 3D 立體結構。接著在 Generate conformation model 功能視窗下，設定每個化合物之構型能量變化在 20 Kcal mol-1 的範圍內，最大的構型數量為 250 個，以”best conformer generation”（最精確計算的模式）的功能，建立所有可能的分子構型(conformer)。. 再將所有已建立分子構型的化合物，. 在 Generate Hypothesis Workbench 將所有化合物之活性數據輸入如此即完成。最後將 training set spreadsheet 的資料以” hypothesis generate”的功能，每個化合物結構間的相異度似乎差異不多，觀察選定的化合物有可能之作用官能基為氫鍵接受者 (hydrogen bond acceptor；HBA)、氫鍵供給者(hydrogen bond donor；HBD)、芳香環(aromatic ring)、厭水性基團(hydrophobic group)等 4 個特徵(feature)。由選定不同的基團特徵，經過數次不同的組合檢討所得到的結果，著者發現氫鍵接受者是必須的基團，故設定 feature 中 HBA 的數量為 2 個而其餘的 HBD、hydrophobic group、aromatic ring 設定為 0-2 個，由電腦運算並選擇較佳的 feature 來建立 model。經由電腦軟體 Catalys t 統整、運算結果產生的假設性 pharmacophore 稱為 Hypothesis。最後結果得到 10 個 Hypothesis，其 Cost 值大小、方均根變異係數（root- mean square deviation, RMS）、correlation 及各個 Cost 的差異值如 Table 8 所示。. 49.

(50) O. O. O. O. O. O. H O. H O. N. O. N. H. H. S form. H. R form. ITP IC50 = 0.69µ M. ITP. ITP IC50 = 2.3µ M. OCH 3. IC50 =. OCH3. 0.57µ M. O. O O. OCH3. O O. OCH3 OCH 3. O. N. N. N. O. N. H. N H. H. OCH3 ITP IC50 = 5.5µ M. ITP IC50 >40µ M. ITP IC50 = 0.96µ M. OCH3. O. O. OCH3. O. CH3O F. F OCH3. O. OCH3. N. N. N HO. H. H. OCH3 ITP IC50 >40µ M. ITP IC50 >40 M. O. CH3. O. O. O H 2N. N N. H3 C. H ITP IC50 >40µ M. O. N. N. N. H. H ITP IC50 >40µ M. ITP IC50 >40µ M. OCH3. OO CH3 NNHCCNHCH-C 6H 5. OO CH3 6 H5 NNHCCNHCH-C O H O. H O. N H. N H. R form ITP IC50 >40µ M. ITP IC50 >40µ M. OCH3. S form ITP IC50 >40µ M. OCH3. Fig. 13. 十四個作為電腦分子模擬 training set 的化合物. 50. CF3.