蛋白質水解物之相關抗氧化活性探討

食物中所含的抗氧化物質除了可降低食物中之脂質氧化還可以抑制 人類由於脂質氧化作用所引發的疾病或是老化現象 (Ames, 1989)，人工合 成之抗氧化劑，如丙基沒食子酸 (n-propyl gallate)、BHA 和 BHT 早已在 食品工業上大量被利用於食品保存及抗氧化 (Halliwell et al., 1995)，雖然 可以有效延緩脂質氧化速率，但有文獻指出大量食用人工抗氧化劑之動物 會造成畸胎，或是引起癌症發生 (Branen, 1975)。因此，有許多學者想嘗 試開發安全與天然的的抗氧化物質，並了解其對人體的生理功效與作用機 制，以期能加以應用。

食物中的活性胜肽可利用酶水解，來切斷蛋白質的胜肽鍵而獲得的，

近年來有許多研究學者針對蛋白質水解物進行探討，蛋白質水解物可來自 於許多不同來源，像是海藻 (Sheih et al., 2009)，蛋黃 (Sakanaka et al., 2004)，

大豆蛋白 (Pena-Ramos and Xiong, 2003)，明蝦 (Suetsuna et al., 2000)，猪 肝 (吳，1998)，胡瓜魚 (Amarowicz and Shahidi, 1997)等，而這些蛋白質 水解物中都被發現具有抗氧化活性胜肽。目前常見抗氧化活性分析研究包 含抑制亞麻油酸過氧化作用 (inhibition of linoleic acid autoxidation)、還原 力 (reducing power)、亞鐵離子螯合能力 (metal ion chelating activity)、清 除 DPPH 自由基能力 (DPPH radical scavenging activity)、清除氫氧自由基 (hydroxyl radical)、總抗氧化能力 (trolox equivalent antioxidant capacity;

TEAC) 以及氧自由基吸收能力 (oxygen radical absorbance capacity; ORAC) 等，許多文獻中發現胜肽片段或蛋白質水解物相較於蛋白質或胺基酸有很 好的抗氧化活性，這表明胜肽在抗氧化系統中扮演了一個很重要的角色

【表 2-2】。例如：鯖魚肉以 protease N 水解後，測定其抗氧化活性，發現 水解物在 1,400 Da 之胜肽相較於 900 Da 及 200 Da 之胜肽具有較好的 抑制亞麻油酸過氧化作用 (6.5 天)、清除 DPPH 自由基能力 (15.4%) 及 還原力之吸光值為 0.08 (Wu et al., 2003)。將大豆蛋白分成加熱及未加熱 組，利用 pepsin、papain、chymotrypsin、alcalase、protamex 和 flavourzyme 水解，結果顯示其 DH 介於 1.7 ~ 20.6% 之間且抗氧化活性介於 28 ~ 65%，故可有效降低 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)，抑制 丙二醛 (malondialdehyde; MDA) 生成 (Pena-Ramos and Xiong, 2002)。

Chen et al. (1995) 研究經大豆蛋白質水解物分離出 6 種活性胜肽，發現由 5 ~ 16 個胺基酸組成不等，其中包含了 N 端之 Val 和 Leu 以及序列中 之 Pro、組胺酸 (histidine; His) 或 Tyr。利用魚的腸內酶 (mackerel intestine crude enzyme) 來水解 Alaska pollack，經薄膜過濾 (ultrafiltration; UF) 可 得 5 個區分物，其中又以分子量在 1 kDa 以下的胜肽具有較強的抗氧化 活性，再經分離純化後所得胺基酸序列為 Leu-Pro-His-Ser-Gly-Tyr，其分 子量約為 672 Da，且抑制氫氧自由基能力為 35% (53.6 μM)，顯示出小分 子量胜肽較具有較佳抗氧化活性 (Je et al., 2005)。鮪魚蒸煮液利用三種不 同蛋白水解酶 (protease XXIII、orientase、papain) 在其各適溫度 (依序為

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37℃、50℃、25℃) 進行水解，探討所得蛋白質水解物之還原力、TBARS、

清除 DPPH 自由基能力等抗氧化活性；結果發現所得三種指標皆以 protease XXIII 蛋白質水解物在水解 3hr 之抗氧化活性最佳，因此再利用 凝膠過濾法分劃，得 5 個主要區分物，其中以 B 和 C 區分物中的胜肽 物質擁有較佳的抗氧化特性，其分子量介於 390 ~ 1,400 Da，接者再利用 HPLC 分離 B 和 C 區分物中的胜肽物質，最後定序後，可分別得到 Pro-Ser-His-Asp-Ala-His-Pro-Glu 、 Ser-His-Asp-Ala-His-Pro-Glu 、 Val-Asp- His-Asp-His-Pro-Glu、Pro-Lys-Ala-His-Glu、Pro-Ala-Glu-Tyr、Pro-His-His- Ala-Asp-Ser、Val-Asp-Tyr-Pro 這 7 種抗氧化活性胜肽。這些胜肽幾乎是 由 4 ~ 8 個胺基酸殘基所組成，其中包括有 Val、絲胺酸 (serine; Ser)、Pro、

His、丙胺酸 (alanine; Ala)、天冬胺酸 (aspartic acid; Asp)、離胺酸 (lysine;

Lys)、麩胺酸 (glutamic acid; Glu)、甘胺酸 (glycine; Gly) 和 Tyr 等 10 種 不同的胺基酸殘基，其清除 DPPH 自由基能力為 66 ~ 81% (饒，2002)。

Chen et al. (1996) 根 據 大 豆 蛋 白 水 解 物 分 離 出 之 抗 氧 化 活 性 胜 肽 為 Leu-Leu-Pro-His-His，並合成出 28 種胜肽序列，研究發現移除 C 端的 His 會降低抗氧化活性，但移除 N 端的 Leu 則無影響。在胜肽序列中，

His 和 Pro 扮演著重要的抗氧化活性，在這些片段中又以 Pro-His-His 最 具抗氧化活性。另外，經由卵白水解物分離出的最佳抗氧化活性胜肽為 Ala-His-Lys，其抗氧化活性是受 Ala-His 影響而非 His-Lys 或是游離胺基 酸 (Tsuge et al., 1991)。

綜合以上結果均顯示，這些蛋白質水解物都具有抗氧化活性的特性，

且抗氧化活性特性與還原力、清除自由基能力及螯合金屬離子能力具有密 切的關係。通常具抗氧化活性胜肽分子量大約介於 500 ~ 1,800 Da (Jun et al., 2004; Kim et al., 2007; Ranathunga et al., 2006; Wu et al., 2003) 且 N 端 如有疏水性胺基酸 (Val 或 Leu) 或序列中含有 Pro、His、Ala、Tyr、Trp、

甲硫胺酸 (Methionine; Met) 和半胱胺酸 (Cysteine; Cys) 等胺基酸皆發現 具有抗氧化活性 (Chen et al., 1995; Elias et al., 2006; Kim et al., 2001;

Uchida and Kawakishi, 1992)，甚至有些抗氧化活性胜肽與 α-生育醇在亞麻 油酸 (linoleic acid) 乳化系統中之抗氧化活性相近 (Dong et al., 2008)。蛋 白質是由 20 個胺基酸排列組成，藉由彼此間交互作用可清除自由基。有 文獻指出芳香族胺基酸如: Trp 和 Tyr 具有抗氧化活性，因結構所含的吲 哚 (indolic) 和酚基 (phenolic) 環可當作氫的供應者或提供電子而清除自 由基，以形成更穩定的 indoyl 和 phenoxyl 自由基 (Hernandez-Ledesma et al., 2005; Suetsuna, 2000)。雖然抗氧化胜肽可有效清除自由基，機制尚未不 明。His 雙胜肽也發現具有抗氧化活性，可能原因是可貢獻氫原子來抑制 脂質過氧自由基誘發，此外，His 具有咪唑 (imidazole) 環可與金屬離子 螯合 (Chan et al., 1994)。蛋白質水解物之抗氧化活性與原料、蛋白酶種類、

水解度、胺基酸組成分、分子量及胜肽之胺基酸序列皆有關係 (Chen et al., 1998; Kim et al., 2001; Peña-Ramos et al., 2004)。其中蛋白酶的專一性是為 主要因素，酶之種類會直接影響水解時的胜肽結合位置與數目，進而影響 蛋白質的 DH 以及蛋白質水解物的特性，因此可藉由選擇蛋白酶來預先決 定蛋白質哪一部份會被分解，哪些胺基酸可以特別使用在特殊胺基酸之間 來分解，而哪些蛋白酶可以再任意胺基酸之間分解 (鄭，1999)。利用酶水 解的方式常用在製備活性胜肽，一般酶來源可分為來自微生物之 alcalase、

neutrase、flavourzyme；來自植物之 papain、bromelain、ficin；來自動物之 pepsin、trypsin (Guérard, 2007)。另外，【表 2-1】為常見的商業蛋白酶介紹。

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表 2-1 常見的商業蛋白酶介紹

Table 2-1 Lists of commercial proteases.

Enzyme Source Type of proteases Typical pH

range^a Preferential specificity^b 註

Pepsin

animals Ox, pig

aspartic protease 1-4 aromatic –COOH and NH2, Leu-, Asp-, Glu-COOH

酸性 蛋白酶

Trypsin serine protease 7-9 Lys-, Arg-COOH

Chymotrypsin serine protease 8-9 Phe-, Tyr-, Trp-COOH

Papain

Mixture of papain, chymopapain and lysozyme

serine protease 6-10 broad specificity, mainly hydrophobic -COOH

metalloprotease 6-8 Leu-, Phe-NH2 and other

中性

mixture of aspartic protease, metalloprotease, serine protease,

carboxypeptidase

4-8 very broad specificity

(Adler-Nissen, 1986)

a Indicated application conditions.

b Terminal amino acid after cleavage.

表 2-2 蛋白質水解物之抗氧化活性胜肽

Table 2-2 Protein hydrolysates of antioxidative peptides.

Source Enzyme Peptide sequence Scavenging activities of IC 50

* Reference

Venison papain

1.Met-Gln-Ile-Phe-Val-Lys-Thr-Leu-Thr-Gly (9,854 Da) 2.Asp-Leu-Ser-Asp-Gly-Glu-Gln-Gly-Val-Leu (11,213 Da)

Hydroxyl radical: 44 μg /mL DPPH radical: 77 μg /mL Superoxide radical: 217 μg/mL Peroxyl radical: 85 μg /mL

(Kim et al., 2009)

Chicken

essence TCA 萃取法

A1：His-Val-Thr-Glu-Glu

A2：Pro-Val-Pro-Ala-Glu-Gly-Val

Inhibition on autoxidation of linoleic acid (day):

1. Leu-Leu-Gly-Pro-Gly-Leu-Thr-Asn-His-Ala (1,076 Da) 2. Asp-Leu-Gly-Leu-Gly-Leu-Pro-Gly-Ala-His (1,033 Da)

DPPH radical scavenging activity:

1. 189.8 μM 2. 167.7 μM

(Byun et al., 2009)

Bullfrog

skin alcalase Leu-Glu-Glu-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Glu-Gly-Cys-Glu (1,487 Da）

DPPH radical: 16.1 μM hydroxyl radical: 12.8 μM superoxide radical: 34.0 μM peroxyl radical: 32.6 μM

(Qian et al., 2008)

Leu-His-Tyr (431.2 Da) DPPH radical: 63 ± 1.57%at 150 μg/mL (Bougatef et al., 2010)

DPPH radical: 41.37 μM hydroxyl radical: 17.77 μM peroxyl radical: 18.99 μM superoxide radical: 172.10 μM

(Kim et al., 2007)

Conger eel

muscle trypsin Leu-Gly-Leu-Asn-Gly-Asp-Asp-Val-Asn (928 Da) hydroxyl radicals: 74.1 µM carbon-centered radicals: 78.5 µM

(Ranathunga et al., 2006)

*IC50 means the half maximal inhibitory concentration.

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