第四章 結果
四、 鮪魚蛋白質水解物抗氧化活性物質的純化分離及其抗氧化活性
(一) 凝膠過濾法 (1) AMH
AMH 經凝膠過濾分離後可分出 4 個區分物 (AMH1 ~ AMH4) 【圖 4-11 B】，分別是 AMH1 (No. 12 ~ 22)、AMH2 (No. 23 ~ 35)、AMH3 (No. 36 ~ 41)、
AMH4 (No. 42 ~ 68)，分別將 AMH1 ~ AMH4 經多次收集、冷凍乾燥後，並 測 定 其 各 區 分 物 之 亞 鐵 離 子 螯 合 能 力 ( 濃 度 均 調 整 至 10 mg of dried extract/mL) 【圖 4-11A】，其依序結果為 74.73%、76.34%、72.87% 以及 72.79%，
在統計上，彼此間則無顯著性差異 (p>0.05)，但整體看來以 AMH2 的亞鐵 離子螯合能力為最佳，故本實驗則選用此區分物再做更進一步純化分離。
(2) PAH
PAH 經凝膠過濾分離後可分出 5 個區分物 (PAH1 ~ PAH5) 【圖 4-12B】， 分別 PAH1 (No. 11 ~ 15)、PAH2 (No.16 ~ 28)、PAH3 (No. 29 ~ 35)、PAH4 (No.36 ~ 42)、PAH5 (No. 43 ~ 60)，分別將 PAH1 ~ PAH5 經多次收集、冷凍 乾燥後，並測定其各區分物的亞鐵離子螯合能力 (濃度均調整至 10 mg of dried extract/mL) 【圖 4-12A】。其依序結果為 92.40%、79.43%、81.73%、88.92%
以及 77.92%。其中以 PAH1 的亞鐵離子螯合能力顯著高於其他區分物 (p <
0.05)，其次為 PAH4，最弱則為 PAH2。
由以上結果得知，鮪魚蛋白質水解物經凝膠過濾後所得的區分物皆具有 亞鐵離子螯合能力，且分子量皆落在 1,423 Da 以下，其中又以 AMH2 和 PAH1 亞鐵離子螯合能力為最佳。因此，推測鮪魚血合肉加工副產品中可能 具有抗氧化特性的良好的胜肽類物質，故接著再將 AMH2 和 PAH1 進行更 進一步的純化。
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圖 4-11 AMH 經 Sephadex G-25 凝膠過濾法分離後其亞鐵離子螯合能力 (A) 及沖提圖 (B)
Figure 4-11 Metal ion chelating activity (A) and elution profile (B) of AMH separated with gel filtration chromatography on Sephadex G-25.
1. Bars represent standard deviations from triplicate determinations.
2. Different letters on the bars of AMH indicate significant differences (p<0.05).
3. The column (2.5 × 50 cm) was equilibrated and eluted with 0.05 M, pH 6.5 phosphate buffer, at a flow rate of 42 mL/hr. Each fraction (10 mg of dried extract/mL) was used to determine the metal ion chelating activities.
1423 Da
圖 4-12 PAH 經 Sephadex G-25 凝膠過濾法分離後其亞鐵離子螯合能力 (A) 以及沖提圖 (B)
Figure 4-12 Metal ion chelating activity (A) and elution profile (B) of PAH separated with gel filtration chromatography on Sephadex G-25.
1. Bars represent standard deviations from triplicate determinations.
2. Different letters on the bars of PAH indicate the significant differences (p < 0.05).
3. The column (2.5 × 50 cm) was equilibrated and eluted with 0.05 M, pH 6.5 phosphate buffer, at a flow rate of 42 mL/hr. Each fraction (10 mg of dried extract/mL) was used to determine the metal ion chelating activities.
1423 Da
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(二) 高效能液相層析法 (1) AMH2
將凝膠過濾之區分物 AMH2 經高效能液相層析法再次分離後，從圖譜 則可看出 AMH2 可得到 6 個波峰 【圖 4-13B】，分別表示為 AMH2a ~ AMH2f，經多次收集、冷凍乾燥後，並測定其各區分物的亞鐵離子螯合能力 (濃度均調整至 0.5 mg of dried extract/mL) 【圖 4-13A】，其結果依序分別為 12.08%、12.05%、13.36%、13.49%、18.89% 以及 12.89%，其中 AMH2e 的 亞鐵離子螯合能力顯著高於其他區分物 (p < 0.05)。
(2) PAH1
將凝膠過濾之區分物 PAH1 經高效能液相層析法再次分離後，從圖譜則 可看出 PAH1 可得到 3 個波峰 【圖 4-14B】，分別表示為 PAH1a ~ PAH1c，
經多次收集、冷凍乾燥後，並測定其各區分物的亞鐵離子螯合能力 (濃度均 調整至 0.5 mg of dried extract/mL) 【圖 4-14 A】，其結果依序分別為 19.33%、
14.4% 以及 11.2%，其中 PAH1a 的亞鐵離子螯合能力顯著高於其他區分物 (p < 0.05)。
最後，再將亞鐵離子螯合能力最佳的 AMH2e 及 PAH1a 送至中國醫藥 大學貴重儀器室鑑定其抗氧化活性胜肽之胺基酸序列。
C h e la ti n g a c ti v it y ( % )
0 5 10 15 20 25 30
AMH2
AMH2a AMH2b AMH2c AMH2d AMH2e AMH2f a
b b
b b b
A
圖 4-13 AMH2 經高效能液相層析法純化後其亞鐵離子螯合能力(A) 以及 RP-HPLC 分析圖(B)
Figure 4-13 Metal ion chelating activity (A) and RP- HPLC elution patterns (B) of AMH2 purified by RP-HPLC.
1. Bars represent standard deviations from triplicate determinations.
2. Different letters on the bars of AMH2 indicate the significant differences (p <0.05).
3. It was applied to a RP-C18 colume (4.6 × 250 mm) equilibrated with deionized water and eluted with a linear gradient of acetonitrile (5 ~ 15%) in 0.1% TFA at a flow rate of 1mL/min. Each fraction (0.5 mg of dried extract/mL) was used to determine the metal ion chelating activities.
B
66
C h e la ti n g a c ti v it y ( % )
0 5 10 15 20 25 30
PAH1a PAH1b PAH1c
b b
a
PAH1
圖 4-14 PAH1 經高效能液相層析法純化後其亞鐵離子螯合能力 (A) 以及 RP-HPLC 分析圖 (B)
Figure 4-14 Metal ion chelating activity (A) and RP- HPLC elution patterns (B) of PAH1 purified by RP-HPLC.
1. Bars represent standard deviations from triplicate determinations.
2. Different letters on the bars of PAH1 indicate the significant differences (p<0.05).
3. It was applied to a RP-C18 colume (4.6 × 250 mm) equilibrated with deionized water and eluted with a linear gradient of acetonitrile (5 ~ 15%) in 0.1% TFA at a flow rate of 1mL/min. Each fraction (0.5 mg of dried extract/mL) was used to determine the metal ion chelating activities.