鮪魚蛋白質水解物之抗氧化活性特性

三、 鮪魚蛋白質水解物之抗氧化活性特性

(一) 清除 DPPH 自由基能力

ROS 會造成體內產生大量自由基進而傷害到細胞，使得人們產生疾病，

因 此 ， 降 低 自 由 基 產 生 與 ROS 的 生 成 是 可 以 有 效 對 抗 許 多 疾 病 發 生 (Halliwell and Gutteridge, 1989)。脂質在自氧化的過程中會產生自由基而造成 脂質酸敗，常見的抗氧化研究通常以 DPPH 用以評估抗氧化物藉由提供氫來 清除脂質過氧化物自由基，進而達到抑制氧化連鎖反應之進行 (Jin and Chen, 1998)。本實驗中，使用 DPPH 自由基為自由基來源，供鮪魚蛋白質水解物去 除自由基能力的測定，其結果發現，最具清除 DPPH 自由基能力為 AMH 及 PAH 其 EC50 分別為 17.3 及 15.32 mg of dried extract/mL。另有研究以雞精 萃取物測定其抗氧化活性，結果發現清除 DPPH 自由基能力會隨濃度增加而 有上升的趨勢，當濃度達 120 mg/mL 則清除能力已不再增加，此時清除能力 僅為 59% (Wu et al., 2005)。與本實驗在相同濃度 (60 mg of dried extract/mL) 情況相較下，AM 及 PA 蛋白質水解物皆可清除 70% 以上的 DPPH 自由 基，明顯高於雞精萃取物 (約 35%)。故顯示出鮪魚蛋白質水解物中可提供一 些抗氧化活性物質而中止自由基的連鎖反應。

L-ascorbic acid、BHT 作為本實驗的正對照組，結果發現 BHT 之甲醇溶 液在濃度 5 mM (1.1 mg/mL) 下，已具有相當高的清除能力 (90.10%)，其因

BHT 之本身結構具有可提供 H⁺ 給自由基 (Bondet et al., 1997) 【圖 5-1】，

可穩定不安定的自由基分子，然後阻斷脂質氧化的進行。雖然 BHT 可有效 清除自由基，但是文獻指出使用人工合成抗氧化劑可能會誘發癌症發生 (Branen,1975)，故基於健康理由，現今都改以天然的抗氧化物取代。另外，

發現以 L-ascorbic acid 之水溶液作為對照組，則無法偵測出 EC50，最高僅有 12.42 % (15 μg/mL) (數據未顯示)。尚有文獻指出，ascorbic acid 濃度為 40 μM (7.04 mg/mL) 時，此時清除 DPPH 自由基能力約為 45 % (Sheih et al., 2009)；

Lee et al. (2008) 以 ascorbic acid 作為發酵大豆蛋白清除 DPPH 自由基能力 的正對照組，結果顯示最高清除能力僅有 24.1% (1 mg/mL)。由以上結果皆無 法偵測出 L-ascorbic acid 之 EC50，故推測原因為 DPPH 是一種烷基自由基，

偏脂溶性，而 L-ascorbic acid 是一種水溶性抗氧化劑，則不易與 DPPH 產生 作用所致 (林，2009)。

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(Bondet et al.,1997) 圖 5-1 BHT 與 DPPH 自由基的作用機制

Figure 5-1 Proposed mechanism for BHT/DPPH • reaction.

(二) 亞鐵離子螯合能力

在多種過渡金屬中，如：鐵、鈷、銅等金屬離子，於食品中會催化油脂 氧化反應，特別當 Fe²⁺、Cu²⁺ 存在下與過氧化氫作用，便會產生大量自由基，

加速油脂氧化反應的進行，也因此可能會造成食品的風味、顏色以及營養價 值降低 (Gordon, 2001)；反之，食品中若存有少量金屬離子，具有促進脂質氧 化作用，倘若胜肽能與這些金屬離子螯合，便能降低脂質氧化的起始反應速 率，以減少脂質氫過氧化作用 (Klompong et al.,2007)。其研究發現，藉由某

些胜肽或蛋白質具螯合金屬，減少 ROS 產生 (Sakar, 1987)。本結果顯示，

經過酶水解後所產生之鮪魚蛋白質水解物的亞鐵離子螯合能力，以水解 2 hr 的 AM 和 3 hr 的 PA 蛋白質水解物為效果最佳，其 EC50 分別為 4.91 和 5.19 mg of dried extract/mL。先前文獻顯示，具有螯合能力的蛋白質水解物可 降低油脂氧化，是因胜肽的斷裂而增加酸性與鹼性胺基酸之側鏈羧基及胺基 端的濃度，增加與 Fe²⁺ 的結合能力 (Dong et al., 2008)。然而，當 AM 及 PA 蛋白質水解物濃度為 20 mg of dried extract/mL 時，其亞鐵離子螯合能力則可 高達到 97% 以上。有學者將 sliver carp 魚肉利用 alcalase 水解，結果發現 其亞鐵離子螯合能力顯示出小分子量的蛋白質水解物具有較佳的螯合能力 92.7 % (5 mg/mL) (Dong et al., 2007)。由此可見，鮪魚血合肉加工副產品經蛋 白酶水解後可產生短胜肽物質，且具有良好的螯合能力，故可當作一個天然 的金屬螯合劑。

(三) 還原力

還原力為一種測量樣品提供電子讓 Fe³⁺ 還原成 Fe²⁺ 的能力，以波長 700 nm 下測定，吸光值越高則表示還原力越高 (Oyaizu, 1986)，可當作抗氧 化活性指標之一。由先前文獻指出，鯖魚蛋白質水解物經 protease N 水解 0

~ 25 hr，結果發現還原力會隨水解時間的增加而逐漸上升 (吸光值為從 0.38 上升至 0.65) (Wu et al., 2003)。但也有研究指出，以 yellow stripe trevally 為原 料利用 alcalase 水解，測其在不同 DH (5、15 和 25%) 下的還原力，結果顯 示隨水解度上升，還原力也有逐漸下降的趨勢 (吸光值從 0.56 降至 0.42) (Klompong et al., 2007)；另外也有以 alkaline-aided channel catfish 當作原料以 protamex 水解，研究發現還原力也會隨水解時間增加而下降 (吸光值從 0.33 降至 0.17) (Theodore et al., 2008)。而本實驗結果顯示，AM 蛋白質水解物還 原力之 EC50 會隨水解時間增加而逐漸下降 (EC50 從 5.90 至 9.54 mg of dried extract/mL)，與後 2 者的結果相似。有研究顯示，還原酮 (reductones) 如

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ascorbic acid 可直接與過氧化物其及相關的前驅物可有效預防自由基生成 (Shimada et al., 1992)。實驗發現 L-ascorbic acid 在濃度 0.03 mM (0.088 mg/mL) 下則具有很好的還原力，此時，吸光值為 1.609。以整體來說，還原 力會受蛋白酶種類不同而有所影響，推測鮪魚蛋白質水解物中可能含有一些 物質可藉由提供電子給自由基而此達到抗氧化效果 (Murase et al., 1993)。

綜合以上所述，AM 及 PA 蛋白質水解物皆具有亞鐵離子螯合能力與清 除 DPPH 自由基能力及還原力。其中又分別以水解 3 和 2 hr AM 及 PA 蛋 白質水解物最具抗氧化活性，由此可見，鮪魚蛋白質水解物可作為一級或是 二級抗氧化物。有研究指出，抗氧化活性主要會受與原料、蛋白酶種類、水 解度、胺基酸組成分以及胜肽之胺基酸序列等影響 (Kim et al., 2001; Wu et al., 2003)，本實驗所使用 2 種商業蛋白酶 (AM 及 PA) 其主要作用位置為疏水 性胺基酸之 C 端胜肽鍵 (Loffler, 1986)，如當疏水性胺基酸增加可以增加在 油脂中的溶解度，也就是說疏水性胺基酸增加及脂質的親和力較高有關，可 以達到抗氧化效果 (Mendis et al., 2005)。另外，在實驗中發現鮪魚蛋白質水 解物之亞鐵離子螯合能力濃度在小於 6 mg of dried extract/mL 即可達到 EC50，還原力濃度在小於 8 mg of dried extract/mL 即可達到 EC50，清除 DPPH 自由基能力則需濃度小於 18 mg of dried extract/mL 才可達到 EC50， 相較之下，以亞鐵離子螯合能力所需濃度較低。當樣品濃度越低則表抗氧化 活性越好。故基於成本考量下，後續實驗則選用抗氧化活性最好的 AMH 及 PAH 做進一步的純化分離，並以亞鐵離子螯合能力作為抗氧化活性指標。

由本實驗結果發現 DH 與抗氧化活性並無太大相關性，有其他相關 DH 先前有文獻指出，以 flavourzyme 水解 sliver carp 魚肉 0 ~ 6 hr，結果發現 抗氧化活性會隨 DH 而逐漸上升 (Dong et al., 2008)；Jun et al. (2004) 將 yellowfin sole 利 用 mackerel intestine crude enzyme (MICE) 、 alcalase 、 chymotrypsin、papain、pepsin、pronase E 等多種蛋白酶水解後並測定其 DH，

結果顯示最高與最低之 DH 分別為 67% (MICE) 及 22% (pepsin)，並測其各

抗氧化活性。結果顯示 pepsin 水解物具有最佳抑制亞麻油酸過氧化作用 (70%)，由此得知在低 DH 下抗氧化活性較佳。綜合以上所述，再次證明 DH 與抗氧化活性無一定關聯性。

此外，鮪魚蛋白質水解物之清除 DPPH 自由基、還原力以及亞鐵離子螯 合能力皆與水解物濃度 (0 ~ 30 mg of dried extract/mL) 呈正相關。在 Sheih et al. (2009) 文獻中指出，海藻蛋白質水解物在清除 DPPH 自由基能力 (0 ~ 30 μM) 與 ABTS⁺ 自由基 (0 ~ 60 μM) 也會隨濃度的增加而提升抗氧化活性，

本實驗結果與此文獻一致。