鮪魚蛋白質水解物之抗氧化活性分析

為了解鮪魚蛋白質水解物之抗氧化活性，故本研究針對不同水解時間下 的 AM 及 PA 蛋白質水解物，進一步以清除 DPPH 自由基能力、還原力、

亞鐵離子螯合能力為測定指標，探討各時間點下蛋白質水解物與抗氧化活性 之相關性，分別以 L-ascorbic acid、BHT、EDTA 為正對照組。實驗數據是以 不同濃度繪製出之線性迴歸曲線，並計算求出其 EC50。

(一) 清除 DPPH 自由基能力

本實驗是利用 AM 與 PA 兩種蛋白酶進行水解 1 ~ 6 hr，測定不同水解 時間下鮪魚蛋白質水解物清除 DPPH 自由基能力。結果顯示，在水解過程中，

AM 及 PA 蛋白質水解物之清除 DPPH 自由基能力則會隨濃度增加而增加 (0 ~ 60 mg of dried extract /mL) 【圖 4-2 及圖 4-3】，當濃度達 60 mg of dried extract/mL 時，清除 DPPH 自由基能力都達 70% 以上。進一步，我們藉由 不同濃度點求得出各個水解時間下的 EC50 即清除 50% 的 DPPH 自由基能 力所需的濃度【表 4-2】。發現在水解 1 ~ 6 hr 過程中，清除 DPPH 自由基 能力以水解 3 hr 的 AM 蛋白質水解物可顯著高於其他水解時間下的蛋白質 水解物 (p<0.05)，其 EC50 為 17.13 mg of dried extract/mL。另外，在水解 1 ~ 3 hr 過程中，PA 蛋白質水解物的清除 DPPH 自由基能力則無顯著性差異 (p>0.05)，但隨著水解時間 (2 ~ 6 hr) 增加，發現清除能力會逐漸下降 (EC50

從 15.32 提升至 32.96 mg of dried extract/mL)。以整體來看，還是以水解 2 hr 的 PA 蛋白質水解物具有較佳的清除 DPPH 自由基能力，其 EC50 為 15.32 mg of dried extract/mL。本實驗以 BHT 作為正對照組 【圖 4-4】，結果顯示 BHT 在 1.25 mM (0.275 mg/mL) 濃度下與清除 DPPH 自由基能力呈線性關 係 (R² = 0.992)，且當濃度高於 1.25 mM 則趨於平衡，其清除能力最高為 90.10% (EC50 = 0.18 mg/mL)。

表 4-2 鮪魚蛋白質水解物清除 DPPH 自由基能力之 EC50

Table 4-2 EC50 of DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates derived from tuna dark muscle by-product.

Hydrolysis time

AM PA

EC

₅₀

(mg dried of extract /mL) Equation, R

²

EC

₅₀

(mg dried of extract /mL) Equation, R

²

1 23.71 ± 2.36

^b

y = 1.971x + 3.265, 0.975 17.69 ± 1.25

^a

y = 2.792x + 0.601, 0.994

2 24.40 ± 1.65

^b

y = 1.963x + 2.084, 0.984 15.32 ± 1.36

^a

y = 3.148x + 1.780, 0.992

3 17.13 ± 1.13

^a

y = 2.912x + 0.107, 0.997 16.81 ± 0.51

^a

y = 2.891x + 1.390, 0.990

4 24.08 ± 3.23

^b

y = 1.978x + 2.355, 0.981 23.42 ± 0.57

^b

y = 1.937x + 4.627, 0.963

5 24.31 ± 2.82

^b

y = 1.954x + 2.479, 0.983 25.94 ± 1.83

^b

y = 1.798x + 2.683, 0.971

6 25.93 ± 2.94

^b

y = 1.875x + 1.364, 0.985 32.96 ± 2.56

^c

y = 1.492x + 0.810, 0.984

BHT 0.180 ± 0.005 y = 277.2x - 0.748, 0.992

1. ^a-c Values with different superscript letters in the same column are significantly different (p<0.05).

2. *EC50 means the effective concentration of protein hydrolysates providing 50% DPPH radical scavenging activity.

3. All values are means ± standard deviation of data from triplicate.

4. Regression equations were obtained from linear region of AM and PA protein hydrolysates.

48

Concentration (mg of dried extract/mL) 圖 4-2 AM 蛋白質水解物在不同濃度下之清除 DPPH 自由基能力

Figure 4-2 DPPH radical scavenging activities of AM protein hydrolysates at various concentrations.

1. Values are means ± standard deviation of three replicate analyses.

D P P H r a d ic a l sc a v en g in g a ct iv it y ( %)

1hr

Concentration (mg of dried extract/mL) 圖 4-3 PA 蛋白質水解物在不同濃度下之清除 DPPH 自由基能力

Figure 4-3 DPPH radical scavenging activities of PA protein hydrolysates at various concentrations.

1. Values are means ± standard deviation of three replicate analyses.

D P P H r a d ic a l sc a v en g in g a ct iv it y ( %)

50

BHT

Concentration (mg/mL)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

D P P H sc a v eng ing a ct iv it y ( % )

0 20 40 60 80 100

圖 4-4 BHT 在不同濃度下之清除 DPPH 自由基能力

Figure 4-4 DPPH radical scavenging activies of BHT at vaurious concentrations.

1. Values are means ± standard deviation of three replicate analyses.

(二) 亞鐵離子螯合能力

本實驗利用 AM 與 PA 兩種蛋白酶進行 1 ~ 6 hr 水解，測定不同水解 時間下鮪魚蛋白質水解物之亞鐵離子螯合能力 【表4-3】，結果顯示，在水 解 3 hr 的 AM 蛋白質水解物可顯著高於其他水解時間下之蛋白質水解物，

其 EC50 為 4.91 mg of dried extract/mL (p<0.05)。當水解時間越久，螯合能力 則有下降的趨勢，以水解 6 hr 的 AM 蛋白質水解物螯合能力為最弱，此時 的 EC50 為 7.21 mg of dried extract/mL。PA 蛋白質水解物以水解 2 hr 時的 螯合亞鐵離子能力顯著高於其他水解時間下的蛋白質水解物 (p<0.05)，其 EC

50 為 5.95 mg of dried extract/mL。在相同水解時間下，不論是 AM 或 PA 蛋 白質水解物之亞鐵離子螯合能力會隨著濃度增加而逐漸上升。結果得知以水 解 1 和 3 hr 的 AM 及水解 2 hr 的 PA 蛋白質水解物濃度均於 10 mg of dried extract/mL 以下；而水解 2 和 4 ~ 6 hr 的 AM 及水解 1 和 3 ~ 6 hr 的 PA 蛋白質水解物其濃度於 15 mg of dried extract/mL 以下與亞鐵離子螯 合能力呈線性關係，爾後則趨於平緩，其亞鐵離子螯合能力最高可達 96%

【圖4-5 及圖4-6】。

另外，本實驗以 EDTA 作為正對照組 【圖 4-7】，結果發現於 0.25 mM (0.093 mg/mL) EDTA 濃度下與亞鐵離子螯合能力呈線性關係 (R² = 0.9951)，

且當濃度高於 0.25 mM (0.093 mg/mL) 後，此螯合能力則不再增加，其螯合 能力為 99.06% (EC50 = 0.05 mg/mL)。

52

表 4-3 鮪魚蛋白質水解物的亞鐵離子螯合能力之 EC50

Table 4-3 EC50 of metal ion chelating activity of protein hydrolysates derived from tuna dark muscle by-product.

Hydrolysis time

AM PA

EC

50

(mg dried of extract /mL) Equation, R

²

EC

50

(mg dried of extract /mL) Equation, R

²

1 5.66 ± 0.36

^b

y = 8.567x + 1.499, 0.996 6.78 ± 0.46

^b

y = 7.572x - 1.342, 0.997

2 5.98 ± 0.40

^b

y = 7.705x + 3.869, 0.982 5.95 ± 0.20

^a

y = 8.276x - 0.701, 0.999

3 4.91 ± 0.18

^a

y = 9.751x + 2.087, 0.991 8.79 ± 0.68

^cd

y = 5.869x - 1.580, 0.995

4 6.68 ± 0.22

^bc

y = 7.158x + 2.177, 0.995 8.14 ± 0.64

^cd

y = 6.340x - 1.639, 0.996

5 7.13 ± 0.61

^c

y = 6.712x + 2.138, 0.994 7.89 ± 0.21

^c

y = 6.615x - 2.161, 0.994

6 7.21 ± 0.53

^c

y = 6.839x + 0.670, 0.999 9.33 ± 0.28

^d

y = 5.550x - 1.776, 0.998

EDTA 0.050 ± 0.001 y = 401.9x - 0.005, 0.995

1. ^a-d Values with different superscript letters in the same column are significantly different (p<0.05).

2. *EC50 means the effective concentration of protein hydrolysates providing 50% metal ion chelating activity.

3. All values are means ± standard deviation of data from triplicate.

4. Regression equations were obtained from linear region of AM and PA protein hydrolysates.

1hr

Concentration (mg of dried extract/mL) 圖 4-5 AM 蛋白質水解物在不同濃度下之亞鐵離子螯合能力

Figure 4-5 Metal ion chelating activity of AM protein hydrolysates at various concentrations.

1. Values are means ± standard deviation of three replicate analyses.

C h ela tin g a ct iv it y ( %)

54

Figure 4-6 Metal ion chelating activity of PA protein hydrolysates at various concentrations.

1. Values are means ± standard deviation of three replicate analyses.

C h ela tin g a ct iv it y ( %)

EDTA

Concentration (mg/mL)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

C he la ti ng a ct iv it y ( % )

0 20 40 60 80 100

圖 4-7 EDTA 在不同濃度下之亞鐵離子螯合能力

Figure 4-7 Metal ion chelating activity of EDTA at various concentrations.

1. Values are means ± standard deviation of three replicate analyses.

56

(三) 還原力

利用 AM 與 PA 兩種蛋白酶進行 1 ~ 6 hr 水解，測定不同水解時間蛋 白質水解物之還原力 【表4-4】。當吸光值越高則表示還原力越好，實驗數 據以 EC50 (吸光值達 0.5 所需的濃度) 呈現，依結果顯示，AM 蛋白質水解 物還原力會隨水解時間增加而有逐漸下降的趨勢，其 EC50 從 5.90 提升至 9.54 mg of dried extract/mL，且又以水解 1 和 2 hr 顯著高於 5 ~ 6 hr 之蛋白 質水解物 (p<0.05)；PA 蛋白質水解物於水解 2 和 4 ~ 5 hr 之間其還原力高 於水解 1 hr，而在統計上無顯著性差異，但顯著高於水解 3 和 6 hr 之蛋白 質水解物 (p<0.05)。在相同水解時間下，隨著濃度 (0 ~ 30 mg of dried extract/mL) 上升，還原力也會明顯增加 【圖4-8 及圖4-9】。當 AM 和 PA 蛋 白質水解物濃度達 10 mg of dried extract/mL，此時，還原力吸光值均可達 0.5 以上。當濃度達 30 mg of dried extract/mL 以上，則會有沉澱物產生，故在測 定還原力時，選用濃度範圍以 30 mg of dried extract/mL 以下為主。另外，本 實驗以 Lascorbic acid、BHT 作為正對照組 【圖4-10】，結果顯示 L-ascorbic acid 和 BHT 濃度分別在 0.5 mM (0.088 mg/mL) 和 1.25mM (0.28 mg/mL) 下呈線性關係 (R² = 0.993 及 0.972)，且吸光值達 1.609 及 1.432 (EC50 分別 為 0.03 及 0.07 mg/mL)。

綜合以上結果所述，鮪魚血合肉加工副產品經蛋白酶水解後皆可產生抗 氧化活性，但仍以 Lascorbic acid、BHT、EDTA 效果較佳。AM 及 PA 蛋白 質水解物分別在水解 3 hr 和 2 hr 皆具有最佳的清除 DPPH 自由基能力和 亞鐵離子螯合能力；AM 蛋白質水解物之還原力以水解 1 ~ 3 hr 效果較佳；

PA 蛋白質水解物則以水解 1 、2 、4 和 5 hr 效果較佳。整體看來，AM 蛋 白質水解物及 PA 蛋白質水解物以水解 3 hr 和 2 hr (AMH 及 PAH) 最具 有抗氧化活性。因此，本實驗為了更進一步提升鮪魚蛋白質水解物之抗氧化 活性，故未來則選用 AMH 以及 PAH 作後續的實驗，首先以 Sephadex G-25 做分劃並估計其分子量範圍，接著再以 RP-HPLC 作純化，以期能找到最

表 4-4 鮪魚蛋白質水解物還原力之 EC50

Table 4-4 EC50 of reducing power of protein hydrolysates derived from tuna dark muscle by-product.

Hydrolysis time

AM PA

EC

50

(mg dried of extract /mL) Equation, R

²

EC

50

(mg dried of extract /mL) Equation, R

²

1 5.90 ± 0.27

^a

y = 0.080x + 0.028, 0.993 7.80 ± 0.47

^ab

y = 0.059x + 0.040, 0.996 2 6.84 ± 0.38

^a

y = 0.070x + 0.021, 0.995 7.75 ± 0.62

^a

y = 0.059x + 0.043, 0.996 3 7.37 ± 0.93

^ab

y = 0.065x + 0.021, 0.995 8.07 ± 0.20

^b

y = 0.058x + 0.032, 0.998 4 9.07 ± 1.88

^bc

y = 0.052x + 0.028, 0.995 7.68 ± 0.19

^a

y = 0.060x + 0.039, 0.996 5 9.20 ± 1.53

^c

y = 0.052x + 0.031, 0.994 7.44 ± 0.31

^a

y = 0.061x + 0.046, 0.995 6 9.54 ± 1.30

^c

y = 0.050x + 0.023, 0.997 8.25 ± 0.16

^b

y = 0.057x + 0.030, 0.997 L-ascorbic

acid 0.030 ± 0.001 y = 16.01x + 0.032, 0.993 BHT 0.070 ± 0.004 y = 6.360x + 0.082, 0.972

1. ^a-d Values with different superscript letters in the same column are significantly different (p<0.05).

2. *EC50 means the effective concentration of protein hydrolysates providing 50% reducing power.

3. All values are means ± standard deviation of data from triplicate.

4. Regression equations were obtained from linear region of AM and PA protein hydrolysates.

58

Figure 4-8 Reducing power of AM protein hydrolysates at various concentrations.

1. Values are means ± standard deviation of three replicate analyses.

A 700

1hr

Concentration (mg of dried extract/mL) 圖 4-9 PA 蛋白質水解物在不同濃度下之還原力

Figure 4-9 Reducing power of PA protein hydrolysates at various concentrations.

1. Values are means ± standard deviation of three replicate analyses.

A 700

60

BHT

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

A700

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

L-ascorbic acid

Concentration (mg/mL)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

A700

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

圖 4-10 BHT 和 L-ascorbic acid 在不同濃度下之還原力

Figure 4-10 Reducing power of BHT and L-ascorbic acid at various concentrations.

1. Values are means ± standard deviation of three replicate analyses.

佳的抗氧化活性胜肽。

在文檔中 中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/32508 (頁 58-73)