第三章 實驗材料與方法
第二節 實驗方法及步驟
一、 被動學習反應
適應期：於訓練 24 小時，先將大鼠置於實驗室中適應 2 小時後，
置入實驗室之明室中，同時閘門開啟，待 10 分鐘後， 取 出大鼠，歸回飼養籠。
訓練期：將篩選過之大鼠，置入明室，同時開啟閘門，待大鼠 進入暗室後，關閉閘門，同時於底板通以電流(1 mA，2
sec)，待電刺激後 5 秒，自暗室取出大鼠，歸回飼養籠。
測定期：於訓練後 24 小時，再置入明室，同時並開啟閘門，記 錄大鼠在明室之滯留時間(step-through latency，STL) 。當於明室之滯留時間大於 5 分鐘(300 秒)時，則稱大鼠 之學習記憶能力正常。(方法一)
二、葛根素之腦血流測定
以動物血液循環測定儀，依杜普樂原理測定其腦血管之血循速度。在腦 殼中線旁開 2.5~3 mm，中耳線往前 4.2~4.5 mm 處，鑽一 1~2 mm 直徑的洞，
硬腦膜保持完整，將雷射杜普樂探針(針尖直徑 0.8 mm)置於距硬腦膜表面 上 0.5 mm 處測腦血流。於鑽洞後持續監測腦血流，直至腦血流穩定後記錄 腦血流並腹腔注射給與葛根素（25、50 mg/kg），每隔 10 分鐘觀測其腦血 流並記錄之。
三、葛根素對誘發被動迴避學習反應障礙物質之影響
三種不同劑量之葛根素(10、25、50 mg/kg，)於腹腔注射後 30 分鐘 進行訓練，且與下述之誘發學習障礙物質併用，依前法(方法一)，記錄大 鼠在明室之滯留時間。病理對照組給予下述之誘發學習記憶障礙物質。而 空白對照組則給予 vehicle。正對照組則給予 tacrine(1 mg/kg，i.p.)，
給藥後 90 分鐘進行訓練。
1、學習獲得障礙誘發物質：
SCOP(1 mg/kg，i.p.)於訓練前 30 分鐘給藥。
MECA(10 mg/kg，i.p.) 於訓練前 30 分鐘給藥。
PCA(5 mg/kg，i.p.) 於訓練前 30 分鐘給藥。
MK-801(0.1 mg/kg，i.p.) 於訓練前 30 分鐘給藥。
2、記憶鞏固障礙誘發物質：
CXM(1.5 mg/kg，s.c.) 於訓練後立刻給藥。
四、葛根素對 cycloheximide 誘發被動迴避學習反應障礙 物質之機轉
葛根素(50 mg/kg)，於腹腔注射後 30 分鐘進行訓練，並於訓練後與 CXM(1.5 mg/kg，s.c.)併用。依前法(方法一)，記錄大鼠在明室之滯留時 間。病理對照組給予下述之誘發學習記憶障礙物質。而空白對照組則給予 vehicle。
1、本實驗所併用物質之劑量及時間分別為：
SCOP(0.3 mg/kg，i.p.)於訓練後給藥。
MECA(3 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。
PCA(1.0 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。
8-OH-DPAT(0.025 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。
DOI(0.02 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。
PRO(3 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。
PHE(0.01 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。
五、雙側腦部 dorsal raph 區投與 serotonergic neurotoxin 5,7-DHT 對葛根素改善學習記憶之影響
腦部 dorsal raphe 區(座標：bregma 往後 7.8 mm，往兩側 0.3 mm，
深度 6.4 mm) 給予 5,7-DHT (10
µg/5 µl)破壞兩側 dorsal raphe 區
serotonin 神經元，7 天後；於訓練後，於腦室立刻給予二種不同劑量之葛 根素養(5、10 µg/20 µl)， 記錄大鼠在 24 小時後之測定期在明室之滯留 時間。病理對照組給予 5,7-DHT。 而空白對照組則給予 vehicle，並進行 假手術組以比對之。
六、雙側腦部 locus coeruleus 區投與 noradrenergic neurotoxin 6-OHDA 對葛根素改善學習記憶之影響
腦部 locus coeruleus 區(座標：bregma 往後 9.8 mm，往兩側 1.3 mm，
深度 7.2 mm)給予 6-OHDA(4 µg/2 µl)破壞兩側 locus
coeruleus
區 noradrenaline 神經元，7 天後；於訓練後於腦室立刻給予二種不同劑量之 葛根素(5、10µ
g/20µ
l)記錄大鼠在 24 小時後之測定期在明室之滯留時 間。病理對照組給予 6-OHDA 。而空白對照組則給予 vehicle，並進行假手 術組以比對之。七、側腦室投與 cholinergic neurotoxin AF64A 對葛根素 改善學習記憶之影響
側腦室(座標：bregma 往後 0.9 mm，往兩側 1.4 mm，深度 3.6 mm)給
予 AF64A(3 nmol/side)破壞 hippocampus 區 acetylcholine 神經，7 天後；
於訓練後於腦室立刻給予二種不同劑量之葛根素養(5、10
µ
g/20µ
l)， 記 錄大鼠於 24 小時後之測定期在明室之滯留時間。病理對照組給予 AF64A。而空白對照組則給予 vehicle，並進行假手術組以比對之。
八、數據統計
本實驗大鼠在被動迴避學習反應所得之數據，以 Kruskal-Wallis non-parametric one- way analysis，分析其變異數再以 Mann-Whitney
U-test 統計並分析其間之顯著性。凡 P 值小於 0.05 以下時，則認為有統計 意義。
第四章 實驗結果
一、葛根素之腦血流測定
如圖四所示，葛根素經腹腔注射給與，僅在 50 mg/kg 劑量 下達到最高腦血流，時間為 30 分鐘。
Fig 4. Effects of puerarin (25 and 50 mg/kg, i.p.) on the changed cerebral blood flow rate of middle cerebral artery measured by laser Doppler flowmetry in rats. ∗∗∗ p< 0.001, compared with the vehicle group.
Time (min)
10 20 30 40 50 60
∆ cerebral blood flow rate (ml/min/100 g tissue)
-10 0 10 20 30
40 Vehicle
Puerarin 25 mg/kg Puerarin 50 mg/kg
*** *** ***
二、葛根素對誘發被動迴避學習反應障礙物質之影響
Fig 5. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on scopolamine (SCOP, 1 mg/kg)-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats. Each
Step through latency (sec)
0
Step through latency (sec)
0
column represents the medain, and the range inside 5th and 95th percentile.
如圖六所示，PUR(10、25、50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 SCOP(0.5 mg/kg，i.p.) 誘發之大鼠學習獲得障礙，不具改善作用。
Fig 6. Effects of puerarin (PUR, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on scopolamine (SCOP) at
subdose (0.5 mg/kg)-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats.
Each column represents the medain, and the range inside 5th
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(12) (12)
(12)
VEH VEH 25 50 PUR (mg/kg) SCOP 0.5 mg/kg
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(12) (12)
(12)
VEH VEH 25 50 PUR (mg/kg) SCOP 0.5 mg/kg
and 95th percentile.
2、PUR 對 PCA 誘發被動迴避學習反應障礙之影響
如圖七所示，訓練前 30 分鐘給予 PCA(5 mg/kg，i.p.)，可縮短大鼠 在明室之滯留時間，誘發大鼠學習獲得障礙。PUR(10、25、50 mg/kg，) 經腹腔注射給藥後，僅於 25、50 mg/kg 劑量下，對 PCA(5 mg/kg，i.p.) 誘 發之大鼠學習獲得障礙，具改善作用(p<0.001)。
Fig 7. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on p-chloroamphetamine
(PCA, 5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats.
Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile.
∗∗∗
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(12) (12)
(14)
(16)
VEH VEH 10 25 50 PUR (mg/kg) PCA 5 mg/kg
***
***
p<0.001, compared with PCA/VEH group.
3、PUR 對 MK-801 誘發被動迴避學習反應障礙之影響
如圖八所示，訓練前 30 分鐘給予 MK-801(0.1 mg/kg，i.p.)
，可縮短大鼠在明室之滯留時間，誘發大鼠學習獲得障礙。PUR(10、25、
50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，僅於 25、50mg/kg 劑量下，對 MK-801(0.1 mg/kg ，i.p.) 誘發之大鼠學習獲得障礙，具改善作用(p<0.05)，且於 50mg/kg 之劑量下作用較佳(p<0.01)。
Fig 8. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on MK-801 (0.1 mg/kg)-induced
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(10) (10)
(12)
(10)
VEH VEH 10 25 50 PUR (mg/kg) MK-801 0.1 mg/kg
*
**
acquisirion impairment of the passive avoidance in rats. Each column represents the median, and the range inside 5th and 95th percentile.
∗ p<0.05, ∗∗ p<0.01, compared with
MK-801/VEH group.4、PUR 對 MECA 誘發被動迴避學習反應障礙之影響
如圖九所示，訓練前 30 分鐘給予 MECA(10 mg/kg，i.p.)，可縮短大 鼠在明室內之滯留時間，誘發大鼠學習獲得障礙。PUR(10、25、50 mg/kg，) 經腹腔注射給藥後，對 MECA(5 mg/kg，i.p.) 誘發之大鼠學習獲得障礙，
具改善作用(p<o.oo1)。
Fig 9. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on mecamylamine (MECA, 10
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(14) (12)
(14)
(14)
VEH VEH 10 25 50 PUR (mg/kg) MECA 10 mg/kg
***
***
*
mg/kg)-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group.
5、PUR 對 CXM 誘發被動迴避學習反應障礙之影響
如圖十所示，訓練後立即給予 CXM(1.5 mg/kg，s.c.)，可縮短大鼠 在明室之滯留時間，誘發大鼠記憶鞏固障礙。PUR(10、25、50 mg/kg，) 經腹腔注射給藥後，僅於 25、50 mg/kg 劑量下，對 CXM(1.5 mg/kg，s.c.) 誘發之大鼠記憶鞏固障礙，具改善作用(p<0.001)。
Fig 10. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on cycloheximide (CXM,
Step through latency (sec)
0
Fig 10. Effects of puerarin(PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. *** p < 0 . 0 0 1 , c o m p a r e d w i t h C X M / V E H g r o u p .
***
***
Step through latency (sec)
0
Step through latency (sec)
0
1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group.
三、葛根素對 cycloheximide 誘發被動迴避學習反應障礙 物質之機轉
1、如圖十一所示，PUR(25 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，可 被 SCOP(0.3 mg/kg，i.p.)部分拮抗(p<0.05)。
Fig 11. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus scopolamine (SCOP, 0.3 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(12) (14)
(10)
(10)
VEH SCOP VEH PUR PUR+SCOP CXM 1.5 mg/kg
***
**
a
reponse in rats. Each column represents the median, and the range inside 5th and 95th percentile.
∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. a p<0.05, compared with
PUR/CXM group.2、如圖十二所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，
可被 MECA(3 mg/kg，i.p.)部分拮抗(p<0.01)。
Fig 12. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus mecamylamine (MECA, 3
mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(12) (14)
(10)
(10)
VEH MECA VEH PUR PUR+MECA CXM 1.5 mg/kg
***
**
aa
95th percentile.
∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/ VEH group. aa p<0.01,
compared with PUR/CXM group.3、如圖十三所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，
可被 PCA(1 mg/kg，i.p.)所拮抗(p<0.001)。
Fig 13. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus p-chloroamphetamine (PCA, 1 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. a p<0.005, compared with PUR/CXM group.
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(12) (14)
(10)
(12)
VEH PCA VEH PUR PUR+PCA CXM 1.5 mg/kg
***
***
a
4、如圖十四所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM
(1.5 mg/kg ， s.c.) 誘 發 大 鼠 記 憶 鞏 固 障 礙 之 改 善 作 用 ， 無 法 被 8-OH-DPAT(0.025 mg/kg，i.p.)所拮抗(p<0.01)。
Fig 14. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus 8-OH-DPAT (DPAT, 0.025 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group.
Step through latency (sec)
0
Step through latency (sec) ***
0
5、如圖十五所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM
(1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，可被 DOI(0.02 mg/kg，i.p.)所拮抗(p<0.01)。
Fig 15. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus DOI (0.02 mg/kg) on cycloheximide
(CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats.
Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile.
∗∗∗
p<0.001, compared with CXM/VEH group. aa p<0.01, compared with PUR/CXM group.
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(12) (14)
(10)
(12)
VEH DOI VEH PUR PUR+DOI CXM 1.5 mg/kg
***
aa
6、如圖十六所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，
可被 PRO(3 mg/kg，i.p.)所拮抗(p<0.01)。
Fig 16. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus propranolol (PROP, 3 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance reponse in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile.
∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. aa p<0.01, compared with
PUR/CXM group.Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(12) (14)
(10)
(12)
VEH PROP VEH PUR PUR+PROP CXM 1.5 mg/kg
***
aa
7、如圖十七所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，
可被 PHE(0.01 mg/kg，i.p.)所拮抗。
Fig 17. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus phenoxybenzamine (PHE, 0.3 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group.
a p<0.05, compared with PUR/CXM group.
Step through latency (sec)
0 100 200 300
(16)
(12) (14)
(10) (16)
VEH PHE VEH PUR PUR+PHE CXM 1.5 mg/kg
***
a
五、 雙側腦部 Dorsal raph 區投與 serotonergic neurotoxin
Fig 18. Effects of puerarin (PUR, 1, 5, 10 and 25 µg/ 20µl, i.c.v.) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile.
∗∗ p<0.01, ∗∗∗
p<0.001, compared with CXM/VEH group.
如圖十九所示，PUR(5、10
µ
g/20µ
l)於腦室給藥，在 5,7-DHT(4µ
g/2µ
l/side)破壞 dorsal raphe 後，對 CXM(1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記Fig 19. Effects of puerarin (PUR, 5 and 10 µg/20 µl, i.c.v.) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in sham operated or dorsal raphe lesioned rats induced by 5,7-DHT (4 µg/2 µl/side). Each column represents the median, and the range of the 5th and 95th percentile. *** p < 0.001, compared with CXM/VEH group.
Step-through latency (sec)
五、雙側腦部 locus coeruleus 區投與 noradrenergic neurotoxin 6-OHDA 對葛根素改善學習記憶之影響
如圖二十所示，PUR(5、10
µg/20 µl)於腦室給藥，在 6-OHDA(4 µg/2 µ
l/side)破壞 locus coeruleus 後，對 CXM(1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠 記憶鞏固之障礙，只在 10µ
g 劑量下具改善作用(p<0.01)，但仍比假手術 組的改善作用明顯下降。Fig 20. Effects of puerarin (PUR, 5 and 10 µg/20 µl, i.c.v.) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in sham operated or locus coeruleus (LC) lesioned rats induced by 6-OHDA (4 µg/2 µl/side). Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. aaa p<0.001, compared with PUR/CXM group.
Step-through latency (sec)
六、側腦室投與 cholinergic neurotoxin AF64A 對葛根素 改善學習記憶之影響
如圖二十一所示，於側腦室給予 AF64A(3 nmole/ml per brain)後可 誘發大鼠學習記憶障礙。PUR(5、10
µ
g/20µ
l)於腦室給藥後，對 AF64A(3 nmole/ml per brain)誘發之大鼠學習記憶障礙，僅於 10µ
g/2 0µ
l 劑量 下具改善作用(p<0.01)。Fig 21. Effects of puerarin (PUR, 5 and 10 µg/20 µl, i.c.v.) on AF64A (3 nmol/3 µl)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗ p<0.01, compared with
AF64A/VEH group.
Step-through latency (sec)
0 200 400 600
(12)
(12)
(20)
(14)
VEH VEH 5 10 PUR (µg/20 µl, i.c.v.) AF64 A 3 nmol/3
µ
l**
第五章 討 論
近期研究，引起阿耳滋海默氏症之病理因素，是大腦的神經和神經密 度的喪失；特別是在 frontal 和 parietal 的 neocortex，包含許多神經系 統，最重要的是 cholinergic system，緊接著是 noradrenergic system 和 serotonergic system(74)。
另在記憶形成過程，人體首要反應便是神經活性之改變，而這亦包含 acetycholine、dopamine 及 serotonin 等神經系統之改變。更進一步，則 牽涉蛋白質之合成及基因轉錄之過程。(86)首先，中樞乙醯膽鹼神經系統，
已經確認在學習過程扮演重要角色，而乙醯膽鹼拮抗劑 scopolamine 誘發 之智能障礙型態，亦已廣被使用於篩選各類智能增進劑開發之動物模式
(87)。本研究於訓練前投與 SCOP，可縮短大鼠在明室之滯留時間，造成學習 獲得障礙，證實學習獲得過程需乙醯膽鹼神經系統之參與。葛根素在三種 劑量下(10、25、50 mg/kg 經腹腔注射給藥對 SCOP(1 mg/kg，i.p.)誘發 大鼠學習獲得障礙，均無改善作用；且當 SCOP 以較低劑量(0.5mg/kg，i.p.) 誘發大鼠學習獲得障礙時，葛根素亦無改善作用。但正對照組 tacrine，在 1 mg/kg 下即有改善作用。其次研究指出，不論在臨床阿耳滋海默氏症之病 理研究或動物學習行為模式報告，均證實乙醯膽鹼尼古丁接受器，在病變 過程及學習記憶形成過程中亦扮演重要的角色(87)。若將尼古丁投與阿耳滋 海默氏症或智能缺陷大鼠，均可改善或增強其學習操作能力。而乙醯膽鹼 尼古丁接受器拮抗劑 MECA，不僅可使腦內乙醯膽鹼神經系統之活性降低，
亦可造成大鼠學習行為操作之障礙。本研究於訓練前投與 MECA，可縮短大 鼠在明室之滯留時間，造成學習獲得障礙，證實學習獲得過程，需乙醯膽 鹼尼古丁接受器之參與。葛根素在 10、25、50 mg/kg 劑量下，對 MECA 誘 發大鼠學習獲得障礙具有改善作用。另在中樞 serotonin 系統，在脊椎動 物之學習行為模式中，咸認為扮演負向角色(88)。PCA 為 serotonin 釋出促
進劑，可使中樞 cortex、spinal cord、hippocampus 區之突觸前神經元
進劑，可使中樞 cortex、spinal cord、hippocampus 區之突觸前神經元