葛根素改善大鼠學習障礙之研究; The facilitating effects of puerarin on the learning deficit in rats
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(2) 目 錄 中文摘要..................................................... 6 第一章 緒言.................................................. 8 第二章 總論.................................................. 10 第一節 葛根之成分 ......................................... 10 第二節 葛根之藥理作用 ........................................ 13 第三節 葛根素之藥理作用 ................................... 17 第四節 學習記憶之文獻考察.................................. 21 第五節 阿耳滋海默氏病與腦神經傳遞物質之關係 ................ 28 第三章 實驗材料與方法 ........................................ 31 第一節 實驗材料 ........................................... 31 一、 實驗試劑.......................................... 31 二、 實驗動物.......................................... 32 第二節 實驗方法及步驟 ..................................... 33 一、 被動學習反應 ...................................... 33 二、 葛根素之腦血流測定 ................................ 33 三、 葛根素對誘發被動迴避學習反應障礙物質之影響 ......... 33 四、 葛根素對改善 cycloheximide 誘發被動迴避學習反應障 礙之機轉.......................................... 34 五、 腦部 dorsal raph 區投與 serotonergic neurotoxin 5,7-DHT 對葛根素改善學習記憶之影響 ........................ 35 六、 腦部 locus coeruleu 區投與 catecholaminergic neurotoxin 6-ODDA 對葛根素改善學習記憶之影響 .................. 35 七、 側腦室投與 cholinergic neurotoxin AF64A 對葛根素改善學 習記憶之影響 ...................................... 35 八、數據統計 ...................................... 36 1.
(3) 第四章 實驗結果 .......................................... 37 第五章 討論.................................................. 55 第六章 結論.................................................. 62 參考文獻..................................................... 63. 圖 目 錄 Fig.1. 葛根化學成分結構................................................................................12 2.
(4) Fig.2.學習記憶之形成圖 .................................................................................22 Fig.3.記憶的腦內解剖結構定位圖 ..................................................................22 Fig.4. Effects of puerarin on change cerebral blood flow rate of middle cerebral artery measured by laster Doppler flowmetry in rats. .............................37 Fig.5. Effects of puerarin on scopolamine-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats.........................................................38 Fig.6. Effects of puerarin on scopolamine at subdose(0.5 mg/kg)-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats. .........39 Fig.7. Effects of puerarin on p-chloroamphetamine-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats. ...........................40 Fig.8. Effects of puerarin on MK-801-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats .........................................................41 Fig.9. Effects of puerarin on mecamylamine-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats ...................................................42 Fig.10. Effects of puerarin (50 mg/kg) plus p-chloroamphetamine (1 mg/kg) on cycloheximide (1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats...........................................................43 Fig.11. Effects of puerarin (50 mg/kg) plus scopolamine (0.3 mg/kg) on cycloheximide (1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats...........................................................44 Fig.12. Effects of puerarin (50 mg/kg) plus mecamylamine(3 mg/kg) on cycloheximide (1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats.........................................................45 Fig.13. Effects of puerarin (50 mg/kg) plus p-chloroamphetamine (1 mg/kg) on cycloheximide (1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. ......................................................46 Fig.14. Effects of puerarin (50 mg/kg) plus 8- OH-DPAT(0.025mg/kg) on cycloheximide (1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the 3.
(5) passive avoidance response in rats.........................................................47 Fig.15. Effects of puerarin (50 mg/kg) plus DOI(0.002 mg/kg) on cycloheximide (1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats.........................................................48 Fig.16. Effects of puerarin (50 mg/kg) plus propranolol (3 mg/kg) on cycloheximide (1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats.........................................................49 Fig.17. Effects of puerarin (50 mg/kg) plus phenoxybenzamine (0.01 mg/kg) on cycloheximide (1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats.........................................................50 Fig.18. Effects of puerarin (1, 5, 10 and 25 µg/20 µl) on cycloheximide-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. .....51 Fig.19. Effects of puerarin (5 and 10 µg/20 µl) on cycloheximide-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in sham operated or dorsal raphe lesioned rats induced by 5,7-DHT (4 µg /2 µl /side). ....................................................................................................52 Fig.20. Effects of puerarin (5 and 10 µg/20 µl) on cycloheximide-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in sham operated or locus coeruleus(LC) lesioned rats induced by 6-OHDA (4 µg /2 µl /side)....................................................................................53 Fig.21. Effects of puerarin (5 and 10 µg/20 µl) on AF64A (3 nmol/3 µl)-induced comsolidation impairment of the passive avoidance response in rats......................................................................................54. 表 目 錄 Table 1、葛根異黃酮類成分 .................................... 12 4.
(6) Table 2、實驗試劑之簡稱、作用機制暨購買公司一覽表 ............. 31. 葛根素改善大鼠學習障礙之研究 研究生 郭儷萱 中國醫藥學院 中國藥學研究所 5.
(7) 摘 要 (7). 葛根素為中藥葛根活性成分之一，研究證實可增加腦血流量 及保護腦 (8). 缺血造成大鼠腦部之損壞與運動之障礙 。因此，本研究以被動迴避學習反 應 探 討 葛 根 素 (puerarin) 對 學 習 獲 得 障 礙 誘 發 劑 scopolamine 、 necamylamine 、p-chloroamphetamine、MK-801 及記憶鞏固障礙誘發劑 cycloheximide 之影響。 葛根素對學習獲得障礙誘發劑之作用，對於乙醯膽鹼毒蕈鹼接受器拮抗 劑 scopolamine 無 改 善 作 用 ， 但 對 乙 醯 膽 鹼 尼 古 丁 接 受 器 拮 抗 劑 mecamylamine、sertonin 釋放促進劑 p-chloroamphetamine 及非 NMDA 接 受器拮抗劑 MK-801 等具明顯改善作用。 葛根素對記憶鞏固障礙誘發劑 CXM 之改善作用，此改善作用均可被毒蕈 鹼接受器拮抗劑 SCOP、尼古丁接受器拮抗劑 MECA 及 serotonin 釋放促進 劑 PCA 拮抗；進一步，其改善作用可被突觸後 5-HT2 接受器致效劑 DOI、非 選擇性突觸後α接受器拮抗劑 phenoxybenzamine 及非選擇性突觸後β接受 器拮抗劑 propanolol 拮抗，但無法被 5-HT1A 接受器致效劑 8-OH-DPAT 所拮 抗。 葛根素經腦室給藥後，對 CXM 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，可完 全被腦部 locus coeruleus 區給與 noradrenergic neurotoxin 6-OHDA 所拮抗，但其改善作用無法被腦部 dorsal raphe 區給與 serotonergic neurotoxin 5,7-DHT 所拮抗。另外，葛根素經腦室給藥後，經側腦室給與 cholinergic neurotoxin AF64A 誘發大鼠學習記憶障礙亦具拮抗作用。 綜合上述結果，顯示葛根素可增強記憶形成過程中的學習獲得及記憶獲 得，其作用機轉可能直接作用於中樞 cholinergic system 或間接經由中樞 noradrenergic system、serotonergic system 及 exitatory amino acid system 之調節而影響中樞 cholinergic system 改變 Ach 之活性所致；亦 與蛋白質之合成有關。 6.
(8) 7.
(9) 第一章 緒 言 (1). 葛根首載於神農本草經，歷代多用於解表退熱、生津止渴及透疹 ；現 臨床則用於治療高血壓、冠心病、心絞痛、視網膜病變、偏頭痛，藥理研 究亦證實其具有降溫、降血壓、擴張冠狀動脈及降低心肌耗氧量，並可降 (2). 低腦血管阻力及增加腦血流量 。今更證實葛根具改善藥物誘發學習記憶障 (3). 礙之作用 ，葛根素為中藥葛根之主要活性成分之一，在現代藥理學研究中 (4). (5~6). 已證實具清除自由基作用 、可保護再貫流對心肌所造成之損壞. ，並可. (7). 經擴張腦內小動脈以增加腦血流量 及保護腦缺血造成大鼠腦部之損壞與 (8). 運動之障礙 。因此，葛根素之改善學習記憶作用及其中樞作用機轉，有待 開發與探討。. 記憶係經過學習而獲得的經驗或行為的保持，就生理學觀點大致分成 (9). 三類 ：短期記憶(short-term memory)、中期記憶(inter-mediate-term memory)與長期記憶(long-term memory)。而被動迴避學習之動物實驗模 (10). 式中，記憶形成過程大致分成三階段 ：學習獲得(acquisition)、記憶鞏 固(consolidation)和記憶再現(retrieval)。而在學習過程中，一旦接受 外界訊息刺激，人體第一個反應便是神經活性改變，促使腦內神經突觸神 經傳遞物質之釋出，經作用於突觸後接受器以致細胞內酵素之變化及其聯 結基因訊息的轉變；因此在早期之研究即發現在學習記過程中，腦內神經 (11). 傳遞物質參與並扮演重要之角色. 。1987 年 Olton 等之研究認為 memory (12). 主要係因 hippocampus 之參與而完成，而非 amygdala ；Decker 及 McGaugh 更 指 出 大 鼠 之 學 習 記 憶 過 程 可 能 係 由 腦 內 神 經 迴 路 (13). raphe-septo-hippocampal 神經路徑所操縱. 。. 因此，本研究首先擬經由腹腔注射葛根素後，對藥物(scopolamine、 p-chloroamphetamine、MK-801 及 cycloheximide)誘發學習記憶障礙作用. 8.
(10) 之影響及改善 cycloheximide 誘發記憶鞏固障礙之作用機轉；其次擬於腦 室給予葛根素後，觀察給予 neurotoxin：5,7-DHT 損壞 dorsal raphe 之 serotonin 神經元或 6-OHDA 損壞 locus coeruleus 之 noradrenaline 神 經元或 AF64A 給與側腦室損壞 acetylcholine 神經元後之大鼠學習記憶能 力之變化，以評估 septo-hippocampal 路徑在葛根素改善學習記憶作用中 所扮演之角色。. 第二章 總 論. 9.
(11) 第一節 葛根 一、葛根之本草系統圖. (14)~(23). 神農本草經(葛根、葛穀、雞齊根) 藥對. 別錄( 根、生根汁、葉、花、鹿霍、黃斤). 本草經集注（根、生根枝、花） 本草拾遺(根、粉). 新修本草(根、穀、汁、蔓). 開寶本草(根、粉). 日華子(葛). 仲景傷寒論. 藥性論(乾葛) 食療本草. 肘後方. 聖惠方. 梅師方. 貞原廣利方. 外台秘要 廣利方 千金方. 嘉祐本草(根）. 傷寒類要. 湯液本草. 用藥法象. 潔古珍珠囊. 聖惠方. 本草演義補遺. 梅師方. 衛生易簡方. 肘後方. 本草發揮. 千金方. 圖經. 証類本草（根、.粉） 衍義. 龐安常傷寒論. 重修政和本草（根、.粉） 本草品彙 （根.、榖.、花、.葉、.蔓）本草綱目. 精要. 救荒本草 越絕書 曼都賦 嶺南雜記 雒南縣志物產. 詩正義 救荒本草 爾雅翼 周. 書. 南越筆記 說文解字注. 圖考長編 圖考. 二、葛根之成分. 10. 爾雅翼 周書李遷哲傳 博物志 南山經.
(12) 1、葛根中的異黃酮類化合物 50 年代末至 60 年代初，柴田承二等對野葛和甘葛藤進行了系統的化學 成分研究，其中分離出一些成分，除大量澱粉外，主要為異黃酮類化合物。 它們是大豆. 元(daidzein, 1)、 大豆 (daidzin, 2)、葛根素(puerarin,. 3)和未定位的木糖-葛根素(puerarin-O-xyloside). (24). 。而另文獻報導葛根. 同屬植物中，都存在比較豐富的主要成分為異黃酮類化合物，而葛根素在 (25). 目前看來是葛根屬特有的成分，其含量是異黃酮類化合物中最高的 R3 R2O. O R4 R1. O OR5. 1~15 (24). Fig 1、葛根化學成分結構. (24). Table 1、葛根異黃酮類成分 序號 化合物. R1. R2. R3. R4. R5. 1 大豆 元(daidzein). H. H. H. H. H. 2 大豆 (daidzin). H. glc. H. H. H. 3 葛根素(puerarin). H. H. glc. H. H. 4 葛根素木糖. (puerarin-O-xyloside). H. OH. glc. H. H. 5 3’-輕基葛根素(3’-hydroxy-purarin). H. H. glc. H. 6 3’-甲氧基葛根素(3’-meyhoxy-puerarin). H. H. glc. H. 7 大豆 元 8-C-芹菜糖基-(1-6)葡萄糖. H. H. glc→. (daidzein 8-C-apiosyl-(1-6)glucoside). H. H. H. H. H. H. 6api. OH. 8 染料木素 8-C-芹菜糖基-(1-6)葡萄糖. H. (genistein 8-C-apiosyl-(1-6)glucoside). glc→ 6api. OH. 9 染料木素(genistein). 11. H. H. 。.
(13) 10 芒柄花素(formononetin) 11 大豆 元 4’,7-二葡萄糖. (daidzin4’,7-. H. H. H. H. Me. H. glc. H. H. glc. H. H. glc→. H. H. diglucoside) 12 葛根素-木糖. (puerarin-xyloside). 6xyl 13 染料木 (genistin) 14 染料木素 8-C-葡萄糖. (genistein 8-C-. OH. glc. H. H. H. OH. H. glc. H. H. H. H. glc. H. glc. glucoside) 15 葛根素 4’-O-葡萄糖. (puerarin 4’-O-. glucoside). 2、葛根中的新型芳香. 類化合物. 野原稔弘等近年以日本產葛根中分得三個新骨架的芳香 物，命名為葛. A(pueroside A)、葛 (24). (pueroside C)。. 。. 3、葛根中的三. 類皂. B(pueroside B)、葛. 類化合. C. 野原稔弘等近年以日本產葛根的甲醇提取物中，分得了 7 種三 類皂 元，即槐二醇(sophoradiol)、21β-氫基槐二醇(cantoniensistriol)、大 豆皂. 元 B(soyasapogenol B)和大豆皂 元 A(soyasapogenol A)，3 個新. 的三. 類 皂 元為葛根皂 元 C、A、B(kudzusapogenol C,A,B)。另外葛. 根新近提出一種新的三 類 元部分為葛根皂 元 B(kudzusapogenol B)， C-3 位上連有鼠李糖-半乳糖-葡萄糖醛酸基的三糖. (24). 第二節 葛根之藥理作用 一、對心臟血管的作用 1、對冠狀動脈、心肌功能、心肌代謝的影響 12. 。.
(14) 葛根能改善缺血心肌的代謝，進而降低心肌的耗氧，同時又使冠脈血管 擴張、冠脈血流增加，而增加氧的結合，並使缺血區含氧量增加乳酸量減少。 另葛根黃酮及葛根酒浸膏注射狗的冠狀動脈及靜脈，均能曾加腦及冠狀血管 之血流量，並使血管阻力下降。而葛根水煎劑、酒浸膏、總黃酮，均能對抗 (24). 垂體後葉素引起的大鼠心肌缺血，可能是擴張冠狀血管的結果. 。. 2、對血壓的影響 灌胃葛根浸膏或注射葛根總黃酮，能使正常麻醉狗或清醒高血壓狗的血 壓，短暫而明顯的降低；而靜脈注射葛根丙酮、乙醇和水連續提取後之水 溶部分 PM2 引起正常血壓升高，說明葛根除含有降壓物質外，還含有升壓物 (25). 質. 。. 3、抗心律失常作用 葛根酒浸膏、大豆 元，有明顯預防烏頭鹼和氯化鋇誘發的心律失常的 作用. (25). 。葛根主要成分可能影響細胞膜對鉀、鈉、鈣離子的通透性，進而 (3)。. 降低心肌興奮性，預防心律失常的發生 4、腦循環. 麻醉狗注射葛根總黃酮後，部分動物的腦血流量增加，但所有動物的腦 血管阻力均降低；頸內注射葛根總黃酮後，血流量增加和阻力降低更明顯 (25). 。. 二、對平滑肌的作用 葛根含收縮和舒張平滑肌的成分，有實驗證明葛根酒浸膏和總黃酮可 抑制 acetylcholine 及 PGF2α引起的大鼠離體回腸的收縮；葛根舒張平滑 肌的成分(即解痙成分)可能是大豆 、大豆 元，而其收縮平滑肌成分可 (25). 能是膽鹼、乙醯膽鹼和生物鹼“卡塞因 R”等. 三、抗促癌及誘導癌細胞的分化作用 13. 。.
(15) 實驗證明大豆 元對 HL-60 細胞周期移行 G1 期具阻斷作用，是 HL-60 細胞分化誘導劑；但單獨對細胞的誘導作用較弱，當大豆. 元與乳香的有. 效成分 Bc-4 聯合應用時、對 HL-60 細胞生長有明顯抑制和分化誘導作用。 另外，大豆. 元能明顯改變黑色素瘤 B16 細胞的形成，誘導小黑鼠黑色素 (26). 瘤 B16 細胞的分化. 。. 四、抗氧化作用 葛根中分離精製的 GP(8-C-β-D 砒喃葡糖-7-輕基-3-(3’,4’-二輕苯乙 基)-4H 苯砒喃-4-酮)及 MF(2-C-β-D 砒喃葡糖-1,3,6,7-四氫輕基-9H-黃 花素-9 酮)，可顯著抑制氧化損傷引起的紅血球細胞溶血對微粒體的活性氧 類( OH、O2−)造成的過氧化脂質的生成，也有抑制作用；因此 GP 及 MF 均具 -. (3). 有捕捉自由基及抗氧化的作用 。. 五、降血糖作用 葛根水抽物，能使家兔血糖先升後降；對於饑餓家兔之升血糖作用，則 (28). 更為顯著；乙醚抽出物對糖代謝則無明顯影響. 。. 六、對學習記憶功能 小鼠跳臺法和大鼠操作式條件反射法，觀察葛根醇提取物及總黃酮對學 習記憶功能的影響；結果兩者均能對抗東莨菪鹼所致的小鼠記憶障礙和 40% 乙醇所致的記憶再現障礙；葛根醇提取物尚能對抗東莨菪鹼所致的大鼠操 (2). 作式條件反射的抑制 。. 七、對體溫的影響 孫世錫給人工發熱兔(耳緣靜脈注射過期傷寒菌)，灌胃 20%葛根煎劑或 20%乙醇浸膏後，體溫降低，浸劑比煎劑明顯，給藥後半小時升高的體溫降 14.
(16) 至正常水平；一小時作用最強，一直維持在正常體溫以下達 4~5 小時，7 小 (25). 時漸趨平常. 。. 八、解酒毒 千金方有″葛根主解酒毒’’之說，通過動物實驗觀察發現，葛根能有效 (29). 地拮抗酒精引起的肝和睪丸組織，脂質的過氧化的損害. 。. 九、毒性作用 1. 急性毒性：葛根酒浸膏、總黃酮對小鼠靜脈注射的 LD50，分別為 2.1±0.1 g/kg、1.6~2.1 g/kg. (25). 。. 2. 慢性毒性：小鼠每天灌胃酒浸膏 1 g/kg 或灌胃大豆 元 25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg 連續兩個月，血液肝腎功能及 心、肝、脾、肺、腎等實質器官，無明確改變，可見葛根的毒 (25). 性很小. 。. 十、臨床作用 1. 對高血壓的作用 葛根煎劑酒浸膏、總黃酮、大豆 元對高血壓病人的血壓，無明顯的降 低作用；但對高血壓引起的頭痛、頭暈、項強和耳鳴等症狀，有明顯的療 (25). 效. 。. 2. 對心絞痛的作用 用葛根酒浸膏片，每日 6~12 片，分 2~3 次服，總療程 4~22 週；心電 (28). 圖有效率為 41.3%，血清膽固醇及β-脂蛋白在服藥期間無明顯變化. 。. 3. 對突發性耳聾的影響 口服酒浸膏治療早期突發性耳聾 141 例，20.6%痊癒，有效率 79.4% 。 15.
(17) 暴震性耳聾 24 例，總有效率 70.8%；這可能與葛根改善內耳或椎基底動脈 (25). 系統的血液循環有關. 。. 4. 對偏頭痛的作用 高秀賢用葛根浸膏治療 53 例偏頭痛，獲得較好的近期療效有效率 94.1%；葛根治療偏頭痛的作用可能與改善腦循環，調節腦血管對升壓和降 (25). 壓物質的反應性有關，而減少血小板釋放 5-HT，也可能起了重要作用. 。. 5. 對眼睛疾病的作用 用葛根黃酮注射劑(每毫升含黃酮 40 毫克)局部注射，對視網膜中央動 脈栓塞、視神經萎縮均有療效，特別是因視網膜血管痙攣引起的中央視網 (28). 膜炎療效更明顯. 。. 綜合以上所述，葛根含有 20 多種異黃酮、葛根 類、三 類及生物鹼 等活性成分；有降低心肌耗氧量、使冠脈腦血管流量增加、明顯緩解心絞 痛、抗心律失常、抗氧化、增強免疫力、降血糖等藥理作用；具有非常廣 大的應用價值，能將大量的動物實驗轉移到臨床應用，是葛根研發工作的 當務之急。. 第三節 葛根素之藥理作用 一、心腦血管系統 1、降低血壓、減慢心率、降低心肌耗氧量 葛根素能完全抑制腎上腺素對腺. 酸脢的活性，因此認為葛根素是β-. 受體拮抗劑，其降壓作用是β-受體阻斷的結果；另外給高血壓患者注射葛 (29). 根素後，在血壓降低和心率減慢的同時，可使血漿兒茶酚氨減少. 16. 。.
(18) 2、擴張冠狀血管、改善正常和缺血心肌的代謝 葛根素能明顯減少缺血引起的心肌乳酸的產生，降低缺血與再灌流時， 心肌的氧消耗量與心肌水含量. (29). 。亦可使心臟搏動的速率減慢，心肌收縮. 力增強，主動脈壓(MAP)降低，但並不會使缺血區側支冠狀動脈的血流量減 (3). 少 。. 3、抑制動脈硬化、促血管軟化 葛根素作用於牛動脈內皮細胞，可使牛動脈內皮細胞中糖氨代謝明顯減 慢，動脈內壁糖氨多糖相對減少，這對防治動脈硬化和促使血管軟化是有 (29). 益的. 。. 4、改善腦循環 葛根素可促進正常黃金鼠腦循環和改善造模引起的局部微循環障礙，主 要表現為增加微血管運動的振幅，提高血流量；此外，葛根素還具有改善 紅血球變形能力的作用. (29). ；另葛根素對於易中風型自發性高血壓大鼠. (SHRSP)，可明顯延長腦缺血性痙攣發作的時間，延長死亡出現的時間，此 (27). 種保護作用顯然與其增強腦血流及腦代謝的作用有關. 。. 5、抗心律失常 葛根素能明顯預防烏頭鹼和氯化鋇誘發的心律失常，靜脈注射還能延長 離體貓心的動作電位時程和有效不反應期，反映有降低心肌興奮性的作用 (25). 。. 二、β-受體作用 葛根素放射性配體結合分析顯示能明顯降低大鼠心肌膜制劑中，β-受 體的最大結合容量，另外葛根素能完全抑制腎上腺素對腺. 酸脢的激活作 (3). 用，說明其為一種β-受體拮抗劑，對心臟β1-受體有選擇作用 。 17.
(19) 三、對血糖的影響 葛根素與阿斯匹林組成的複方能降低血糖，對某些糖尿病及某些心血管 (29). 併發症，可能有改善作用. 。. 四、降低血脂 大劑量(500 mg/kg)能明顯降低血清總膽固醇，但對血清游離脂肪酸和 (29). 甘油三脂則無明顯影響. 。. 五、毒性作用 1、急性毒性：葛根素注射液(溶於 30 %丙二醇 25 mg/ml)小鼠靜脈注射， LD50 為 735±28 mg/kg；將葛根素溶於生理食鹽水，50 mg/ml 靜脈注射 (24). 1 及 2 g/kg，觀察 1 周動物死亡. 。. 2、慢性毒性：狗在每天靜脈注射葛根素 10 或 30 mg/kg，連續 4 周對血液 學血液生化和主要器官病理檢查，均未發現異常；大鼠每天肌肉注射葛 根素 10 或 50 mg/kg 連續 3 個月，亦未出現毒性反應，但局部注射區有 (24). 一定刺激反應. 。. 六、臨床應用 1、對於冠心病心絞痛的作用 葛根素注射液治療冠心病，有硝酸酯類和β-接受器拮抗劑的優點，而 無硝酸酯類擴張血管的同時反射性心率增快、增加心肌耗氧量的缺點，也 無β-受體拮抗劑的負性肌力作用和增加血管外周阻力的缺點；臨床觀察， (29). 它可改善心肌缺血，有效減少心絞痛發作及持續總時間. 。. 2、對於高血壓的作用 葛根素制劑能降低血壓，除擴張血管、降低心率和通過類似β接受器拮 抗的作用外，還有抑制動脈硬化、降低血脂和改善微循環，預防繼發症的 18.
(20) (29). 發生. 。. 3、於腦供血不足與腦梗塞的作用 葛根素制劑治療腦供血不足，主要是通過擴張血管，解除腦血管痙攣來 改善腦部血液循環；而腦梗塞患者使用葛根素後，其紅血球細胞變形指數 (29). 明顯升高. 。. 4、對於視網膜動脈阻塞的作用 葛根素注射液治療視網膜動脈阻塞，可見視網膜感光區擴大，視力提 高，總有效率為 75 %. (29). 。. 5、對於青光眼的作用 康氏等用 1%葛根素滴眼溶液治療 80 例，143 隻青光眼，發現對未手術 的原發性廣角型、閉角型青光眼及繼發性青光眼均有降低眼內壓的作用， 對殘餘性青光眼及各型用其它降眼壓藥物效果不滿意者，加用 1 %葛根素滴 眼亦有一定降眼壓效果，總有效率為 70.6 %. (30). 。. 6、對於突發性耳聾的作用 葛根素注射液治療突發性耳聾 30 例，70%的患者在用藥兩周內，聽力 (29). 有不同程度的提高. 。. 綜合葛根素對心血管系統、血糖、血脂的影響及改善腦血循環，為臨 床上治療多種循環障礙疾病，提供了一個有價值的藥物，而改善腦血循環 是否會影響學習記憶，值得進一步深入探討。. 19.
(21) 第四節 學習記憶之文獻考察 一、學習記憶之形成過程 學習指經驗的獲得與發展，記憶則為經驗的保存與再現。一般記憶之 保存時間大致可分為三類，即短期記憶(short-term memory)、中期記憶 (intermittent-term memory)、及長期記憶(long-term memory) 進一步就訊息刺激後之學習記憶形成階段，則可分為四期. (31). ；再. (32). ：感覺記憶期. (sensory memory)-在事件發生後數秒鐘內的記憶；初級記憶期(primary memory)-在事件發生後數分鐘內的記憶，此類記憶僅能維繫數小時；二級 記憶期(secondary memory)-在事件發生後數月內的記憶，此類記憶可維繫 數年之久；三級記憶期(tertiary memory)-在事件發生後數十年內的記 20.
(22) 憶，此類的記憶形態可長達終生不忘。 事實上，不論任何的記憶階段，當外界之刺激訊息輸入後以至記憶之 形成，通常都需要經歷下述之階段，即學習獲得(acquisition)、記憶鞏固 (consolidation)、記憶再現(retrieval)及再學習獲得(reacquisition) 之過程；一旦新訊息經學習獲得記憶鞏固後，便進入中期記憶形態，若再 經不斷之再學習獲得或記憶之再現，而使記憶形態再次鞏固便可進入長期 (33). 記憶. 。另外，1995 年 5 月在日本京都國際會議中心召開的國際性生命科. 學專題研討會-學習記憶專題，Gasic 對此會議進行了綜合報導並對不同記 憶類型的腦內解剖結構定位進行總結(Fig.3). (34). 使大腦結構與記憶的相關. 性有了更進一步的了解。. 感覺記憶. 學習獲得. Ô. Ô. 短期記憶. 中期記憶. Ô. 長期記憶. à 記憶鞏固 à 記憶再現 再學習獲得. 訓練期. à 訓練後. à. 測定期. (33). Fig.2、學習記憶之形成圖. 21.
(23) 陳述性記憶： (事實、活動事件等)--內側顳葉 medial temporal lobe --間腦 diencephalon 記 憶 非陳述性記憶： (技巧、習慣)--紋狀體(striatum) (非聯合型學習)--反射通路(reflex pathway) (簡單的經典條件反射)--杏仁核(amygdala) --小腦(cerebellum). Fig. 3. (34). 記憶的腦內解剖結構定位. 二、腦內神經傳遞物質對記憶成形之影響 (一)、Cholinergic system 對記憶成形之影響 1971 年 Deutsh 指出，在新信習之儲存和再現過程，乙醯膽鹼神經元突 (35). 觸有明顯增加及改變之現象 。而在近期之行為藥理學之研究中，Drachman 及 Leavitt 發現年輕人在服用乙醯膽鹼蕈菌類接受器拮抗劑 SCOP 後，會產 (36). 生類似老年癡呆症之進行性健忘症狀. ；同時 Quartermain 及 Leo 亦發現. 給予大鼠 SCOP 後，可使腦內 cholinergic neuron 之 loss 而誘發學習行為 (37~40). 操作之障礙. ；之後在各種動物學習行為模式之研究，亦發現 SCOP 初期 (41). 的影響過程是在學習獲得的成形過程. ；實驗結果亦顯示，SCOP 會加強滯 (42). 留行為的障礙，同時提供了 SCOP 的障礙和學習成形相互關聯. 。. 另在乙醯膽鹼尼古丁接受器之拮抗劑 MECA，發現不僅可使腦內乙醯膽 22.
(24) 鹼神經系統之活性降低，亦可造成大鼠行為操作之障礙，但對學習行為模 (43). 式較具選擇性 。Oliverio 亦報告，MECA 會延遲小鼠主動迴避的學習獲得 (44). 和障礙迷宮的學習；同樣在小鼠的被動迴避的學習獲得造成障礙. 。. 近來在 basal forebrain 的 cholinergic neurons，特別是 nucleus basalis magnocellularis(NBM)與記憶過程的支配相關聯。在大鼠腦室給 予乙醯膽鹼神經毒素 AF64A，會降低 hippocampal 和 frontal cortex 之間 acetylcholine 的水平，且造成被動迴避學習記憶的障礙. (45). ；另在乙醯膽. 鹼神經毒素 AF64A 所造成之腦內乙醯膽鹼神經元之萎縮及大鼠學習行為操 作障礙，發現若植入富含乙醯膽鹼之神經元便可使記憶減退之現象得到恢 (46). 復. 。. 此外在 1990 年 Goto 指出，乙醯膽鹼之周邊接受器拮抗劑 meth-SCOP， (47). 可造成痛覺、感受及運動量之改變，但不會造成學習記憶之障礙 。因此， 在學習記憶之能力上，中樞乙醯膽鹼神經系統，確具重要參與之角色；而 在接受器之參與上，蕈菌類與尼古丁類接受器，均具正面之角色；但兩者 參與之學習記憶形態上則有不同之性質；其次，蕈菌類接受器之 M1 或 M2 接 (48). 受器則具相似之作用. 。. (二)、Catecholaminergic system 對記憶成形之影響 根據 Oei 之報告指出，周邊及中樞 noradrenergic system 在學習記憶 中扮演一定的角色. (48). 。在大鼠迴避學習記憶行為操作模式觀察，發現老化. 引起的大腦 NE 含量缺乏，會促成老化相關的迴避行為抑制不足；若給予大 (49). 腦 NE 取代治療則可改善老化動物的迴避行為抑制不足. 。. 1991 年 Harley 提 出 ， 在 成 年 哺 乳 類 大 腦 ， 作 用 於 perforant path-dentate gyrus synapse 可提供一個神經可塑性的模式。當內生性或 外生性 NE 被輸入，從 dentate gyrus 作用到 perforant path，可促發短 期和長時期的加強，促發這個加強作用依賴β-接受器的活化。另外增加 23.
(25) locus coeruleus(LC)的活性，可進入 perforant path 短期和長時期加強 (50). 的作用，降低 LC 的活性則不影響 baseline perforant path 的作用. 。. Oei 及 King 以 6-OHDA 造成腦部區域損壞之研究中，Pisa 及 Fibiger 指出 dorsal noradrenergic bundle(DNB)之 noradrena-line 在空間性記 (51). 憶能力及注意力，扮演一定之角色. 。另 Mason 和 Fibiger 在大鼠 food. reinforced spatial delayed alternation task 中，注射 6-OHDA 於 dorsal noradrenergic bundle，發現 cortex-hippocampus 的 NE 有 95% 的下降。更有報告指出注射 6-OHDA 於 A10 catecholamine 神經，對於大鼠 的 delayed alternation task、T-maze(food reinforcement)等，造成 (52). 行為障礙. 。. 報告指出，週邊 epinephrine 的釋放，可調節新訊息成形的貯存和促 進記憶的調節。訓練前給予 propranolol 及 phenoxyben-zamine，為α-及 β-接受器拮抗劑，會減弱 epinephrine 的記憶增強作用. (53). ；另給予大鼠β-. 接受器拮抗劑 propranolol，會阻礙行為的改善；當 propanolol(10 mg/kg) 併用 intrahippocampal SCOP (0.32 µg/side)，明顯增加 working memory 的錯誤，顯示 working memory 的行為，是經由 muscarinic 和 β-adrenergic (54). 共同調節神經傳遞的作用機轉. 。. (三)、Serotonergic system 對記憶成形之影響 1953 年在哺乳類的中樞神經系統內首次發現 serotonin. (55). 。經過證. 實 ， locus coeruleus(LC) 接 受 一 密 集 的 serotonin 神經的分佈，而 serotonin 的細胞體是在 raphe nuclei. (56). 。在無脊椎動物如海蝸牛所進行. 之條件學習反應研究中，認為記憶鞏固係 5-HT 釋出後，作用於突觸後接受 器導致突觸後神經內 protein kinase 之活化，以促進蛋白質合成及基因之 複製. (57). 。Serotonin 包含多種 5-hydroxytryptamine 受體次單位，如： (57). 5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT5、5-HT6、5-HT7 24. 。研究數據指出，個.
(26) (58). 別刺激或阻斷 5-HT1B 和(或)5-HT2A/2C 接受器，會障礙或加強學習. ；另外文. 獻指出 serotonin 在辨識過程，是經由過度釋放而非耗盡來產生滯留行為 的障礙. (59). 。. PCA 為 serotonin 釋出促進劑，可增加中樞 serotonin 之活性而誘發 學習獲得障礙。在大鼠 one-way 主動迴避模式的學習和滯留及被動迴避模 式的滯留，PCA 會造成一個劑量和時間相關的障礙；一聯串的研究亦指出， PCA 會導致迴避學習的缺乏，是藉由刺激突觸後的 serotonin 接受器而產生 serotonin 的釋放所致。由 PCA 導致的主動迴避模式的學習獲得不足，被認 為是經由刺激 5-HT2 接受器而促成；被動迴避模式的滯留則被認為是經由 (60). 5-HT1 接受器而促成 ；另外 PCA 所引起的健忘，可被小鼠訓練後給藥 5-HT2 接受器拮抗劑：ritanserin-(RIT)、miaserin(MIA)逆轉，但 SCOP 引起的 (61). 健忘則不行. 。. 腹 腔 注 射 給 予 大 鼠 5-HT1A 接 受 器 作 用 劑 ： 8-OH-DPAT ，明顯增加 three-panel task 的錯誤次數，但在參考記憶(reference memory)測試， 則沒有作用；這提供當活化 hippocampus 的 5-HT1A 受體會障礙 working (62). memory 但不影響 reference memory 的保留 。另在大鼠的 working memory task(delay non-matching to position, DNMTP)障礙實驗中，結果顯示 併用 5-HT1A 接受器作用劑 8-OH-DPAT 及 5-HT2 接受器作用劑 DOI，可干擾大 (63). 鼠在 DNMTP 中的非辨識行為. 。. (四)、Exitatory amin acid(EAA) 對記憶成形之影響 興 奮 性 氨 基 酸 一 般 可 分 為 kinate 、 quisqualata( 或 AMPA) 、 N-methyl-D-aspartate(NMDA)等三類。Flood 等之研究認為，NMDA 或非 (64). NMDA 接受器拮抗劑，均可造成學習獲得障礙，但對記憶再現則不受影響 。 實驗結果顯示，在老年小鼠的學習和記憶缺乏和中樞 EAA 神經傳遞系統的 減 少 相 互 關 聯 。 另 外 長 時 期 加 強 (LTP, long-term potentiation) 在 25.
(27) (65). hippocampus 的神經突觸傳遞，亦是藉由 NMDA 受體促成. 。. 1973 Bliss 和 Lomo 提出，誘導 hippocampus 的 LTP：一種神經可塑 性的細胞模式，顯示 LTP 需要 NMDA 受體的活化。給予非競爭 NMDA 接受器 拮抗劑 dizoclipine(MK-801)和 phencyclidine(PCP)顯示，可阻斷體外實 驗的 hippocampus LTP，並且障礙 hippocampus 相關依賴的行為，例如： 位置和空間的學習. (66). 。另外給予大鼠 MK-801，在電刺激幾分鐘前 i.c.v.. 灌入 hippocampus 區域，會障礙大鼠迴避電刺激區域的技能。此外，臨床 研究指出，阿耳海默滋氏症的癡呆和神經變質退化，和 EAA 傳遞功能低下 (67). 相關聯，特別是 hippocampal NMDA 接受器通道的功能異常. 。. (五)、蛋白質合成對記憶成形之影響 在記憶成形的過程，當細胞的過極化可能聯合 sodium pump 活性，而 傳送顯著的片面記憶的追溯，再經由蛋白質的合成使更永久記憶的追溯能 夠成形. (68). ，所以在記憶鞏固過程蛋白質合成為必需因素，因此蛋白質合成. 抑制績劑如 cycloheximide、anisomycin、puromycin 等，均能造成記憶 鞏固損害之現象。CXM 主要經由阻斷 mRNA 之轉錄，約可抑制 80%蛋白質合 (69). 成，以造成記憶鞏固之障礙. 。另一方面在 Nabeshima 等之研究中指出，. CXM 誘發記憶鞏固障礙與神經傳遞物質間有密切關係；主要經增加中樞 (70). serotonergic system 之活性以間接降低 cholinergic system 之活性. ，. (71~72). 並影響中樞 adrenergic system、GABAergic system 之活性. 。故本研. 究使用 CXM 為誘發記鞏固障礙之藥物，並藉其與各神經傳遞物質之密切關 係做更進一步的機轉探討。. 26.
(28) 第五節 阿耳滋海默氏症與腦內神經傳遞物質之關係 在工業化的社會，阿耳滋海默氏症(Alzheimer’s diease,AD)是一種神 經退化的疾病，癡呆是其最共通的病兆。而隨年齡的增長，發生阿耳滋海 默氏症的危險，當超過 40 歲每增加 5.1 年便加倍發生，85 歲以上更增加到 (73). 50%以上的發生率. 。阿耳滋海默氏症的症狀，平均潛伏 8~10 年才開始發 (74). 作，或經過診斷後的 4~5 年之間才開始發作. 。. 阿耳滋海默氏症是一種大腦退化和導致癡呆的疾病，其病理過程可能是 下列因素引起：在神經病理(neuropathology factor)方面，在大腦 nucleus basalis of Meynert(NBM)區發現神經退化斑塊(senile plaques)、神經 纖維纏繞(NFT)及膽鹼能神經的喪失等現象。在基因(genetic factor)方 面，神經退化斑塊的形成是因為β-amyloid protein 的沉澱增長或促進， 而 神 經 纖 維 纏 繞 則 是 Tau protein 的 異 常 磷 酸 化 反 應 造 成 。 在 生 化 (biochemical factor)方面，如發炎、氧化、壓力、荷爾蒙缺乏(如 estrogen) 和其它未確切的危險因子(如老化)。但導致阿耳滋海默氏症最危險的二個 因子，一個是老化和陽性家族史，另一個危險因子則是頭部外傷. (73). 。另在. 早發性、遲發性的 AD，已確定老化、家族史、apolipoproten E gene-e4 (74). 的遺傳突變基因是危險因子. 。 27.
(29) 於神經病理更進一步的研究，在大腦 basal forebrain 區阿耳滋海默 氏症病人在該區之 cholinergic neurons 有顯著之神經纖維病變及神經末 梢 退 化 現 象 ， 且 在 其支配區 hippocampus 之 CA1 區及 neocortex 之 temporal cortex、frontal cortex 區均有斑塊形成及顯著之神經纖維病 變。另在 brain stem 區，阿耳滋海默氏症病人在中樞 noradrenergic system 之前 locus coeruleus 區的神經細胞數目明顯減少並出現神經纖維病變而 中樞 serotoergic system 之 raphe nuclei 區亦出現神經纖維病變；顯示 noradrenergic system 及 serotonergic system 與阿耳滋海默氏症病人 之記憶能力減退，有密切之關係。由此顯示 hippocampus 區神經之損害， 在阿耳滋海默氏病人之記憶能力減退現象中，扮演極重要之角色；而 neocortex 區神經之損害，則與阿耳滋海默氏病人之運動機能及視力有較密 切之關係. (76~77). 。茲將阿耳滋海默氏症與中樞神經傳遞物質間之關係敘述如. 下：. 1、在 cholinergic system 方面 阿 耳 滋 海 默 氏 病 人 腦 內 basal forebrain 之 NBM 區及其支配之 frontal cortex、parietal cortex、basolateral amygdala 區等有極廣 泛之細胞損減現象，而膽鹼乙醯轉移脢(CHAT)、乙醯膽鹼酯解脢(AchE)之 密度及乙醯膽鹼之濃度亦有明顯降低現象. (75、77). 。由此可知在阿耳滋海默氏 (76~78). 病人其中樞 cholinergic system 之功能明顯下降. ，特別是 NBM 區及其. 支配之 frontal cortex、parietal cortex、basolateral amygdala 區 之軸突及神經末梢。 2、在 catecholaminergic system 方面 阿耳滋海默氏病人腦內 forntal cortex 及 hypothalamus 區之前 norepinepherine 濃度有明顯降低而其代謝物 MHPG 之濃度則有增加現象 (76). ； 另 根 據 Tomlinson 氏 等 研 究 指 出 在 阿 耳 滋 海 默 氏 病 人 ， 其 腦 內 28.
(30) noradrenergic system 主要分佈區域 locus coeruleus(LC)有明顯之細胞 (79). 減損現象. ；而在 AAMI(aged-associated memory impairment)亦發現中 (80). 樞 noradrenergic system 之功能有顯著之下降. 。由此可知在阿耳滋海. 默氏病人中樞 noradrenergic system 之活性明顯下降。. 3、在 serotonergic system 方面 阿耳滋海默氏病人腦內 temporal cortex 及 frontal cortex 區之 5-HT (76). 及 5-HIAA 濃度有明顯降低. ，而在中樞 serotonergic system 接受器鍵. 結能力及受體密度之研究上亦指出腦內 ascending serotonergic system 包括 hippocampus、neocortex、amygdala 之接受器密度有明顯之降低， 且在 temporal cortex 及 frontal cortex 區突觸前之 5-HT2 receptors 亦有明顯之減損. (81 、 82). 。另外在阿耳滋海默氏患者中的 dorsal raphe. nucleus(DRN)及 hippocampus 的 CA2 子域及 entorhinal 皮質，都可發現 (72). serotonin transporter(5-HTT)部位亦明顯減少. 。由此可知在阿耳滋海 (83). 默氏病人中樞 serotonergic system 之活性明顯下降. 。. 4、在 excitatory amino acid(EAA) 方面 阿耳滋海默氏病人顯示′′excitotoxic environment’’會降低能量的可 (84). 用活性，增加氧化和 amyloid、β-peptide 的堆積. 。近來發現一種新型. 的興奮性毒性(excitotoxicity)，當 glutamate 傳遞功能低下時會產生一 種新型興奮性毒性，而引起一網路式的混亂，進而促發廣泛的神經損傷及 較慢的漸行性退化，導致細胞死亡。此神經毒性過程會因阻斷 GABA 神經上 的 NMDA 接受器而解除；當 glutamate 正常的情況下會抑制 GABA，若阻斷 NMDA 即會阻斷 GABA 的抑制；因此會引起分佈在大腦皮質及 limbic brain 區域的 cholinergic 及 glutamatergic 的接受器異常過度的活化，而大腦 皮質及 limbic brain 區域為可看到阿爾滋海默氏症特徵的區域。. 29.
(31) 第三章 實驗材料與方法 第一節 實驗材料 一、實驗試劑 1、 Phenoxybenzamine、propranolol、cycloheximide、scopolamine、 mecamylamine、p-chloroamphetamine(以上均購自 Sigma 公司)。 2、5,7-dihydroxytryptamine、6-hydroxydopamine、acetylcholine mustard hydrochloride、tacrine 、8-hydroxy-2-(di-npropylamino)tetraline hydrobromide 、1-(2,5-dimethoxy-4iodophenyl)-2 aminopropane (以上均購自 RBI 公司)。 3、Ringer soultion、normal saline(以上均購自天立公司)。 4、葛根素(puerarin，購自 Sigma 企業股份有限公司). Table 2. 實驗試劑之簡稱、作用機制、購買公司一覽表 試劑全名. 簡稱. 作用機制. 公司. scopolamine hydrobromide. SCOP. 毒蕈鹼接受器拮抗劑. Sigma. mecamylamine hydrochloride. MECA. 尼古丁接受器拮抗劑. Sigma. dizocilpine maleate. MK-801 非競爭 NMDA 接受器拮抗劑 RBI. p-chloroamphetamine. PCA. 5-HT 釋出促進劑. Sigma. cycloheximide. CXM. 蛋白質合成抑制劑. Sigma. propranolol. PRO. β-接受器拮抗劑. Sigma. phenoxybenzamine hydrochloride. PHE. 選擇性α-接受器拮抗劑. Sigma. 30.
(32) 1-(2,5-dimethoxy-4-iodopheny DOI l)-2 aminopropane. 5-HT2 接受器致效劑. 8-0H-DP 5-HT1A 接受器致效劑 8-hydroxy-2-(di-n-propyla mino)tetraline hydrobromide AT. RBI RBI. tacrine. TAC. 膽鹼酯脢抑制劑. RBI. Acetylcholine mustard hydrochloride. AF64A. cholinergic neurotoxin. RBI. 6-hydroxydopamine. 6-OHDA noradrenergic neurotoin RBI. 5,7-dihydroxytryptamine. 5,7-DHT serotonergic neurotoxin RBI. 二、實驗動物 本實驗採用中國醫藥學院動物中心所提供之 Sprague-Dawley 系雄性 大鼠，體重 250-300 公克，6 隻一籠，飼養室溫維持 24±1°C，光照與黑暗 各為小時(8:00 開燈，20:00 關燈)，飲水及飼料均不加以限制，全部實驗 皆在白天進行。. 三、實驗儀器 本實驗係使用[被動迴避(passive avodance)學習反應裝置] (Muromachi Kikai Co. Ltd. Japan)，此裝置分成兩部分，實驗箱(shuttle box)係為一經中間閘門分隔為相同大小二室(48×20×30cm)的箱子及其控制 器(MCU-101 Controller，Muromachi Kikai Co. Ltd. Japan)；在實驗 裝置處置上，於相同大小二室之其中一室，上方 30cm 處置一 20W 之燈泡， 相同大小二室區隔為明暗二室，中以門閘控制。. 31.
(33) 第二節 實驗方法與步驟 一、被動學習反應 適應期：於訓練 24 小時，先將大鼠置於實驗室中適應 2 小時後， 置入實驗室之明室中，同時閘門開啟，待 10 分鐘後， 取 出大鼠，歸回飼養籠。 訓練期：將篩選過之大鼠，置入明室，同時開啟閘門，待大鼠 進入暗室後，關閉閘門，同時於底板通以電流(1 mA，2 sec)，待電刺激後 5 秒，自暗室取出大鼠，歸回飼養籠。 測定期：於訓練後 24 小時，再置入明室，同時並開啟閘門，記 錄大鼠在明室之滯留時間(step-through latency，STL) 。當於明室之滯留時間大於 5 分鐘(300 秒)時，則稱大鼠 之學習記憶能力正常。(方法一). 二、葛根素之腦血流測定 以動物血液循環測定儀，依杜普樂原理測定其腦血管之血循速度。在腦 殼中線旁開 2.5~3 mm，中耳線往前 4.2~4.5 mm 處，鑽一 1~2 mm 直徑的洞， 硬腦膜保持完整，將雷射杜普樂探針(針尖直徑 0.8 mm)置於距硬腦膜表面 上 0.5 mm 處測腦血流。於鑽洞後持續監測腦血流，直至腦血流穩定後記錄 腦血流並腹腔注射給與葛根素（25、50 mg/kg），每隔 10 分鐘觀測其腦血 流並記錄之。. 32.
(34) 三、葛根素對誘發被動迴避學習反應障礙物質之影響 三種不同劑量之葛根素(10、25、50 mg/kg，)於腹腔注射後 30 分鐘 進行訓練，且與下述之誘發學習障礙物質併用，依前法(方法一)，記錄大 鼠在明室之滯留時間。病理對照組給予下述之誘發學習記憶障礙物質。而 空白對照組則給予 vehicle。正對照組則給予 tacrine(1 mg/kg，i.p.)， 給藥後 90 分鐘進行訓練。 1、學習獲得障礙誘發物質： SCOP(1 mg/kg，i.p.)於訓練前 30 分鐘給藥。 MECA(10 mg/kg，i.p.) 於訓練前 30 分鐘給藥。 PCA(5 mg/kg，i.p.) 於訓練前 30 分鐘給藥。 MK-801(0.1 mg/kg，i.p.) 於訓練前 30 分鐘給藥。 2、記憶鞏固障礙誘發物質： CXM(1.5 mg/kg，s.c.) 於訓練後立刻給藥。. 四、葛根素對 cycloheximide 誘發被動迴避學習反應障礙 物質之機轉 葛根素(50 mg/kg)，於腹腔注射後 30 分鐘進行訓練，並於訓練後與 CXM(1.5 mg/kg，s.c.)併用。依前法(方法一)，記錄大鼠在明室之滯留時 間。病理對照組給予下述之誘發學習記憶障礙物質。而空白對照組則給予 vehicle。 1、本實驗所併用物質之劑量及時間分別為： SCOP(0.3 mg/kg，i.p.)於訓練後給藥。 MECA(3 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。 PCA(1.0 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。 8-OH-DPAT(0.025 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。 DOI(0.02 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。 33.
(35) PRO(3 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。 PHE(0.01 mg/kg，i.p.) 於訓練後給藥。. 五、雙側腦部 dorsal raph 區投與 serotonergic neurotoxin 5,7-DHT 對葛根素改善學習記憶之影響 腦部 dorsal raphe 區(座標：bregma 往後 7.8 mm，往兩側 0.3 mm， 深度 6.4 mm) 給予 5,7-DHT (10 µg/5 µl)破壞兩側 dorsal raphe 區 serotonin 神經元，7 天後；於訓練後，於腦室立刻給予二種不同劑量之葛 根素養(5、10 µg/20 µl)， 記錄大鼠在 24 小時後之測定期在明室之滯留 時間。病理對照組給予 5,7-DHT。 而空白對照組則給予 vehicle，並進行 假手術組以比對之。. 六、雙側腦部 locus coeruleus 區投與 noradrenergic neurotoxin 6-OHDA 對葛根素改善學習記憶之影響 腦部 locus coeruleus 區(座標：bregma 往後 9.8 mm，往兩側 1.3 mm， 深度 7.2 mm)給予 6-OHDA(4 µg/2 µl)破壞兩側 locus coeruleus 區 noradrenaline 神經元，7 天後；於訓練後於腦室立刻給予二種不同劑量之 葛根素(5、10 µg/20 µl)記錄大鼠在 24 小時後之測定期在明室之滯留時 間。病理對照組給予 6-OHDA 。而空白對照組則給予 vehicle，並進行假手 術組以比對之。. 七、側腦室投與 cholinergic neurotoxin AF64A 對葛根素 改善學習記憶之影響 側腦室(座標：bregma 往後 0.9 mm，往兩側 1.4 mm，深度 3.6 mm)給. 34.
(36) 予 AF64A(3 nmol/side)破壞 hippocampus 區 acetylcholine 神經，7 天後； 於訓練後於腦室立刻給予二種不同劑量之葛根素養(5、10 µg/20 µl)， 記 錄大鼠於 24 小時後之測定期在明室之滯留時間。病理對照組給予 AF64A。 而空白對照組則給予 vehicle，並進行假手術組以比對之。. 八、數據統計 本實驗大鼠在被動迴避學習反應所得之數據，以 Kruskal-Wallis non-parametric one- way analysis，分析其變異數再以 Mann-Whitney U-test 統計並分析其間之顯著性。凡 P 值小於 0.05 以下時，則認為有統計 意義。. 35.
(37) 第四章 實驗結果 一、葛根素之腦血流測定 如圖四所示，葛根素經腹腔注射給與，僅在 50 mg/kg 劑量 下達到最高腦血流，時間為 30 分鐘。. 30. ***. Vehicle Puerarin 25 mg/kg Puerarin 50 mg/kg. ***. ***. ∆cerebral blood flow rate (ml/min/100 g tissue). 40. 20. 10. 0. -10 10. 20. 30. 40. 50. 60. Time (min). Fig 4. Effects of puerarin (25 and 50 mg/kg, i.p.) on the changed cerebral blood flow rate of middle cerebral artery measured by laser Doppler flowmetry in rats. ∗∗∗ p< 0.001, compared with the vehicle group.. 36.
(38) 二、葛根素對誘發被動迴避學習反應障礙物質之影響 1、PUR 對 SCOP 誘發被動迴避學習反應障礙之影響 如圖五所示，訓練前 30 分鐘給予 SCOP(1 mg/kg，i.p.)，可縮短大鼠 在明室之滯留時間，誘發大鼠學習獲得障礙。PUR(10、25、50 mg/kg)經腹 腔注射給藥後，對 SCOP(1 mg/kg，i.p.) 誘發之大鼠學習獲得障礙，不具 改善作用。. (16) (16). Step through latency (sec) Step through latency (sec). 300 300. 200 200. 100 100. (11) (11) 0. 0. VEH VEH. VEH VEH. (12) (12) 10. 10. (12) (12). 25. 25 PUR (mg/kg) PUR (mg/kg). (10) (10) 50. 50. SCOP 1 mg/kg SCOP 1 mg/kg. Fig 5. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on scopolamine (SCOP, 1 mg/kg)-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats. Each. 37.
(39) column represents the medain, and the range inside 5th and 95th percentile.. 如圖六所示，PUR(10、25、50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 SCOP(0.5 mg/kg，i.p.) 誘發之大鼠學習獲得障礙，不具改善作用。. (16) (16). 300. 200. Step through latency (sec). Step through latency (sec). 300. 200. 100 100. (12) (12). (12) (12). (12) (12). 0 0. VEH VEH. VEH VEH. 25. 50 25 50 PUR (mg/kg) PUR (mg/kg) SCOP 0.5 mg/kg SCOP 0.5 mg/kg. Fig 6. Effects of puerarin (PUR, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on scopolamine (SCOP) at subdose (0.5 mg/kg)-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the medain, and the range inside 5th 38.
(40) and 95th percentile.. 2、PUR 對 PCA 誘發被動迴避學習反應障礙之影響 如圖七所示，訓練前 30 分鐘給予 PCA(5 mg/kg，i.p.)，可縮短大鼠 在明室之滯留時間，誘發大鼠學習獲得障礙。PUR(10、25、50 mg/kg，) 經腹腔注射給藥後，僅於 25、50 mg/kg 劑量下，對 PCA(5 mg/kg，i.p.) 誘 發之大鼠學習獲得障礙，具改善作用(p<0.001)。. (16). Step through latency (sec). 300. ***. 200. (16). 100. *** (14) (12). (12). VEH. 10. 0 VEH. 25. 50. PUR (mg/kg) PCA 5 mg/kg. Fig 7. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on p-chloroamphetamine (PCA, 5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ 39.
(41) p<0.001, compared with PCA/VEH group.. 3、PUR 對 MK-801 誘發被動迴避學習反應障礙之影響 如圖八所示，訓練前 30 分鐘給予 MK-801(0.1 mg/kg，i.p.) ，可縮短大鼠在明室之滯留時間，誘發大鼠學習獲得障礙。PUR(10、25、 50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，僅於 25、50mg/kg 劑量下，對 MK-801(0.1 mg/kg ，i.p.) 誘發之大鼠學習獲得障礙，具改善作用(p<0.05)，且於 50mg/kg 之劑量下作用較佳(p<0.01)。. (16). Step through latency (sec). 300. 200. 100. ** * (10). (10). (12). 10. 25. (10). 0 VEH. VEH. 50. PUR (mg/kg) MK-801 0.1 mg/kg. Fig 8. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on MK-801 (0.1 mg/kg)-induced. 40.
(42) acquisirion impairment of the passive avoidance in rats. Each column represents the median, and the range inside 5th and 95th percentile. ∗ p<0.05, ∗∗ p<0.01, compared with MK-801/VEH group.. 4、PUR 對 MECA 誘發被動迴避學習反應障礙之影響 如圖九所示，訓練前 30 分鐘給予 MECA(10 mg/kg，i.p.)，可縮短大 鼠在明室內之滯留時間，誘發大鼠學習獲得障礙。PUR(10、25、50 mg/kg，) 經腹腔注射給藥後，對 MECA(5 mg/kg，i.p.) 誘發之大鼠學習獲得障礙， 具改善作用(p<o.oo1)。. (16) 300. Step through latency (sec). *** (14) 200. 100. ***. (14). * (14) (12) 0 VEH. VEH. 10. 25. 50. PUR (mg/kg) MECA. 10 mg/kg. Fig 9. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on mecamylamine (MECA, 10 41.
(43) mg/kg)-induced acquisition impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group.. 5、PUR 對 CXM 誘發被動迴避學習反應障礙之影響 如圖十所示，訓練後立即給予 CXM(1.5 mg/kg，s.c.)，可縮短大鼠 在明室之滯留時間，誘發大鼠記憶鞏固障礙。PUR(10、25、50 mg/kg，) 經腹腔注射給藥後，僅於 25、50 mg/kg 劑量下，對 CXM(1.5 mg/kg，s.c.) 誘發之大鼠記憶鞏固障礙，具改善作用(p<0.001)。. (16)(16) (16). Step through Step through latencylatency (sec) (sec) Step through latency (sec). 300300. 200. ***. 200200. (14). ******. (14)(14). 100. ***. 100100. (14) (12). (12). 0 VEH. 0. VEH. (12)(12). 0 VEH VEH. VEH VEH. 10. ****** (14)(14) 25. 50. (12)(12) PUR (mg/kg) CXM. 10 10. 1.5 mg/kg. 25 25. 50 50. PURPUR (mg/kg) Fig 10. Effects of puerarin(PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on cycloheximide (mg/kg) (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance CXM 1.5 mg/kg response in rats. Each column represents the CXM median,1.5 andmg/kg the range inside the 5th and 95th percentile. *** p < 0.001, compared with CXM/VEH group.. Fig 10. Effects of puerarin (PUR, 10, 25 and 50 mg/kg, i.p.) on cycloheximide (CXM, 42.
(44) 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group.. 三、葛根素對 cycloheximide 誘發被動迴避學習反應障礙 物質之機轉 1、如圖十一所示，PUR(25 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，可 被 SCOP(0.3 mg/kg，i.p.)部分拮抗(p<0.05)。. (16). (14). 300. Step through latency (sec). a 200. ***. (10). 100. **. (10). (12) 0 VEH. SCOP. VEH. PUR CXM. PUR+SCOP. 1.5 mg/kg. Fig 11. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus scopolamine (SCOP, 0.3 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance 43.
(45) reponse in rats. Each column represents the median, and the range inside 5th and 95th percentile. ∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. a p<0.05, compared with PUR/CXM group.. 2、如圖十二所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用， 可被 MECA(3 mg/kg，i.p.)部分拮抗(p<0.01)。. (16). (14). 300. Step through latency (sec). aa 200. ***. (10). 100. **. (10). (12) 0 VEH. MECA. VEH. PUR CXM. PUR+MECA. 1.5 mg/kg. Fig 12. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus mecamylamine (MECA, 3 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 44.
(46) 95th percentile. ∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/ VEH group. aa p<0.01, compared with PUR/CXM group.. 3、如圖十三所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用， 可被 PCA(1 mg/kg，i.p.)所拮抗(p<0.001)。. (16). (14). 300. Step through latency (sec). a 200. ***. (10). ***. (12). 100. (12) 0 VEH. PCA. VEH. PUR CXM. PUR+PCA. 1.5 mg/kg. Fig 13. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus p-chloroamphetamine (PCA, 1 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. a p<0.005, compared with PUR/CXM group.. 45.
(47) 4、如圖十四所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg ， s.c.) 誘 發 大 鼠 記 憶 鞏 固 障 礙 之 改 善 作 用 ， 無 法 被 8-OH-DPAT(0.025 mg/kg，i.p.)所拮抗(p<0.01)。. (14). (16) 300. (16). (14). 200 Step through latency (sec). Step through latency (sec). 300. ***. 200. (10) *** (10). ***. 100. (14) *** (14). 100. (12) (12). 0 0. VEH DPAT VEH PUR PUR+DPAT VEH DPAT VEH PUR PUR+DPAT CXM 1.5 mg/kg CXM 1.5 mg/kg. Fig 14. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus 8-OH-DPAT (DPAT, 0.025 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group.. 46.
(48) 5、如圖十五所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，可被 DOI(0.02 mg/kg，i.p.)所拮抗(p<0.01)。 Fig 15. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus DOI (0.02 mg/kg) on cycloheximide. (16). (14). 300. Step through latency (sec). aa 200. ***. (10). 100. (12) (12) 0 VEH. DOI. VEH. PUR CXM. PUR+DOI. 1.5 mg/kg. (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. aa p<0.01, compared with PUR/CXM group.. 47.
(49) 6、如圖十六所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用， 可被 PRO(3 mg/kg，i.p.)所拮抗(p<0.01)。. (16). (14). 300. Step through latency (sec). aa 200. ***. (10). 100. (12) (12) 0 VEH. PROP. VEH. PUR CXM. PUR+PROP. 1.5 mg/kg. Fig 16. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus propranolol (PROP, 3 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance reponse in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. aa p<0.01, compared with PUR/CXM group.. 48.
(50) 7、如圖十七所示，PUR(50 mg/kg)經腹腔注射給藥後，對 CXM (1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用， 可被 PHE(0.01 mg/kg，i.p.)所拮抗。. (16). (14). 300. Step through latency (sec). a 200. ***. (10). (16). PUR. PUR+PHE. 100. (12) 0 VEH. PHE. VEH CXM. 1.5 mg/kg. Fig 17. Effects of puerarin (PUR, 50 mg/kg, i.p.) plus phenoxybenzamine (PHE, 0.3 mg/kg) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. a p<0.05, compared with PUR/CXM group.. 49.
(51) 五、 雙側腦部 Dorsal raph 區投與 serotonergic neurotoxin 5,7-DHT 對葛根素改善學習記憶之影響 如圖十八所示，於腦部給與 PUR(1、5、10、25 µg/20 µl)，對 CXM(1.5 mg/kg，s.c.) 誘發之大鼠記憶鞏固障礙，於 5、10、25 µg/20 µl 劑量下， 均具改善作用(p<0.01)，且於 10、25 µg/20 µl 劑量下作用較佳(p<0.001)。. ****** ****** (14)(14) (12)(12). (12)(12). Step-through latency (sec). Step-through latency (sec). 300 300. 200 200. ** **. 100 100. (12)(12) (13)(13) (14)(14). 0. 0. VEHVEH VEHVEH. 1. 1. 5 5 10 10 25 25 PURPUR (µg/20 µl, i.c.v.) (µg/20 µl, i.c.v.) CXM 1.5 mg/kg CXM 1.5 mg/kg. Fig 18. Effects of puerarin (PUR, 1, 5, 10 and 25 µg/ 20µl, i.c.v.) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group.. 如圖十九所示，PUR(5、10 µg/20 µl)於腦室給藥，在 5,7-DHT(4 µg/2 50.
(52) µl/side)破壞 dorsal raphe 後，對 CXM(1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠記 憶鞏固之障礙仍具改善作用。. 600. (12). *** (14). (10). (12). *** (14). (10). Step-through latency (sec) Step-through latency (sec). 600500. 500400. *** (14). 400300. **. (10). *** (14). 300200. **. (10). ** (12). 200100. (16). (13)**. 100. 0. 0. (12) VEH(13)VEH 5. 10. VEH. (16) VEH. 5. PUR VEH. 10 PUR. VEH. 5 CXM10 vehicle PUR (intra-DR). VEH. CXM. VEH. 5 CXM 10 5,7-DHTPUR (intra-DR) CXM. vehicle (intra-DR). 5,7-DHT (intra-DR). Fig 19. Effects of puerarin (PUR, 5 and 10 µg/20 µl, i.c.v.) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in sham operated or dorsal raphe lesioned rats induced by 5,7-DHT (4 µg/2 µl/side). Each column represents the median, and the range of the 5th and 95th percentile. *** p < 0.001, compared with CXM/VEH group.. 51.
(53) 五、雙側腦部 locus coeruleus 區投與 noradrenergic neurotoxin 6-OHDA 對葛根素改善學習記憶之影響 如圖二十所示，PUR(5、10 µg/20 µl)於腦室給藥，在 6-OHDA(4 µg/2 µl/side)破壞 locus coeruleus 後，對 CXM(1.5 mg/kg，s.c.) 誘發大鼠 記憶鞏固之障礙，只在 10 µg 劑量下具改善作用(p<0.01)，但仍比假手術 組的改善作用明顯下降。. Step-through latency (sec). Step-through latency (sec). 300 300. ******. (12)(12). (14)(14). (10)(10). 200 200 aaa aaa. ** **. (16)(16). 100 100. ** **. (12)(12) (10)(10)aaa aaa (14)(14). (13)(13) 0. 0 VEH VEH VEH VEH 5 5 10 10 puerarin puerarin. VEHVEHVEHVEH 5 5 10 10 puerarin puerarin. CXM CXM vehicle (intra-LC) vehicle (intra-LC). CXM CXM 6-OHDA (intra-LC) 6-OHDA (intra-LC). Fig 20. Effects of puerarin (PUR, 5 and 10 µg/20 µl, i.c.v.) on cycloheximide (CXM, 1.5 mg/kg)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in sham operated or locus coeruleus (LC) lesioned rats induced by 6-OHDA (4 µg/2 µl/side). Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗∗ p<0.001, compared with CXM/VEH group. aaa p<0.001, compared with PUR/CXM group. 52.
(54) 六、側腦室投與 cholinergic neurotoxin AF64A 對葛根素 改善學習記憶之影響 如圖二十一所示，於側腦室給予 AF64A(3 nmole/ml per brain)後可 誘發大鼠學習記憶障礙。PUR(5、10 µg/20 µl)於腦室給藥後，對 AF64A(3 nmole/ml per brain)誘發之大鼠學習記憶障礙，僅於 10 µg/2 0µl 劑量 下具改善作用(p<0.01)。. (12) 600. **. Step-through latency (sec). (12). 400. (14). 200 (20). 0 VEH. VEH. 5. 10. PUR (µg/20 µl, i.c.v.) AF64 A 3 nmol/3 µl. Fig 21. Effects of puerarin (PUR, 5 and 10 µg/20 µl, i.c.v.) on AF64A (3 nmol/3 µl)-induced consolidation impairment of the passive avoidance response in rats. Each column represents the median, and the range inside the 5th and 95th percentile. ∗∗ p<0.01, compared with AF64A/VEH group.. 53.
(55) 第五章 討 論 近期研究，引起阿耳滋海默氏症之病理因素，是大腦的神經和神經密 度的喪失；特別是在 frontal 和 parietal 的 neocortex，包含許多神經系 統，最重要的是 cholinergic system，緊接著是 noradrenergic system 和 serotonergic system. (74). 。. 另在記憶形成過程，人體首要反應便是神經活性之改變，而這亦包含 acetycholine、dopamine 及 serotonin 等神經系統之改變。更進一步，則 牽涉蛋白質之合成及基因轉錄之過程。. (86). 首先，中樞乙醯膽鹼神經系統，. 已經確認在學習過程扮演重要角色，而乙醯膽鹼拮抗劑 scopolamine 誘發 之智能障礙型態，亦已廣被使用於篩選各類智能增進劑開發之動物模式 (87). 。本研究於訓練前投與 SCOP，可縮短大鼠在明室之滯留時間，造成學習. 獲得障礙，證實學習獲得過程需乙醯膽鹼神經系統之參與。葛根素在三種 劑量下(10、25、50 mg/kg 經腹腔注射給藥對 SCOP(1 mg/kg，i.p.)誘發 大鼠學習獲得障礙，均無改善作用；且當 SCOP 以較低劑量(0.5mg/kg，i.p.) 誘發大鼠學習獲得障礙時，葛根素亦無改善作用。但正對照組 tacrine，在 1 mg/kg 下即有改善作用。其次研究指出，不論在臨床阿耳滋海默氏症之病 理研究或動物學習行為模式報告，均證實乙醯膽鹼尼古丁接受器，在病變 過程及學習記憶形成過程中亦扮演重要的角色. (87). 。若將尼古丁投與阿耳滋. 海默氏症或智能缺陷大鼠，均可改善或增強其學習操作能力。而乙醯膽鹼 尼古丁接受器拮抗劑 MECA，不僅可使腦內乙醯膽鹼神經系統之活性降低， 亦可造成大鼠學習行為操作之障礙。本研究於訓練前投與 MECA，可縮短大 鼠在明室之滯留時間，造成學習獲得障礙，證實學習獲得過程，需乙醯膽 鹼尼古丁接受器之參與。葛根素在 10、25、50 mg/kg 劑量下，對 MECA 誘 發大鼠學習獲得障礙具有改善作用。另在中樞 serotonin 系統，在脊椎動 (88). 物之學習行為模式中，咸認為扮演負向角色 54. 。PCA 為 serotonin 釋出促.
(56) 進劑，可使中樞 cortex、spinal cord、hippocampus 區之突觸前神經元 serotonin 儲存區內的 serotonin 大量釋出，致使 cortex-hippocampus 區之 5-HT2 接受器活化，造成學習記憶障礙之作用. (89、90). ；而在上述區域之. (91). 5-HT2 接受器對 Ach 之釋出具極強之抑制作用. 。於訓練前投與 PCA，經腹. 腔注射可誘發大鼠學習獲得障礙。本研究於訓練前投與 PCA 亦可縮短大鼠 在明室之滯留時間，造成學習獲得障礙，證實學習獲得過程需要 serotonin 神經系統之參與。葛根素在 25、50 mg/kg 劑量下，對 PCA 誘發大鼠學習獲 得障礙，有明顯改善作用。而正對照組 tacrine，於此 1 mg/kg 始有改善 作用。 此外，在近期研究大鼠的神經退化現象中發現，當 glutamate 功能低 下受到抑制時，會產生一種興奮性毒素(excitotoxicity)；興奮性毒素的 釋放，主要是通過 glutamatergic 和 cholinergic 的興奮路徑，阻斷 NMDA 接受器產生，而導致網狀組織混亂，促發神經的損傷、退化、變質，以致 (84). 細胞慢慢的死亡. 。另 Flood 等之研究，認為 NMDA 接受器或非 NMDA 接受. 器拮抗劑，均可造成學習獲得障礙，但對記憶再現則不受影響. (64). 。亦有報. 告指出 NMDA 消耗所造成的障礙是藉由 muscarnic 接受器的阻斷而產生，當 注射給與 SCOP 和 NMDA 接受器拮抗劑會造成工作記憶的障礙，但對參考記 憶則不受影響. (92). 。本研究於訓練前投與非競爭性 NMDA 接受器拮抗劑. MK-801，可縮短大鼠在明室之滯留時間，造成學習獲得障礙，證實學習獲 得過程需要 excitatory amino acid 神經系統之參與。葛根素在 25、50 mg/kg 劑量下，對 MK-801 誘發大鼠學習獲得障礙，有明顯改善作用其作用。 而正對照組 tacrine 於 1 mg/kg 始有改善作用。 再者記憶鞏固過程，蛋白質合成為必需因素。因此，蛋白質合成抑制劑 如 cycloheximide、anisomycin、puromycin 等，均能造成記憶鞏固損害。 Cycloheximide 主要阻斷 mRNA 之轉錄，抑制約 80%之蛋白質合成，而造成 記憶鞏固障礙，並縮短大鼠在明室滯留之時間. 55. (69). 。本研究於訓練後投與.
(57) cycloheximide，亦可造成記憶鞏固障礙，證實記憶鞏固過程需蛋白質、DNA 之參與。葛根素在 10、25、50 mg/kg 三種劑量下，對 cycloheximide 誘發 大鼠記憶鞏固障礙有明顯之改善作用。 由以上之結果顯示，葛根素在被動學習反應對 MECA、PCA、MK-801、CXM 等所誘發之學習記憶障礙現象的改善作用，可能直接作用於中樞 cholinergic system 的尼古丁接受器或間接經由抑制 serotonin system 的 5-HT2 接受器以增加 cholinergic system Ach 的釋出；亦可能經由 NMDA 接受器調節 EAA 的活性。另葛根素對記憶鞏固亦具改善作用，因此我們進 一步探討葛根素對 CXM 誘發被動迴避學習反應之作用機轉。 Nabeshima 等之研究指出，cycloheximide 誘發記憶鞏固障礙之作用可 能係經由 5-HT2 接受器增加 serotonergic system 之活性，並因而降低 (70). cholinergic system 活性所致 。在神經生化之研究曾指出，腦部 septum 區之 serotonergic neurons 支配 hippocampus 區 cholinergic neurons 之作用，當 serotonergic neurons 活化時，hippocampus 區 cholinergic neuron 之 Ach 釋 出 明 顯 減 少. (93). 。而在大鼠學習行為之研究亦指出，. cholinergic 拮 抗 劑 可 阻 斷 serotonergic 拮 抗 劑 之 作 用 及 增 強 (94). serotonergic 致效劑之作用. 。葛根素於訓練前給予，對 CXM 誘發大鼠記. 憶鞏固障礙之改善作用可被低於誘發障礙劑量之毒蕈鹼接受器拮抗劑 SCOP 或尼古丁接受器拮抗劑 MECA 所拮抗，此作用亦可被低於誘發障礙劑量之 serotonin 釋放促進劑 PCA 所拮抗，另此作用亦可被低於誘發障礙劑量之突 觸後 5-HT2 接受器致效劑 DOI 所拮抗。雖然 Nabeshima 等之研究指出，CXM (70). 誘發之記憶鞏固障礙與 5-HT1A 接受器無關. ，但在近期之研究中亦明確指. 出 5-HT1A 接受器在記憶鞏固過程上亦扮演重要之角色。5-HT1A 接受器致效劑 (95). 8-OH-DPAT 可誘發學習記憶障礙. ，葛根素於訓練前給予對 CXM 誘發大鼠. 記憶鞏固障礙之改善作用，無法被低於誘發障礙劑量之突觸後 5-HT1A 接受 器致效劑 8-OH-DPAT 所阻斷。由以上之結果顯示，葛根素改善 CXM 誘發記. 56.
(58) 憶鞏固障礙之作用機轉可能係經由 5-HT2 接受器而降低中樞 serotonergic system 之活性，而間接增加中樞 cholinergic system 之活性所致。另一 方面，CXM 誘發記憶鞏固障礙與神經傳遞物質間有密切關係，主要經增加中 樞 serotonergic system 之活性以間接降低中樞 cholinergic system. (70). ；. (71~72). 並影響中樞 adrenergic system、 GABAergic system 之活性. 。亦有. 報告指出在大腦皮質中，serotonergic 和 noradrenergic 短期或長時間聯 合 調 節 GABA-ergic 的 傳 遞. (96). ；另亦有研究指出，腹腔注射給與. noradrenergic neurotoxin DSP4 引起大鼠 NBM 的障礙所造成的學習記憶 缺乏，是因為同時發生 NE 的消耗，NBM 障礙導致 frontal cortex 的膽鹼 乙 醯 轉 移 脢 活 性 明 顯 降 低 ， 而 DSP4 則 造 成 occipital cortex 和 hippocampus 的 NE 濃度明顯下降，因此提供了在學習記憶過程中樞 (97). noradrenergic 和 cholinergic system 之間有相互作用存在 ；所以更深 入探討其中之關聯性。 葛根素於訓練前給予對 CXM 誘發大鼠記憶鞏固障礙之改善作用，發現其 作用可被低於誘發障礙劑量之非選擇性突觸後β接受器拮抗劑 propranolol 所拮抗，亦可被低於誘發障礙劑量之非選擇性突觸後α 接受器拮抗劑 phenoxybenzamine 所拮抗。另本研究室在葛根素對室溫下正常清醒大鼠體 溫之影響進行探討時發現，葛根素之降溫作用可能藉由降低下視丘 serotonin 之濃度，並作用於 postsynaptic serotonin receptor 致活 5-HT1A 接受器及阻斷 5-HT2 接受器而達到降低體溫之作用。因此為了更確定 葛 根 素 改 善 CXM 誘 發 被 動 迴 避 反 應 與 中 樞 cholinergic system 、 serotonergic system、noradrenergic system 之間的關係；最後探討葛 根素改善學習記憶障礙作用與中樞神經系統及突觸前或突觸後接受器之關 係。 6-OHDA 為中樞 catecholaminergic system 之神經毒素，可造成突觸 前神經節之截斷退化且可造成動物學習記憶操作能力之障礙. 57. (98、99). 。腦部給.
(59) 予 6-OHDA(4 µg/2 µl/side)破壞兩側 locus coeruleus 區 noradrenaline 神經元，不影響大鼠在明室之滯留時間，亦未造成大鼠學習記憶之障礙。 葛根素 5、10 µg/20 µl 經腦室給藥後對 CXM 誘發大鼠學習鞏固障礙之改善 作用，可被 locus coeruleus 區給予 6-OHDA(4 µg/2 µl/side)所阻斷。 5,7-DHT 為中樞 serotonergic system 之神經類毒素，可造成突觸前神經 節之截斷退化且可造成動物學習記憶操作能力之障礙. (100、101). 。腦部 dorsal. raphe 區給予 5,7-DHT (10 µg/5 µl)破壞兩側 dorsal raphe 區 serotonin 神經元，不縮短測定期大鼠在明室之滯留時間，亦未造成大鼠學習記憶之 障礙。葛根素 5、10 µg/20 µl 經腦室給藥後對 CXM 誘發大鼠學習鞏固障礙 之改善作用，並不被 dorsal raphe 區投予 5,7-DHT (10 µg/5 µl)所阻斷。 其次，側腦室給予乙醯膽鹼類神經毒素 AF64A，可造成腦內乙醯膽鹼神經元 萎縮及大鼠學習行為操作障礙，但若植入富含乙醯膽鹼之神經元，便可使 (45). 神經記憶能力減退之現象得到回復. 。本研究於訓練前 7 天，側腦室投與. 乙醯膽鹼類神經毒素 AF64A，可縮短測定期大鼠在明室之滯留時間造成大鼠 學習記憶之障礙，證實學習獲得過程需中樞乙醯膽鹼神經系統之參與。葛 根素 2.5、5、10 µg/kg 經腦室給藥後，對側腦室給予 AF64A(3 nmol/side) 誘發大鼠學習記憶障礙亦具改善作用。 在生化和電生理的研究指出，cholinergic 和 noradrenergic 之間有 相互作用的存在。NE 會調節 hippocampal 和 cortical 神經包含 Ach 在內， 亦會降低大腦皮質內 cholinergic 終端的 Ach 釋放；而這個作用可能直接 作用於 cholinergic 終端的α接受器或間接經由 NE 作用調節 GABA 的釋放。 另外，作用在 medial septam nuclei 的水平在 hippocampus 呈現 Ach 的 轉換增加。亦有報告指出，經由 medial septam 的障礙會降低 cholinergic 傳輸到 hippocampus，給與β接受器拮抗劑 propranolol 可阻斷 radial maze (13). performace，若單獨給與 propranolol 則無此作用 。所以葛根素改善 CXM 誘發大鼠記憶鞏固之改善作用，可被非選擇性突觸後 α和β接受器拮抗劑 58.
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