第三章 試驗之部
第三節 生薑和 nifedipine 抗血小板凝集協同反應探討-以
二. 試驗方法
1. 二樣本給藥流程如 (圖 21)
高血壓樣本為單純性高血壓患者，具缺氧或胃潰瘍或服用ASA、
NSAID 患者均排除、檢驗前樣本禁止飲酒，檢驗前樣本禁止飲酒，
服用阿斯匹林或各項引響血小板的藥品如柑橘、葡萄、酒茶等兩週，
且樣本無喝酒抽煙習慣及服用NSAID、ASA 兩週以上，且兩組身
2. 血小板功能測試（Platelet function tests）
實驗前準備事項：抽血後需在 3 小時內完全檢測完畢。血小板凝 集測定儀、比濁管皆於測定前於37 ℃至少溫機 20min。凝集誘導劑
（ADP、Epi、collagen）實驗中均維持於 2-6 oC，且於實驗前才使用 0.9%生理食鹽水稀釋調製，並於有效期限內使用完畢。
3. 操作步驟：
用真空採血器採血，血液放入採血管內，內含 sodium citrate solution （0.129 M，3.8 %），與血之比為 1：9。輕輕搖晃均勻，將 血液在室溫下，以離心肌1,000 轉，離心 10 min，吸出上層 platelet rich plasma（PRP）。剩下的血漿再以 3,000 轉分，離心 10min，管中上 清液即platelet poor plasma（ppp）。血液檢品先置於有蓋的棕色尖嘴 微量管內，使用自動血球分類計數器，測量PRP 中血小板數，以 PPP 調 PRP 使血小板數在 25 x 104血小板數/μl 範圍。
血小板聚集測定儀先溫機20 min，使溫度到達 37oC。接著取 0.45 mL 的PRP 置於比濁管內。測定時先以 0.45 mL PPP 樣本將記錄儀上的 透光度調節到100%，然後將 0.45 mL PRP 樣本放入測定孔，調節透 光度為0%，加攪拌石，在 37oC 溫育 3-5 min。隨後在 PRP 中加入 0.05 mL 聚集誘導劑：ADP（2 mM）、Epinephrine（0.4 mmol/L）、
collagen（10μg/mL），並於 3 小時內完成測定。觀察比較 PRP 管於 對照管與給藥管在檢測10 min 內用 Born’s(104, 105)方法撿驗其抑制百 分比最大聚集程度，計算藥物血小板聚集抑制百分率。
ratio of anti-platelet aggregation（%）：公式如下：
% Inhibition of aggregation =
Platelet aggregation of induced drugs - Platelet aggregation of test drugs Platelet aggregation of induced drugs ×100
誘導藥品: collagen, ADP or epinephrine
測試藥品: nifedipine, aspirin, ginger, combination of ginger and nifedipine or combination of aspirin and nifedipine.
4. 統計分析
利用Student’s t-test of pair comparison.統計分析數據表示以 means ± SEM. 凡 p 值小於 0.05 則具有顯著差異.。
Fig. 21. Schematic diagram of the procedure of regiments of oral medications in the volunteers (Phase I) and the hypertensive patients (Phase II). 1: 75 mg aspirin (ASA), 2: 1 gm ginger, 3: 10 mg nifedipine, 4: 1+2, 5: 2+3, WP: washout period .
7 days 7 days 7 days 10 days 7 days 10 days 7 days 10 days
WP 2 WP 3 WP 4 WP
7 days
1 5
第四節 薑辣醇[6]-gingerol 鎮痛及抗發炎之研究
一. 實驗材料
1. 藥品及材料
﹝6﹞- gingerol 採購自日本 Wako company，該公司出具高效液相 層析儀純度99 %以上，Acetic acid、formalin 購自德國 Darmstadt 公司，
λ-carrageenin、aspirin、indomethacin 購自美國 Sigma 公司。
2. 動物
1. 薑辣醇[6]-gingerol 對小鼠醋酸扭體反應試驗(109)（writhing response）
採用 18-22 公克 ICR 雄性小鼠，隨機分組，每組 8 隻，稱重後 腹腔投與生理食鹽水及 indomethacin 作對照，依組別使用不同劑量 的[6]- gingerol （12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg）及正對照品
Indomethacin（10mg/kg），分別在30、20 分鐘後以 0.1 ml/10g 之劑量，
腹腔注射給予1 % acetic acid 溶液誘發扭體反應，5 分鐘後開始觀察 記錄因醋酸引起肌肉收縮並伴隨扭體反應（writhing response）次數 10 分鐘，並統計結果（Koster et al）(107)
2 薑辣醇[6]-gingerol 對小鼠福馬林舔蹠試驗(108)（formalin test）
採用 18-22 公克 ICR 雄性小鼠，隨機分組，每組 8 隻，稱重後腹 腔投與生理食鹽水及 indomethacin（20 mg/kg）作對照，實驗組則腹 腔投與不同劑量的[6]-gingerol（25 mg/kg、50 mg/kg），使用藥品及劑 量先行使用Tween 80 及 0.9 %saline 做成懸浮液劑，控制組使用不含藥 品懸浮液劑0.18-0.2 ml，30 分鐘後於小鼠右後足背皮下注射 20μl，1%
formalin，觀察其舔右後足所花時間，每五分鐘記錄一次結果，其中 0-5 分鐘稱前期（early phase），15-40 分鐘稱後期（late phase），觀察記 錄40 分鐘，並統計之（Dubuissin and Dennis 1997）﹙109﹚
3. 薑辣醇[6]-gingerol 對大鼠足蹠浮腫試驗（110）
選用 180-250 公克雄性 Wistar 系雄性大鼠，隨機分組，每組 8 隻，
於右後足跟作記號，並測量給藥前之體積，而後腹腔注射給予
6-gingerol（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）對照組則以 indomethacin
（10 mg/kg, 0.1 ml/100g）給與，藥品使用前以 Tween 80 及 0.9 %saline 做成懸浮液劑，腹腔注射給藥半小時後足蹠後皮下注射致炎劑50μl，
1% λ-carrageenin，誘發足蹠浮腫後，連續以 plethysmometer（MK 101）
測其排水量，每30 分測一次，連續五小時，比較生理食鹽水組及給藥
4. 實驗結果之統計分析
本研究結果之數據以 mean ± S.E.M. ，統計方法以 one-way analysis of variance (ANOVA)分析其變異數，再以 Scheffe multiple range test 檢定其間差異之顯著性，凡 P < 0.05 時，則認為其差異具 有統計意義。
第四章 試驗結果
標準曲線在濃度124.2、103.5、82.8、62.1、41.4、20.7 μg/ml 下， 20.7、
62.1、 103.5 μg/ml 三種濃度，連續分析 6 次，變異系數分別為 2.49 % 、 2.12%、1.9%，標準誤差分別為 1.5%、0.9%、0.6%，精確度良好如（圖 22）， 線性迴歸分析濃度與圖譜面積得到良好的線行關係，相關系係數數為
酸、鹼溶液下動力學變化是依照零次模式如（圖 23），酸性及鹼性溶液中 所得到的斜率分別是-82.8 μg/ml/hr、-311.6μg/ml/hr，而相關係數分別是 0.996、0.997，由此可看出[6]-gingerol 在酸性溶液中較鹼性溶液中安定。
薑汁及所含[6]-gingerol 在 pH = 2.64 - 8.7 下高效液相層析儀進行動力 學分析如（圖25）、（圖26）。薑汁在不同酸鹼度下，4 天後物理表現如（表 9），薑汁在 pH=4-5 時展現較佳的物理及化學安定性，薑汁在第四天酸鹼 度亦大多呈現在pH 4-5 之間如（表 8）。
五. 薑汁外觀變化
由（表 7）觀查薑汁在 pH 2.64-8.70 後的化變化，pH 2.64-4.36 時，液 體分為兩層，酸度越大沉澱越多，顏色微黃至粉紅，氣味可，pH 5.46-8.7 時液體呈懸浮狀，鹼度越大沉澱越少，顏色微黃至暗黃，氣味難聞。
六. 薑不同部位[6]-薑辣醇濃度差異
薑不同部位之萃取液經由高效液相層析儀進行分析圖形如（圖27），
共產生8 個積分波峰，波峰 1 是[6]-gingerol 濃度表現，其餘 7 個尚待進一 部分析，由（圖27.）中可看出薑皮[6]-gingerol 濃度高於薑芽，但薑皮驗不 出波峰5、8，而薑芽驗不出波峰 7、8，[6]-gingerol 濃度在薑的根莖及皮中 含量約為薑芽的1.67 倍、薑葉的 39 倍，1 公克薑皮含 0.823 mg [6]-gingerol 濃度，1 公克生薑根莖含有 0.806 mg [6]-gingerol。
Table 7. The physical properties of ginger aqueous solutions in various pH media
Suspension Suspension Suspension Suspension
Clarity ++++ +++ ++ +
Height of ppt. +++ ++++ ++ ++ + + +
Odor +++ + + Unpleasent Unpleasent Color Light yellow
to pink
Light yellow to pink
Light yellow
Light yellow Light yellow to yellow
Light yellow to yellow
Light yellow to deep yellow Number of “+” represent the strength of that item.
Table 8. The pH measurements of ginger solution at different time
pH at t=0 hr 2.64 3.56 4.36 5.46 6.76 7.58 8.7 pH after 22.17 hrs 2.75 3.78 4.58 5.13 5.29 5.25 5.35 pH after 93.83 hrs 2.70 4.49 4.76 5.09 6.45 5.39 4.77
Fig. 22. The calibration graph of Gin determined by HPLC assay
Fig. 23 Apparent zero-order plots for the degradation of 103.5 μg/mL Gin at acid /alkaline medium and determined by HPLC assay.
Fig. 24 The chromatogram of ginger solution in pH 4.0 acetate buffer at 36℃ and the kinetic profile of peak No. 1-5.
Fig. 25 The kinetic profiles of 6-gingerol in pH = 2~5 ginger solutions at 25℃.
Fig.26 The kinetic profiles of 6-gingerol in pH = 6~8 ginger solutions at 25℃.
Fig. 27 The chromatograms and the finger-prints of different parts of ginger.
第二節 [6]-薑辣醇抗血小板凝集研究
一. [6]-薑辣醇對小鼠流血時間之影響
小鼠腹腔注射不同劑量 (12.5, 25, 50 mg/kg) Gin 溶液，對照組樣本 10 隻公小鼠給予ASA(30 mg/kg)，控制組樣本給予同量的生理食鹽水，注射 Gin(25-50 mg/kg）、ASA (30 mg/kg)溶液及控制組的小鼠流血時間（秒）分 別為6.4 ± 0.9, 7.9 ± 0.5, 6.6 ± 0.8, 4.25 ± 0.8，與控制組分析比較結果 Gin 明
Fig. 28 Maximal intensity and velocity of collagen (10 μg/ml) induced platelet aggregation after（12.5 mg/kg, ip）treatment [6]-gingerol in rats.
Fig. 29 Maximal intensity and velocity of ADP (2 mM) induced platelet aggregation after（25 mg/kg, ip）treatment [6]-gingerol in rats
Fig. 30 Maximal intensity and velocity of AA (200 μM) induced platelet aggregation after（50 mg/kg, ip）treatment [6]-gingerol in rats.
]
Fig. 31 Maximal intensity and velocity of ADP ( 2 mM) induced platelet aggregation after i.p. application normal saline in rats.
Fig. 32 Effect of [6]-gingerol on bleeding time in mice, Data represented as mean
± S.E.M. (n = 10). ***P <0.001 as compared with the control group.
Table 9. Effect of [6]-gingerol on ex vivo platelet aggregation in rats.
Max light transmission rate % Group Dose
(mg/kg) ADP Collagen AA
Control — 65.4 ± 1.91 63.2 ± 1.70 56.2 ±1..56 ASA 30 26.4 ± 1.18*** 22.0 ± 1.31*** 20.4 ± 1.19***
[6]-gingerol 12.5 47.4 ± 1.28*** 39.8 ± 1.19*** 33.8 ± 1.09***
25 22.9 ± 0.94*** 21.4 ± 0.86*** 19.4 ± 0.64***
50 15.1 ± 0.86*** 12.0 ± 1.26*** 16.3 ± 1.02***
Data are expressed as Mean ± SEM (n=10). *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, as compare with nifedipine group.
Fig. 33 Effect of [6]-gingerol on ADP-induced platelet aggregation t ime course in rabbits.Data represented as mean ± S.E.M.
(n=10), ***P < 0.001 as compared with the control group.
0
第三節 生薑和 nifedipine 對抗血小板凝集協同反應探討-以正 常志願者與高血壓患者研究分析
一. 血小板功能測試（Platelet function tests）：
1. 正常樣本與高血壓樣本未服藥前用抗血小板抑制劑濁度反應：如
（Table ），正常樣本血小板在 collagen, ADP, epinephrine 引導凝集後 濁度反應各為44.1%, 44.5%, 42.1%，高血壓樣本結果分別為 64.2%, 67.7%, 62.9%，數據顯示高血壓患者血小板凝集反應明顯高於正常樣 本（表10）、（圖 34）、（圖 35）。
2. 正常樣本併用 ginger 及 nifedipine 如（表 11）正常樣本服用 nifedipine 10 mg後在collagen, ADP, epinephrine 引導的濁度抑制反應分別為20.2
± 0.7,%, 22.6 ± 0.6%, 23.4 ± 1.0%，服用aspirin 抑制百分比分別為37.2 ± 0.7%, 39.7 ± 0.8%, 34.9 ± 0.5% 。正常樣本併用aspirin , 及nifedipine 在 collagen, ADP, epinephrine 引導的濁度抑制反應分別為 82.8 ± 8.5%, 78.2 ± 9.15%, 72.2 ± 8.5%，正常樣本服用生薑抑制百分比分別為 35.3 ± 壓樣本服用nifedipine 在 collagen, ADP, epinephrine 引導的濁度抑制 反應分別為20.5 ± 0.7%, 22.3 ± 0.7%, 19.2 ± 1.0%，併用 aspirin 及 nifedipine 在 collagen, ADP, epinephrine 引導的濁度抑制反應分別為 65.2 ± 0.7%, 64.6 ± 1.1%, 62.8 ± 1.1%，併用生薑及 nifedipine 在 collagen, ADP, epinephrine 引導的濁度抑制反應結果分別為 64.2 ± 0.5%, 63.8 ± 0.4%, 61.1 ± 0.8% 。高血壓患者血小板凝集反應數值高於
正常樣本，所以高血壓患者所的血小板較具活性，凝集能力較強如（圖 36）、（圖 37）。
Table 10. Mean (±SEM) percentage of platelet aggregation with collagen, ADP and epinephrine in normal volunteers and hypertensive patients.
Percentage of aggregation (%)
Normal volunteers Hypertensive patients
Collagen 44.1±0.2 64.2±0.5***
ADP 44.5±0.4 67.7±0.4***
Epinephrine 42.1±0.3 62.9±0.7***
Data are expressed as Mean±SEM (n=10),*** P < 0.001 as compared with the Normal volunteer group
Table 11. Synergistic effect of ginger and nifedipine on platelet aggregation in normal volunteers.
Percentage of inhibition of platelet aggregation Nifedipine Aspirin Nifedipine +
Aspirin
Ginger Nifedipine + Ginger
Collagen 20.2±0.7 37.2±0.7 82.8±8.5*** 35.2±0.8 79.8±0.6***
ADP 22.6±0.6 39.7±0.8 78.2±9.15*** 37.8±0.8 75.2±0.8***
Epinephrine 23.4±1.0 34.9±0.5 72.2±8.5** 35.9±0.7 69.3±0.5**
Data are expressed as Mean±SEM (n=10). *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, as compare with nifedipine group.
Table 12. Synergistic effect of ginger, aspirin and nifedipine on platelet aggregation in hypertensive patients.
Percentage of inhibition of platelet aggregation
Nifedipine Nifedipine + Aspirin Nifedipine + Ginger
Collagen 20.5±0.7 65.2±0.7*** 64.2±0.5***
ADP 22.3±0.7 64.6±1.1*** 63.8±0.4***
Epinephrine 19.2±1.0 62.8±1.1*** 61.1±0.8***
Data are expressed as Mean±SEM (n=10). *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, as compare with nifedipine group.
Fig. 34 Maximal intensity and velocity of ADP （2 mM）induced platelet aggregation in normal volunteers
Fig. 35 Maximal intensity and velocity of ADP（2 mM）induced platelet aggregation in hypertensive patients.
Fig. 36 Maximal intensity and velocity of epinephrine （0.4 mM）induced platelet aggregation after oral administration of nifedipine 10mg and ginger 1 gm.
in patient.
Fig. 37 Maximal intensity and velocity of epinephrine （0.4 mM） induced platelet aggregation after oral administration of nifedipine 10mg and aspirin 75 mg. in patient.
第四節 [6]-薑辣醇鎮痛及抗發炎之研究
一. [6]-薑辣醇對小鼠醋酸扭體反應之影響（writhing response）（111）
累計老鼠腹部伸縮次數.，控制組在 10 分鐘的實驗中計 38.2 ± 3.6
（n = 8）次，腹腔注射〔6〕-gingerol（25 mg/kg、50 mg/kg），後分別為 22.2 ± 4.1, 18.1 ± 3.0 有明顯的抑至疼痛效果，〔6〕-gingerol（25mg/kg）
和正對照品indomethacin（10mg/kg）為 23.0 ± 3.5，〔6〕-gingerol 得到劑 量依賴性的抑制反應，〔6〕-gingerol（25 mg/kg ）較接近 indomethacin（10 mg/kg）結果如（圖 38）。
二. [6]-薑辣醇對小鼠福馬林舔蹠之影響（formalin test）（111）
Gin（25mg/kg、50mg/kg）在疼痛後期亦顯現劑量依賴性的疼痛抑制作 用，正對照在組腹腔注射indomethacin（10mg/kg）後和控制組統計分析 結果舔蹠時間（秒）分別為76.1 ± 7.1, 68.2 ± 4.1, 51 ± 7.9, 118.3 ± 12.2，Gin
（25mg/kg、50mg/kg）皆產生明顯的止痛作用（p < 0.001）如（圖 39）。
三. [6]-薑辣醇對大鼠足蹠浮腫之影響（Hindpaw edema test）（111） 在足蹠後皮下注射致炎劑50μl，1% λ-carrageenin，5 小時利用
plethysmometer 測其排水量監測期間在第3 小時產生最大浮腫狀況，以〔6〕
-gingerol（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）和 indomethacin（10 mg/kg, 0.1 ml/100g）與控制組在實驗過程中均展現名顯的抗發炎反應（p < 0.001）。
〔6〕-gingerol（50 mg/kg、100 mg/kg）較 indomethacin（10 mg/kg）得到 更有效的結果（p < 0.01）如（圖 40）。
Fig. 38 The effects of i.p. [6]-gingerol administration on 1% acetic Acid- induced writhing response in mice. Data represented as mean ± SEM (n=8).
***P< 0.001 as compared with the control group.（113）
Control Indo 12.5 25 50 (mg/kg)
Writhing response
0 10 20 30 40
*** *** ***
Gingerol
Fig. 39 The effects of i.p. [6]-gingerol administration on 20μl of 1% formalin the early phase and late phase in mice. Data represented as mean ± SEM (n=8). ***P< 0.001 as compared with the Formalin group. （113）
Formalin Indo 25 50 (mg/kg)
Licking times (sec.)
0 20 40 60 80 100 120 140
Early phase Late phase
Gingerol
*** *** ***
Fig. 40 The effects of [6]-gingerol (Gin) and indomethacin (Indo) on
λ-carrageenin induced (CARR).rat’s hind paw edema. Data represented as mean ± SEM (n=8). **P <0.01, ***P< 0.001 as compared with the CARR group.（113）
Times (hr)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Changes of edema volume (mL)
0.0
第五章 討 論
利用高效液相層析儀分析生薑、乾薑、薑碳、煨薑，薑辣醇炮製後薑 辣醇含量，不同酸鹼、溫度下薑不同部位薑皮、薑肉、薑芽、薑葉薑辣醇 的安定性，Balladin（6）和Denniff (112)舉出薑所含不穩定酚類化合物如gingerols 在酸性及高溫下均可去水轉化成shogaols，而 gingerol 及 shagoal 亦可經由 retro-aldol cleavages 反應生成 zingerone 及醛，而 zingerone 及醛在酸性下亦 可合成gingerols，所以 gingerols、shogaols、gingediols、gingerdione、Zingerone
利用高效液相層析儀分析生薑、乾薑、薑碳、煨薑，薑辣醇炮製後薑 辣醇含量，不同酸鹼、溫度下薑不同部位薑皮、薑肉、薑芽、薑葉薑辣醇 的安定性，Balladin（6）和Denniff (112)舉出薑所含不穩定酚類化合物如gingerols 在酸性及高溫下均可去水轉化成shogaols，而 gingerol 及 shagoal 亦可經由 retro-aldol cleavages 反應生成 zingerone 及醛，而 zingerone 及醛在酸性下亦 可合成gingerols，所以 gingerols、shogaols、gingediols、gingerdione、Zingerone