前言
病毒性肝炎、酗酒、自體免疫肝臟疾病，及膽汁淤積等原因，都 會造成肝臟損傷發炎，促使肝纖維化發生，以修復受傷的肝細胞。當 損傷移除，肝臟能夠復原；但若損傷持續，肝臟發炎的情形會持續，
肝纖維化就會惡化成不可復原的肝硬化，甚至轉變成肝癌。為了避免 肝硬化的形成，抑制肝臟發炎發展是必要的。
本實驗室過去的研究顯示台灣金線連水萃物能減輕四氯化碳誘 發的大鼠肝損傷 (Du et al., 2003)。由四氯化碳誘發的小鼠肝損傷及肝 細胞的實驗追蹤出有效成分為金線連糖苷 (Kinsenoside) (Wu et al., 2007)。金線連糖苷為台灣金線連的主要成分 (Du et al., 2001)，解明 金線連糖苷的保肝作用機轉有助於瞭解台灣金線連的保肝作用。
材料與方法
ㄧ、 金線連糖苷的製備
本實驗所使用的金線連糖苷是本校藥物化學研究所吳金濱副教 授所提供 (Wu et al., 2007)，純度為 80 %。
二 、 藥品試劑
編號 名稱 廠牌
1 Carbon Tetrachloride Osaka
2 Olive oil Wako 3 ALT ( GPT 分析套組 ) Roche, 4 AST ( GOT 分析套組 ) Roche 5 TBIL ( total bililubin 分析套組 ) Roche
6 HCl Sigma-Aldrich
7 NaOH Sigma-Aldrich
8 CuSO4 Sigma-Aldrich
9 H2O2 Roche
10 p-dimethylaminobenzaldehyde Sigma-Aldrich
11 H2SO4 Fluka
12 Enzyme-link immunosorbent assay kit ( TNF-α )
BioScience
13 Enzyme-link immunosorbent assay kit ( INF-γ )
BioScience
14 Enzyme-link immunosorbent assay kit ( IL-6 )
BioScience
15 Enzyme-link immunosorbent assay kit ( IL-10 )
BioScience
16 KCl Wako
17 PCNA ( proliferating cell nuclear antigen ) antibody
20 Alcohol Panreac 21 diamiobenzidine ( DAB ) Sigma-Aldrich
23 trizol Invitrogen
24 chloroform Showa
25 isopropanol Scharlau Chemie S.A.
37 Ethidium Bromide ( EtBr ) Fermentas
三、 設備器材
3 PCR system 9700 A&B (Applied Biosystems) 4 KUBOTA 3500 離心機 KUBOTA 5 Microplate Reader Model 550 Bio-RAD
6 Electronic Balance AB104 Mettler toledo 7 AlphaDigDoc Alpha Innotech
Coporation 8 Spectrophotometer Hitachi
四、動物
實驗動物選用 25 ~ 30 g (5 週大) 的 ICR 小鼠，購自樂斯科生物 科技公司。餵養環境維持 22 ± 3℃，相對溼度 55 ± 5 %，光照為 12 小時明亮 12 小時黑暗的環境，採自由飲水及攝食。
小鼠分為四組，控制組 (n = 6)，及四氯化碳組。四氯化碳組每週 管餵兩次 10 % 四氯化碳 (溶於橄欖油)，為期 3 週。四氯化碳組又 分成 3 組，每組 9 隻，由投與四氯化碳開始，每天分別經口投與去 離子水或金線連糖苷 (100、300 mg/kg body weight)，為期 3 週。投 與體積為每 10 克體重給予 0.1 ml。
五、肝功能試驗
投藥期滿後，小鼠在乙醚麻醉下，以 1 ml 針筒由下腔靜脈採血。
全血收集在微量離心管中，在室溫下以冷凍離心機每分鐘 4700 rpm
離心 10 分鐘以分離出血漿。再以自動分析儀檢測天門冬胺酸轉氨酵 素 (AST)、麩氨酸轉氨酵素 (ALT) 及總膽紅素 (Total bilirubin；
TBIL)。
六、Hydroxyproline 的測定
肝臟 Hydroxyproline 含量測定的方法乃參考 Neuman and Logan (1950) 之方法。將肝臟組織秤取約 0.3 克左右，於 100℃ 烘箱中隔 夜乾燥。將乾燥的肝臟組織秤重後放入試管中，加入 3 ml 的 6N HCl，在 100℃ 的烘箱中放置 16 小時以上，使其水解。肝臟組織 充分水解後，便可放置室溫冷卻，取 1 ml 的水解液至微量離心管，
以 10,000 rpm 離心 30 分鐘。取 1 ml 的上清液加入適量的 1N NaOH 中和，之後分別加入 1 ml 的 CuSO4 (0.01M)、NaOH (2.5N)、
H2O2 (6 %) 震盪後靜置反應五分鐘，之後再將試管放入 80℃ 的水浴 鍋中，將過多的過氧化物去除。待冷卻後，再加入 2 ml 之 5 % p-dimethylaminobenzaldehyde 及 4 ml 的 3N H2SO4，之後再放入 70℃ 的水浴鍋中反應 16 分鐘使其呈色，以分光光度計於 540 nm 測量其吸光值，其單位表示為 μg/g tissue。
七、細胞激素 TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10 之分析
immunosorbent assay；ELISA) 來偵測。將肝臟組織秤取約 0.3 克左 右，加入 3 ml 1.15 % 的 KCl，以均質機將肝臟打碎後，取 1ml 於 微 量離心管，以 3000 rpm, 4℃, 5 min 離心，之後取上清液及細胞激素 標準液加入事先 coating 好且已 blocking 的 96 well plate 中，室溫 放置 2 小時，之後以 Phosphate Buffered Saline Tween 20 (PBS-T) 清 洗 3 ~ 5 次，再加入 detection antibody，室溫放置 1 小時，然後以 PBS-T 清洗 3 ~ 5 次，加入 Horse Radish peroxidase，室溫放置 30 分鐘，再以 PBS-T 清洗 3 ~ 5 次，加入 subatrate，室溫放置 15 分 鐘，此時呈現藍色，最後加入 2N H2SO4，此時呈現黃色，以波長 450 nm 測其吸光值。
八、肝臟病理切片評估
取肝臟最大葉 1/3 以 10 % 福馬林固定，進行石蠟包埋及切片，
再以蘇木青和伊紅染色法染色後，觀察肝臟之變性程度。
肝臟切片經 proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 和 nuclear factor-κB p65 (NFκB p65) 以及 CD14 之免疫組織化學染色，可將肝 細胞染成褐色，以此估算細胞之數目。其方法為將肝臟組織以 10 % 中性福馬林固定後，經過修整後置入石蠟包埋，切成 5 μm 切片經 xylene 脫蠟及依序以不同濃度之酒精脫水處理，以 10 mM sodium
citrate buffer (pH 6.0) 煮沸處理 20 ~ 40 分鐘後靜置於室溫下 20 分 鐘，之後將切片以 5 % 的 milk block 30 min，而後加入一級抗體 (1：500) 室塭培養 2 小時，以 PBS-T 清洗後，加入 3 % H2O2 去除 內源性過氧化酶，反應 10 分鐘後，以 PBS-T 清洗，之後加入二級 抗體室塭培養 30 分鐘，再利用免疫偵測套組以及 diamiobenzidine 呈色，最後以蘇木紫染色，脫水完成後封片。
九、mRNA 表現分析 1. RNA 萃取
取大約 0.1 g Tissue 於研缽中，磨碎後加到 1ml trizol 中，過 18G → 23G 針頭數次，將 組織均質化，6400 rpm、10 min、4℃ 條 件下離心，取離心後上清液，加入 0.2 ml chloroform votex 15 sec，
於冰上靜置 3 分鐘，再以 12,700 rpm、15 min、4℃ 離心後，輕輕 將上清液吸出 300 μl，加入 0.5 ml isopropanol，上下搖晃後，冰上 靜置 10 min，於 12,700 rpm、10 min、4℃ 離心後，肉眼可見底部 白色沉澱物，留 pellet，加 1 ml 75 % 酒精上下搖動，於 - 30℃ 放
置30 min，再以 10,000 rpm、5 min、4℃ 離心，倒掉酒精留 pellet，
加入 Diethyl pyrocarbonate 水 60 μl 充分溶解，用波長 260 nm 測 定吸光，換算 RNA 濃度。置於 - 80℃ 下儲存備用。
2. 反轉錄－聚合酶連鎖反應 ( Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR )
cDNA 的製備主要以 Moloney murine leukemia virus Reverse Transcriptase (MMLV RT) 進行 cDNA 合成，取 1 μg mRNA 加入 2.5 μl 10 × MMLV RT buffer, 0.6 μl MMLV RT, 5 μl dNTP, 2.5 μl 0.1 M DTT, 1 μl oligo dt primer，混合後置於 37℃，60 分鐘之後立即置 於冰上，保存於 - 20℃。
3. DNA 電泳分析
PCR 的部份是利用 PCR Master Mix kit 進行 specific DNA fragments amplification，反應所得的 PCR 產物以 2 % 洋菜膠於 0.5
× TBE buffer 電泳液，以 100 伏特的電壓進行電泳分離，再用影像 分析軟體 (AlphaDigi Doc 1201) 進行分析。採用的 primer 序列如 Table 1。
十、統計方法
數據結果以平均值 (mean) ± 標準差 (standard deviation, SD) 表 示，各組與對照組間的數據以 One-way ANOVA 方法分析，並進行 Dunnett test，以 p 值小於 0.05 表示在統計學上有顯著異差。
結果
ㄧ、對血清生化值的影響
四氯化碳誘導三週後，小鼠犧牲採血，取血漿測試其 ALT、AST 活性以及 TBIL 濃度。四氯化碳組之 ALT 和 AST 值與控制組比較 顯著上升。金線連糖苷低劑量與高劑量均能降低四氯化碳所提升的 ALT 和 AST 值 (Fig. 1和Fig. 2)。四氯化碳組的血漿 TBIL 值明顯 高於控制組，金線連糖苷組雖有減少 TBIL 的趨勢但無統計上差異 (Fig. 3)。
二、Hydroxyproline 含量的分析
於四氯化碳誘導三週後，比較小鼠肝臟膠原蛋白之含量，結果顯 示四氯化碳組比正常組高，金線連糖苷高劑量組的肝臟膠原蛋白含量 較四氯化碳組顯著降低，低劑量組與四氯化碳組比較有降低之趨勢但 無統計上之差異 (Fig. 4)。
三、細胞激素的含量
四氯化碳誘導三週後，小鼠犧牲，取肝臟均漿測試 TNF-α、
IFN-γ、IL-6 和 IL-10 濃度。四氯化碳組肝臟的 TNF-α、IFN-γ、IL-6 和 IL-10 度明顯較控制組高。金線連糖苷能降低四氯化碳所提升的
NF-α、IFN-γ、IL-6 和 IL-10 度 (Fig. 5 - 8)。
四、病理切片的評估
肝臟的損傷程度及型態觀察以經蘇木青和伊紅染色之肝臟切片 進行判讀，四氯化碳組可見局部至廣泛之肝細胞空泡樣變性，金線連 糖苷高、低劑量組均較四氯化碳組有顯著減輕變性之情形，其中又以 高劑量組較為明顯 (Fig. 9)。
染 PCNA 關察肝臟增生程度。結果顯示，控制組無增生情形，
四氯化碳組明顯的有增生的情形。金線連糖苷的肝臟增生情形較較四 氯化碳組明顯，且以高劑量組差異較大 (Fig. 10)。
以經 p65 和 CD14 之免疫組織化學染色關察肝臟庫氏細胞活化
的情形，結果顯示控制組組無庫氏細胞活化的表現，四氯化碳組明顯 有 p65 和 CD14 的表現，即庫氏細胞被活化。金線連糖苷組 p65 和 CD14 的表現均較四氯化碳組輕 (Fig. 11)。
五、RT-PCR 的結果
以 RT-PCR 輔以電泳影像分析軟體來分析 α-SMA、CD14、iNOS 及 COX-2 mRNA 的表現量。四氯化碳組肝臟 α-SMA、CD14、iNOS 及 COX-2 mRNA 之表現量明顯較控制組高，分別為控制組 189 ％、
300 mg/kg) 分別降低 α-SMA 和 CD14 mRNA 之表現 112 % 和 109 %， 152 % 和 150 % (Fig 12和13)。與四氯化碳組比較，金線連 糖苷 (300 mg/kg) 分別降低 iNOS 和 COX-2 mRNA 之表現 93 % 和 81 %， 136 % 和 118 % (Fig 14和15)。
討論
在本實驗中，以小鼠投與四氯化碳與金線連糖苷，探討金線連糖 苷對 CCl4 所誘導的肝損傷是否有減輕的作用。結果發現金線連糖苷 具劑量依存性減輕了四氯化碳所誘發的肝損傷。
AST、ALT 酵素大量存在於肝細胞中，當肝臟受到損傷 AST、
ALT 會釋出至血液中。血漿中的 AST、ALT 值常用來當作肝損傷的 指標。其中 ALT 較具專一性，因 AST 除了在肝臟中含有外，心臟、
腎臟、骨骼肌、腦部也都含有 (Sturgill & Lambert, 1997)。小鼠投與 四氯化碳三週，其血漿中的 AST、ALT 明顯的高於控制組，顯示四 氯化碳的確造成肝臟的損傷。而投與金線連糖苷的小鼠，血漿中的 AST、ALT 值明顯的比四氯化碳組低，並呈現劑量關係。在總膽紅 素的部份，四氯化碳組比控制組高出許多，金線連糖苷雖無顯著使總 膽紅素下降，但有降低總膽紅素的趨勢，顯示其肝臟功能的受損情形
察(蘇木青和伊紅染色)得到一致的結果。
肝臟發炎會刺激膠原蛋白增生，促使纖維化的產生。膠原蛋白含 有特別的氨基酸 hydroxyproline，肝臟中 hydroxyproline 的含量可反 應膠原蛋白的含量，推知纖維化的程度 (Hanauske-Abel, 1996)。本實 驗中，四氯化碳明顯的增加肝臟 hydroxyproline 含量，金線連糖苷 減低四氯化碳所增加的 hydroxyproline 含量，顯示其具有減輕纖維 化的作用。
當肝臟受到傷害，肝細胞受損，發炎細胞及內皮細胞釋出發炎因 子，庫氏細胞活化。庫氏細胞及肝細胞釋出 TGF-β1，刺激活化星狀 細胞由靜止態轉變為活化態 (Bataller & Brenner, 2005)，活化態的星 狀細胞會聚集，分泌細胞外間質 (Lee et al., 2001)。α-SMA 表現量為 星狀細胞活化程度的主要指標 (Geerts et al., 1991)。本實驗中偵測了 α-SMA mRNA 表現量，發現四氯化碳明顯的促使 α-SMA mRNA 表
現量增加，而金線連糖苷能減低其表現量。由此可知金線連糖苷能抑 制星狀細胞活化，進而減少細胞外間質堆積，而減輕了纖維化的情形。
四氯化碳是一個具有肝毒性的物質，它所造成的肝損傷主要是其 所釋放的自由基刺激活化肝中的非實質細胞，例如：庫氏細胞，進而 引發發炎反應。肝臟發炎會促使細胞激素釋放，包括 TNF-α、IFN-γ、
IL-6、IL-10 等。TNF-α 是調控 NFκB ㄧ重要因子，過去研究發現，
在四氯化碳誘導的發炎反應中，TNF-α 會大量表現，並促進 NFκB
在四氯化碳誘導的發炎反應中，TNF-α 會大量表現，並促進 NFκB