前言
在前章的實驗，顯示金線連糖苷可能經由抑制庫氏細胞的活化 而減輕四氯化碳引起的小鼠肝臟發炎。因此，本章實驗進一步使用具 噬細胞 246.7，來探討金線連糖苷抑制 LPS 誘發巨噬細胞產生發炎 物質 NO 的作用基轉。
材料與方法
一、藥品試劑
編號 名稱 廠牌
1 Dulbecco’s modified Eagle’s medium ( DMEM )
HyClone
2 MTS assay Promega
3 lipopolysaccharides Sigma-Aldrich 4 Griess Reagent Sigma-Aldrich
5 蛋白質萃取試劑 Intron
6 Coomassie Blue dye Sigma-Aldrich
7 SDS Amresco
8 40% Acrylamide Amresco
9 Tris base Sigma-Aldrich 10 APS ( Ammonium persulfate ) Amresco
11 TEMED Amresco
12 Tween 20 Sigma-Aldrich
13 ECL reagent Perkin Elmer 14 Sodium Chloride Amresco
15 NIK Abcam
24 PCNA ( proliferating cell nuclear antigen ) antibody
生化自動析儀 5 Microplate Reader Model 550 Bio-RAD
6 Electronic Balance AB104 Mettler toledo 7 AlphaDigDoc Alpha Innotech
Coporation 8 Spectrophotometer Hitachi
三、細胞培養
將 RAW 264.7 培養在含有 10 % fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin 和 0.25 μg/ml amphotericin 的 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 培養液中，並且放在 5
% CO2, 95 % 飽和溼度以及 37℃ 恆溫培養箱中培養，細胞每 2 ~ 3
的 succinate dehydrogenase 會將 tetrazolium salt 還原成 formazan，
而藍褐色之 formazan 的生成量則與活細胞數目成正比，可利用酵素 免疫自動分析儀 (ELISA reader) 於 490 nm 波長讀取吸光值，各槽 之吸光值與對照槽吸光值之比代表細胞存活率。
2. 實驗步驟
將小鼠巨噬細胞株 Raw 264.7 植入 96 孔細胞培養盤，隔夜培養
後，吸除舊細胞培養液，加入含不同濃度金線連糖苷之新鮮細胞培養 液作用 2 小時後，加入 LPS (Escherichia coli Serotype 0128-B12, Sigma) 刺激 24 小時。吸除舊細胞培養液，每槽加入 100 μl 細胞培 養液及 20 μl MTS 溶液，經 1 小時之培養，以 490 nm 讀取吸光 值。細胞存活率 = (試驗組的吸光值/對照組的吸光值) × 100 %。
五、一氧化氮 (Nitric Oxide, NO) 之分析測定 1. 原理
NO 是一種滲透性的氣體，由精胺酸 (L-arginine) 和 NO 合成
酶作用所產生。NO 的很不穩定，很快的在組織中會氧化成穩定的產 物亞硝酸 (nitrite) 或硝酸 (nitrate)，可利用 Griess Reagent 進行呈色 反應 (Griess, 1879)。
（摘錄自http://www.genelabs.com.tw）
2. 實驗步驟
將細胞接種至 96 well 微量分析盤並調整每 well 細胞數為 1 x 104，加入金線連糖苷溶液，濃度分別序列稀釋為 0、0.1、1、10、
50、100、200 與 400 μg/ml，於 37℃，5 % CO2 培養 2 小時後，
加入 LPS (0.1 μg/ml) 培養 24 h 後。分別取培養上清液以及一氧化 氮標準品 (NaNO2) 與 Griess reagent 試劑等體積反應，反應形成紫 紅色產物於 540 nm 處具有最大吸光值，故以 540 nm 吸光值計算
樣本亞硝酸根濃度。每次實驗皆有三重複以上並與標準曲線比對，
測得樣本濃度計算其產生量。
六、蛋白質表現分析
將細胞接種至 6 cm dish 並調整每 well 細胞數為 1 x 106，置於 培養箱隔夜培養後，以適量的 PBS 沖洗後，加入不同濃度的金線連 糖苷溶液，於 37℃，5 % CO2 培養 2 小時後，加入 LPS (0.1 μg/ml)
培養不同時間。時間終止時，除去培養液，以適量冰涼的 PBS 沖洗 後，將細胞刮下，置於微量離心管中，以 300 g, 10 min, 4℃ 離心。
除去上清液，沉澱物加入 1 ml Hypotonic Buffer (10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5 mM PMSF, 1 mM NaF 和 1 mM Na3VO4)，將其均勻沖散。而後置 於冰上 15 分鐘，期間上下反覆搖動數次。再加入 50 μl 的 10 % NP-40 (最終濃度 0.5 %) 均勻振盪 10 秒。以 3000 g, 10 min, 4℃ 離 心，上清液移至另ㄧ微量離心保存，此部分為細胞質萃取液，而沉澱 物即為細胞核的部份。Pellet 加入 10 ~ 20 μl Extraction buffer (20 mM HEPES pH 7.9, 400 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5 mM PMSF, 1 mM NaF 和 1 mM Na3VO4 )，將沉澱物 均勻沖散。再將懸浮液以高速震盪 15 秒，然後置於冰上 15 分鐘，
此過程反覆進行四次，此即為核內萃取物。依據 Bradford 法來進行 蛋白質的定量，也就是利用 Coomassie Blue dye 與蛋白反應，使其 呈藍色，在波長 595 nm 測吸光。
蛋 白 質 定 量 後 ， 取 40 μg 之 蛋 白 質 進 行 蛋 白 質 電 泳 (SDS-PAGE)，採用 10 % separating gel，於 125 伏特下進行電泳分 析約 1 小時後，將凝膠片蛋白質以濕式轉印法 transfer 至 PVDF 膜，以 50 伏特電壓轉印 1 小時後，將轉印完成的 PVDF 膜浸置於
overnight，以阻斷非特異性結合。然後以 Tris-buffered saline-Tween 20 (TBS-T) 清洗數次，之後與一級抗體於室溫下反應 2 小時 (或置於 4℃ 下反應 overnight)，以 TBS-T 清洗數次，再與相對應的二級抗 體在室溫下反應 1 小時，以 TBS-T 清洗後，最後再用 ECL reagent 反應後，以 X 光片顯影，顯影完成後將 PVDF 膜以 stripping buffer 將膜上的抗體及顯色液洗去，之後重複上述之步驟，加入不同的待測 抗體進行辨識。然後利用電泳影像分析軟體分析後，將所得之數值據 用來評估蛋白表現量。
七、mRNA 表現分析 1. RNA 的萃取與定量
將細胞接種至 6 cm dish 並調整每 well 細胞數為 1 x 106，置於 培養箱隔夜培養後，以適量的 PBS 沖洗後，加入不同濃度的 金線 連糖苷溶液，於 37℃，5 % CO2 培養 2 小時後，加入 LPS (0.1 μg/ml) 培養 4 小時。時間終止時，除去培養液，以適量冰涼的 PBS 沖洗 後，加入 1 ml 的 Trizol reagent，用刮勺把細胞刮下置於滅菌過的微 量離心管，以吸管反覆沖吸，使反應更為完全。之後加入 200 μl 的 chloroform 於微量離心管，使其充分搖晃 15 秒後，置於冰上反應 3 分鐘，之後離心 12700 rpm , 15 min, 4℃，取上清液，並加入 500 μl 的
isopropanol 充分混合後，在冰上靜置 10 分鐘，再離心 12700 rpm, 15 min, 4℃，接著加入 1 ml 75 % 酒精沖洗，洗去多餘的鹽類，再離心 10000 rpm , 5 min, 4℃，除去上清液，加入適量的 DEPC-H2O 之後，
充分混合，用波長260 nm 測定吸光換算 Total RNA 的濃度。置於 - 80℃ 下儲存備用。
2. RT-PCR 分析
實驗方法見第二章。採用的 primer 序列如第二章 Table 1。
八、統計方法
數據結果以平均值 (mean) ± 標準差 (standard deviation, SD) 表 示，各組與對照組間的數據以 One-way ANOVA 方法分析，並進行 Dunnett test，以p值小於0.05表示在統計學上有顯著異差。
結 果
ㄧ、LPS 對 NO 生成的影響與細胞毒性
RAW 264.7 cell 加入不同濃度的 LPS (0.01 - 1 μM)，分別培養 24、48 和 72 小時。如 Fig. 16. 示，LPS 在 1 μM 的濃度下，經 24、
48 和 72 小時的培養，細胞的存活率明顯的下降。LPS (0.01 和 0.1μM)
對 RAW 264.7 細胞的存活率沒明影響。
RAW 264.7 cell 加入不同濃度的 LPS (0.01 - 1 μm)，分別培養 24、48 和 72 小時，隨著培養時間的延長及濃度增加，NO 的產量也 隨著上升 (Fig. 17)。就 LPS 0.1 μM 而言， NO 產量在 24 小時達 高峰，因此以下實驗以此條件進行。
二、金線連糖苷對細胞的毒性
RAW 264.7 細胞加入不同濃度的金線連糖苷 (0.1 - 400 μM) 培 養 24 小時，而後測試細胞的存活率。如 Fig. 18 所示，金線連糖苷 對 RAW 264.7 細胞的存活並沒有影響。
三、金線連糖苷對 LPS 產生 NO 之影響
RAW 264.7 細胞加入不同濃度的金線連糖苷 (0.1 – 400 μM) 培 養，經 2 小時後再加入 LPS (1 μM) 培養，經 24 小時後收取細胞 上清液測定 NO 含量。如 Fig. 19 所示，金線連糖苷具劑量依存性 抑制 LPS 所產生的 NO。金線連糖苷 100 μM 的抑制率超過 50
%，因此之後的實驗選用 10、50、100 μM 的濃度來進行。
四、金線連糖苷對 iNOS 蛋白及 mRNA 的影響
RAW 264.7 細胞加入 LPS (0.1 μM) 培養 24 小時後，iNOS 蛋白
蛋白表現 (Fig. 20)。
RAW 264.7 細胞加入 LPS (0.1 μM) 培養 4 小時後，iNOS mRNA 表現明顯增加，金線連糖苷 (10 - 100 μM) 劑量依存性的抑制 iNOS mRNA 的表現 (Fig. 21)。
五、金線連糖苷對核內 NF-κB 蛋白表現的影響
RAW 264.7 細胞加入 LPS (0.1 μM) 培養 1 小時後，核內 p65 / p50 的表現量明顯的增加，金線連糖苷 (10-100 μM) 的前處理明顯 的抑制 p65 / p50 在核內的表現 ( p < 0.001； p < 0.01 )。因此推論，
Kinsenoside 可以抑制 LPS 活化的 NF-κB 之轉錄活性 ( Fig. 22 )。
六、金線連糖苷對IκBα 蛋白表現的影響
RAW 264.7 細胞加入 LPS 培養 15 分鐘後，磷酸化 IκBα 蛋白 的表現明顯的增加，金線連糖苷 (10-100 μM) 的前處理能抑制 LPS 所誘導磷酸化 IκBα 蛋白的表現。 非磷酸化 IκBα 的表現量在各組 間並無明顯異差，顯示其磷酸化的減少並非因 IκB 的表現減少所致 (Fig. 23)。因此推論，Kinsenoside 可能具有抑制 IκB-α degradation 的 作用，而影響 NF-κB 移入 (translocation) 細胞核的作用。
六、金線連糖苷對LPS 誘發之磷酸化 MAPK 蛋白表現的影響
RAW 264.7 細 胞 加 入 LPS 培 養 15 分 鐘 後 ， 磷 酸 化 extracellular signal-regulated kinase (ERK 1/2) 、 c-Jun N-terminal kinase (JNK)、p38 蛋白的表現顯增加，金線連糖苷 (10-100 μM) 的 前處理能抑制 LPS 誘發的磷酸化 ERK 1/2、JNK、p38 蛋白的表現 (Fig. 24)。
討論
本實驗探討金線連糖苷對 LPS 誘發巨噬細胞 RAW246.7 產生 NO 的能力。結果發現金線連糖苷可以經由 NFκB 的抑制而減少 LPS 刺激產生的 NO。
巨 噬 細 胞 NO 的 產 生 主 要 是 由 iNOS 調 控 (Luoma &
Yla-Herttuala, 1999)，金線連糖苷能抑制 LPS 誘發 iNOS mRNA 及 蛋白的表現。由此可推測金線連糖苷對於 LPS 誘導 iNOS 蛋白質表 現的調控作用可能是基於轉錄層次上的調控，即影響 iNOS mRNA 的表現量後，而影響到 iNOS 蛋白質產物的生成。
NF-κB 的活化，對於 LPS 誘導 iNOS 基因的表現是必須的。一 般情況下，NFκB 存在於細胞質中持續表現，但由於與抑制性的 IκBα 結合，使 NFκB 無法進入細胞核中，失去了調節基因表現的能力
引發 IκBα 分開，促使 NF-κB 移入細胞核中，執行其轉錄因子的功 能 (Gloire et al., 2006)。
NF-κB 是由不同的次單元體組成的同二聚體或是異二聚體。一般 NF-κB 以 p65/p50 異二聚體型式存在最為普遍。p65/p50 異二聚體 具有很強的轉錄能力 (transcriptional activity) (Teng et al., 2006)。巨噬 細胞受到 LPS 活化，細胞質中的 p65/p50 會進入細胞核執行其轉錄 因子的功能 (Gloire et al., 2006)。金線連糖苷可以抑制 p65 和 p50 移入細胞核，由此可推測金線連糖苷能調節 NF-κB 的活化路徑，減 少 NF-κB 移入細胞核。
LPS 誘發 Iκ-B kinase 磷酸化，進而使 IκBα 磷酸化。當 IκBα 被磷酸化後與 polyubquitin 結合，使 IκBα 與 NF-κB 的結合分開，
NF-κB 成為自由態，NF-κB 異二聚體可以進入到細胞核內，活化 NF-κB 所調節的基因表現 (Szabo et al., 2007)。
金線連糖苷能抑制 LPS 誘發磷酸化 IκB-α 蛋白表現，即金線連 糖苷能抑制 NF-κB/ IκB-α 複合體的分開，阻止 NF-κB 異二聚體進 入細胞核內。
MAPK 訊息傳遞路徑可分為三大類，ERK 1/2 路徑、JNK 路徑 及 p38 MAPK 路徑 (Papatsoris & Papavassiliou, 2001)。此三條 MAPK 路徑在 LPS 能活化此三條路徑而影響 NF-κB 對基因的調
控 (Liao et al., 2004)。金線連糖苷能抑制 LPS 誘發之 ERK 1/2 、 JNK 及 p38 蛋白表，顯示金線連糖苷也能經由 MAPK 路徑抑制 NF-κB 的活性。
金線連糖苷抑制 LPS 所誘導的巨噬細胞活化，可以經由抑制 IκB-α 途徑 及 MAPK 磷酸化，進而使得 NFκB 無法移至細胞核 內，或影響 NFκB 對基因的調控而使得 iNOS 的 mRNA 及蛋白表 現減少，NO 無法大量產生。即金線連糖苷這抑制巨噬細胞活化，進 而減弱發炎反應。
0 20 40 60 80 100 120
140 LPS 0 μg/ml
LPS 0.01 μg/ml LPS 0.1 μg/ml LPS 1 μg/ml
cell viability (%)
24 48 72 hr
Fig. 16. Effect of LPS-induced cytotoxicity in mouse RAW 264.7 macrophages.
Values are means ± S.D. for three different experiments performed in triplicate.
24 48 72 hr
0 10 20 30 40 50 60 70
LPS 0 μg/ml LPS 0.01 μg/ml LPS 0.1 μg/ml LPS 1 μg/ml
Nitrite (μM)
Fig. 17 The production of nitric oxide ( NO ) induced by LPS in mouse RAW 264.7 macrophages.
Each value represents the mean ± S.D. for three different experiments performed in triplicate.
0 20 40 60 80 100 120 140
0 0.1 1 10 50 100 200 400 kinsenoside(μΜ)
Survival (%)
Fig. 18 Effect of kinsenoside-induced cytotoxicity in mouse RAW 264.7 macrophages.
Cells were incubated with kinsenoside for 24 h and then cytotoxicity was estimated by MTS assay. Each value represents the mean ± S.D. for three different experiments performed in triplicate.
0 5 10 15 20 25
Nitrite (μΜ)
control 0 0.1 1 10 50 100 200 400 (μM) kinsenoside
LPS (0.1μg/ml) Fig. 19 The inhibitory effect of kinsenoside on LPS-induced
production of NO in mouse RAW 264.7 macrophages.
Each value represents the mean ± S.D. for three different experiments performed in triplicate.
kinsenoside - - 10 50 100 (μM) LPS - + + + + (0.1 μg/ml)
Relative density of iNOS protein (fold)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
iNOS/α-tubulin
##
**
**
Fig. 20. Effects of kinsenoside on LPS-induced iNOS protein expressions in RAW 264.7 cells.
Values are means ± S.D. ##P < 0.01 compared with control group. **P <
Values are means ± S.D. ##P < 0.01 compared with control group. **P <