金線連糖苷對四氯化碳誘導之小鼠肝損傷的保護作用:經由抑制庫氏細胞的活化; Protective effect of kinsenoside on liver injury induced by CCl4 in mice：Possible involvement of the Kupffer cell inactivation

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(1)中國醫藥大學基礎醫學研究所碩士學位論文金線連糖苷對四氯化碳誘導之小鼠肝損傷的保護作用:經由抑制庫氏細胞的活化. Protective effect of kinsenoside on liver injury induced by CCl4 in mice：Possible involvement of the Kupffer cell inactivation. 指導教授：林文川教授. 研究生：蔡佳慈. 中華民國九十七年七月.

(2) 致謝辭感謝恩師林文川教授，於就學期間悉心的指導與照顧，充實我的專業知識，並引領我以積極、謹慎的態度去面對事情。若沒有您細心的修改與指正，本篇論文就無法誕生，師恩浩蕩，感謝之情溢於言表。口試審查期間承蒙台灣大學食品科技研究所的沈立言教授，以及藥理科的湯智欣助理教授，對本篇論文的撥冗審查，惠與寶貴的意見與指正，使本論文更加完善，在此獻上最真誠的謝意。感謝基礎醫研所的馬明琪教授以及王啟仲助理教授的指導與鼓勵。感謝藥學院蔡輝彥院長、中藥所陳玉芳所長、藥理科譚思濰主任、謝文聰副教授、湯智昕助理教授、楊家欣助理教授以及柯毅文先生，還要感謝醫研所陳麗如小姐，對我實驗生涯的諸多幫助與關懷，給我更寬廣的視野，真是受益良多。感謝實驗室的夥伴：學姊方焄蓮、楊麗嬋、學長吳岳文、蕭宏柏、許日昇、助理涂慧珠、余玓澄、學妹吳宛臻、潘彥君、劉鈺婷、方瑞琪、學弟蘇信瑋、張志民、吳明諺，對我實驗上的諸多協助與關懷。還要感謝我的同學們，尤其是盧易鮮、賴姿秀、陳怡婷、郭昱均、江羿霖、張正守等，感謝你們在求學期間對我的支持與關懷，在我困難時伸出援手。.

(3) 最後還要感謝我的家人，你們的支持和鼓勵，給了我很大的力量，還有在求學期間，ㄧ直陪伴我的宏傑，謝謝你們，沒有你們就沒有今天的我。.

(4) 目錄中文摘要 ………………………………………………………………V 英文摘要………………………………………………………………VII 第一章. 緒論…………………………………………………………1. 第一節研究背景及目的……………………………………………1 第二節金線連糖苷與台灣金線連之文獻考察……………………4 一、金線連糖苷之文獻考察……………………………………4 二、金線連的分布與型態………………………………………5 三、民間入藥用法………………………………………………6 四、. 金線連成分…………………………………………………7. 五、. 金線連藥理活性……………………………………………8. 第三節肝臟損傷的相關因素 ……………………………………11 一、肝臟結構……………………………………………………11 二、肝臟發炎……………………………………………………15 三、肝臟纖維化…………………………………………………22 四、肝臟再生……………………………………………………24 五、四氯化碳肝臟損傷…………………………………………25 第二章. 金線連糖苷對四氯化碳誘發小鼠肝損傷的保護作用 …28 前言 ………………………………………………………28 材料與方法 ………………………………………………28 結果 ………………………………………………………36 討論 ………………………………………………………38. 第三章. 金線連糖苷抑制脂多糖誘發巨噬細胞活化………………59 前言 ………………………………………………………59 材料與方法 ………………………………………………59 I.

(5) 結果 ………………………………………………………66 討論………………………………………………………..69 結論 ……………………………………………………………………81 參考文獻 ………………………………………………………………83. II.

(6) 圖表目錄. Table 1. Oligonucleotide sequences used in RT-PCR ….……………….43 Fig. 1. Effect of kinsenoside on the activity of plasma ALT in CCl4-treated mice. ……………………..……………………….44 Fig. 2.. Effect of kinsenoside on the activity of plasma AST in CCl4-treated mice……………………….………………………45. Fig. 3.. Effect of kinsenoside on the concentration of plasma total bilirubin in CCl4-treated mice ….………………………………46. Fig. 4. Effect of kinsenoside on the hepatic content of hydroxyproline in CCl4-treated mice……….………………………………………47 Fig. 5. Effect of kinsenoside on the hepatic content of TNF-α in CCl4-treated mice ……..………………………………………..48 Fig. 6. Effect of kinsenoside on the hepatic content of IFN-γ in CCl4-treated mice.. ……………………………………………..49 Fig. 7. Effect of kinsenoside on the hepatic content of IL-6 in CCl4-treated mice ..……………………………………………..50 Fig. 8. Effect of kinsenoside on the hepatic content of IL-10 in CCl4-treated mice…………………………………………...…..51 Fig. 9. Treatment with kinsenoside improved the histology of CCl4-treated mice liver………..………………………………..52 Fig. 10 Localization of liver PCNA expression in CCl4-induced mice liver injury……………………………………………………………53 Fig. 11 Localization of liver p65 and CD14 expression in CCl4-induced mice liver injury…………………...……………………………54 III.

(7) Fig. 12. RT-PCR analysis of α-SMA mRNA level in CCl4-treated mouse liver tissue………………………………………………………55 Fig. 13. RT-PCR analysis of CD14 mRNA level in CCl4-treated mouse liver tissue………………………………………………………56 Fig. 14. RT-PCR analysis of iNOS mRNA level in CCl4-treated mouse liver tissue …………………………………..………………….57 Fig. 15. RT-PCR analysis of CD14 mRNA level in CCl4-treated mouse liver tissue………………………………………………………58 Fig. 16. Effect of LPS-induced cytotoxicity in mouse RAW 264.7 macrophages …………………………………..……………….72 Fig. 17 The production of nitric oxide ( NO ) induced by LPS in mouse RAW 264.7 macrophages …………………..………………….73 Fig. 18 Effect of kinsenoside-induced cytotoxicity in mouse RAW 264.7 macrophages……………………………………………………74 Fig. 19 The inhibitory effect of kinsenoside on LPS-induced production of NO in mouse RAW 264.7 macrophages……………………..75 Fig. 20. Effects of kinsenoside on LPS-induced iNOS protein expressions in RAW 264.7 cells……………………………………………..76 Fig. 21. The inhibitions of NF-κB nuclear translocation by kinsenoside.77 Fig. 22. The inhibitions of NF-κB nuclear translocation by kinsenoside.78 Fig. 23. Effect of kinsenoside on LPS-induced IκB-α and IκB-α phosphorylation protein expressions in RAW 264.7 cells…..…79 Fig. 24. Effect of kinsenoside on the LPS-induced phosphorylations of MAPKs in RAW 264.7 cells …………………………………..80. IV.

(8) 金線連糖苷對四氯化碳誘導小鼠肝損傷的保護作用：經由抑制庫氏細胞的活化. 蔡佳慈. 摘要本研究主要探討金線連糖苷對四氯化碳誘發小鼠肝炎的保護作用，金線連糖苷抑制脂多糖活化巨噬細胞的作用途徑。小鼠每十克體重給予 0.1 毫升的四氯化碳 (10 %)，一週兩次，為期三週，期間每天均給予金線連糖苷。餵食金線連糖苷的小鼠，血中的 alanine aminotransferase (ALT) 和肝臟膠原蛋白含量與四氯化碳組比有顯著差異。四氯化碳使肝臟中的 tumor necrosis factor-α (TNF-α)、interferon-γ (IFN-γ)、interleukin-6 (IL-6) 和 interleukin-10 (IL-10) 的數值顯著上升，金線連糖苷明顯的使這些數值都下降。在 reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 的分析中可發現，金線連糖苷可使 α-smooth muscle actin (α-SMA), CD14 和 Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) mRNA 的表現都降低。在組織學的分析中可發現，金線連糖苷可減輕四氯化碳所引發的肝臟細胞壞死的情形。免疫組織染色的結果可以確認金線連糖苷確實抑制了肝臟 p65 和 CD14 的表現。增生細胞核抗原 proliferating cell nuclear V.

(9) antigen (PCNA) 的表現增加，說明了金線連糖苷會促進肝細胞的增生。金線連糖苷在不影響 RAW 264.7 巨噬細胞株的存活之下，可明顯的抑制脂多醣所誘導之一氧化氮產生。金線連糖苷能抑制誘導型一氧化氮合成酶的蛋白和 mRNA 的表現。金線連糖苷在脂多醣的刺激下，可以抑制 p65 / p50 轉移至核內。並使得磷酸化的 inhibitor α of nuclear transcription factor κB (IκBα) 表現減少，也使得磷酸化的 mitogen activated protein kinases (MAPKs)，包含 extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK 1/2)、c-Jun N-terminal Kinase (JNK)、p38，表現被抑制。根據這些結果推論，金線連糖苷抑制肝臟發炎的機制，可能是透過抑制 inhibitory κB kinase (IKK) 和 mitogen activated protein kinases (MAPKs) 的磷酸化，而抑制了 nuclear factor-kappa B (NFκB) 的活化。. VI.

(10) Protective effect of kinsenoside on liver injury induced by carbon tetrachloride in mice: Possible involvement of the Kupffer cell inactivation Chia-Tzu Tsai. Abstract Anoectochilus formosanus, a plant native to Taiwan, is used as a folk medicine. It has been reported that A. formosanus produced a prominent liver-protective effect against CCl4-induced hepatotoxicity. A higher concentration of kinsenoside is detected in the crude drug A. formosanus. The purpose of this study was to investigate the hepatoprotective effect of kinsenoside on chronic liver damage induced by CCl4 in mice. Kupffer cells are the resident macrophages of the liver. When activated by lipopolysaccaride (LPS), they produce and release numerous mediators. Many of these mediators further activate or modulate the effects of nearby cells involved in the inflammatory process and can contribute to the development of injury. It has been showed that inactivation of Kupffer cells can attenuate hepatocellular necrosis induced by CCl4. Therefore, we also examined the mechanism of inhibitory by kinsenoside of LPS-stimulated nitric oxide production in RAW 246.7 murine macrophage-like cell line. CCl4 (10%; 0.1 ml/10 g body weight) was given twice a week for 3 weeks, and the mice received kinsenoside throughout the entire experimental period. Plasma activity of ALT, and hepatic levels of VII.

(11) hydroxyproline were significantly lowered in mice treated with kinsenoside as compared to mice treated with CCl4 only. CCl4 treatment mice significantly increased the hepatic contents of tumor necrosis factor-α, interferon-γ, interleukin-6 and interleukin-10, while kinsenoside suppressed these mediators of inflammation in liver damage. RT-PCR analysis showed that kinsenoside treatment decreased hepatic α-smooth muscle actin, CD14 and iNOS mRNA expressions. Histological evaluation showed that kinsenoside could attenuate the liver necrosis caused by CCl4. Immunohistoglogical examinations further showed that kinsenoside inhibit the hepatic expressions of p65 and CD14. In contrast, kinsenoside enhanced the expression of hepatic proliferating cell nuclear antigen, which is the biomarker of liver regeneration. Kinsenoside was found to inhibit LPS-induced NO production without affecting cell viability in RAW 246.7 macrophages. Kinsenoside exhibited parallel inhibition of LPS-induced expression of iNOS protein and iNOS mRNA. Kinsenoside inhibited the both p65 and p50 translocation in LPS-activated macrophage. Kinsenoside reduced the protein expressions of phosphorylation of IκBα. In addition, kinsenoside also inhibited protein expressions of phosphorylation of mitogen activated protein kinases (MAPKs), including ERK 1/2、JNK、p38. These results suggest that kinsenoside may exert its anti-hepatitis by suppression the activation of NFκB through inhibition of of inhibitory κB kinase and MAPKs activities.. VIII.

(12) 第一章緒論. 第一節研究背景及目的. 根據行政院衛生署的統計，台灣每年約有五千人左右因慢性肝病及肝硬化而死亡，肝病在十大死因中佔第七位，相較於其他國家，台灣肝病的盛行率偏高，在台灣肝病甚至有國病之稱，因此肝病的防治在台灣是重要的課題。不論是病毒或酒精等任何因素引所引起的的慢性肝炎，都有可能演變成肝纖維化甚至轉成肝硬化 (Friedman, 2003)。目前對於肝硬化，只能對引起的併發症，如門脈高壓、腹水、血管瘤、肝昏迷等採取對症療法，沒有可以根本治療的藥物 (Gill & Kircbain, 1997)。對於病毒性肝炎雖有抑制病毒的藥物，但由於抗藥性等問題，還是沒有完全克服 (Safrin, 2007)。因此開發能減輕肝臟發炎，延緩肝硬化進展的保健食品在保肝防禦上佔有一席之地。由中草藥研發保肝產品素來受到國內外的重視，諸如 Silymarin、小柴胡湯、人參、靈芝、五味子。台灣特有的樟芝、蜆精也已有產品上市。本研究室ㄧ直從事中草藥的保肝研究，尤其是對台灣金線連的保肝作用已有近十年的歷史。台灣金線連其保肝成果已技轉給廠商，承接的廠商正積極朝產品開發上市。 1.

(13) 民國九十六年十大死亡原因民. 國九. 十. 六. 順死亡人數. 死亡原因. 每十萬人死亡百分比口死亡率. %. 139,376. 608.2. 100.0. 位所有死亡原因. 年. 惡性腫瘤. 1. 40,306. 175.9. 28.9. 心臟疾病. 2. 13,003. 56.7. 9.3. 腦血管疾病. 3. 12,875. 56.2. 9.2. 糖尿病. 4. 10,231. 44.6. 7.3. 事故傷害. 5. 7,130. 31.1. 5.1. 肺炎. 6. 5,895. 25.7. 4.2. 慢性肝病及肝硬化. 7. 5,160. 22.5. 3.7. 腎炎、腎徵候群及腎性病變 8. 5,099. 22.2. 3.7. 自殺. 9. 3,933. 17.2. 2.8. 高血壓性疾病. 10. 1,977. 8.6. 1.4. 33,767. 147.3. 24.2. 其他. 附註：1.九十六年年中人口數 22,917,444 人。 2. 標準化死亡率係以 2000 年 W.H.O.世界人口年齡結構為基準。資料來源：行政院衛生署. 2.

(14) 台灣金線連在台灣民間是受到相當重視的保健植物，何時開始被用來治病已無法考察。台灣最早的藥用植物書籍，1924 年日本人佐佐木舜一所著「綱藥台灣民間藥用植物誌」的第一張圖即為台灣金線連可見其所受到的重視。因具有多重的保健功效，在民間台灣金線連被稱為「藥王」或「藥虎」。依據中醫師蔡吉雄 (2003) 的經驗，慢性肝炎、肝硬化是台灣金線連主要臨床用途之一。本實驗室早期使用台灣金線連水粗萃取物，發現其可以減輕四氯化碳及 Dimethylnitrosamine 所引起的大鼠肝纖維化 (Shih et al., 2005; Shih et al., 2004)。因此引起廠商的興趣參與產學合作，共同開發台灣金線連保肝產品，在開發過程中找到了保肝的有效成分金線連糖苷 (kinsenoside)，以此建立了規格化生產台灣金線連保肝原料。台灣金線連保肝原料的研究，細胞的實驗顯示其對肝細胞有保護作用 (Wu et al., 2007)，對 thioacetamide 誘發肝炎的實驗研究，顯示其抑制發炎作用與 kupffer 細胞的活性有關 (Wu et al., 2008)。金線連糖苷是台灣金線連的主要成分，金線連糖苷作用的解明有助於對台灣金線連保肝作用的瞭解。因此，本研究之主要目的為探討金線連糖苷保肝作用之機轉。先以四氯化碳誘發小鼠肝損傷的模式，確認金線連糖苷抑制肝臟發炎的效果後，進一步以巨噬細胞 Raw 264.7 來探討金線連糖苷在細胞內的作用途徑。. 3.

(15) 第二節金線連糖苷與金線連的文獻考察. 一、金線連糖苷. 金線連糖苷 (kinsenoside) 3-(R )-3-β-D-glucopyranosyloxybutanolide. 金線連糖苷最早是日本人由高雄金線連 (A. koshunensis) 分離出 (Ito et al., 1993)。後來 Du et al. (2001) 指出台灣金線連含有高含量的金線連糖苷。金線連糖苷有降血糖及降血脂作用 (Takeshita et al., 1995)。最近的研究指出金線連糖苷能修複胰島 β-細胞的損傷 (Zhang et al., 2007)。金線連糖苷具減肥作用，研究顯示對高脂飼料誘發的肥胖大鼠，及 aurothioglucose 誘發的肥胖小鼠有抗脂肪組織過多症 (anti-hyperliposis) (Du et al., 2008)。金線連糖苷的異構物，由 Goodyear 屬植物分離出的. 3-(S)-3-β-D-glucopyranosyloxybutanolide. (goodyceroside) 不具有抗脂肪組織過多作用，但對四氯化碳引起的肝細胞損傷有保護作用 (Du et al., 2008)。我們進行台灣金線連抗肝纖維化的研究，以四氯化碳誘發小鼠肝損傷的模式，確認金線連糖苷具保 4.

(16) 肝作用 (Wu et al., 2007)。金線連糖苷的化學合成方法已被建立 (Zhang et al., 2005). 二、金線連的分布與型態台灣金線連是珍貴的蘭科草本植物，學名是 Anoectochilus formosanus Hayata，英文名稱為 Taiwan jewel orchid (台灣寶石蘭) (蕭等， 2007)；台灣金線連曾廣泛分布在海拔五百到一千七百公尺的冷涼原始林蔭處；竹林下堆積深厚且排水良好的腐葉土層，也常見較大面積族群散生其間，其生育適溫約在攝氏 20 ~ 24 度，在北部的北插天山、宜蘭縣棲蘭山、南投縣水社大山、嘉義縣奮起湖及南部的南仁山等地，均見其蹤跡。採自原始林區的新鮮全草在市場零售價格，每台斤高達七、八千元以上，因相傳效用廣泛能治療許多疾病，故有「藥王」、「藥虎」之稱。又因山林珍禽喜食，所以另稱「娃雞草」或「雉雞草」。養鴿人家常在參加比賽時，讓賽鴿食用大量金線連，據說有增強飛行耐力的效果，故祕稱其為「鳥參」或「鳥人蔘」。此外，民間也傳說只要有台灣金線連生長的地方，就有兇猛的百步蛇守護左右，如用客觀角度分析，因為此種珍貴藥草生育環境分布在陰涼潮濕的林蔭下，蛇類常出沒其間也就不足為奇了。世界上和台灣金線連有親緣關係的植物種類可能超過 35 種，台灣主要有兩種台灣金線連和高雄金線連 (或稱恆春金線連)。上述二種植株外觀形態極為相似， 5.

(17) 一般以葉片紋路或莖節匍匐性強弱作為判斷依據；較明確的辨別方法是以花朵中間部位是否具梳子狀的構造加以區別，具有這種特性的是台灣金線連，呈片狀的則是高雄金線連。金線連一般在夏末秋初由植株頂端開始抽出花莖，野生植株開花數目約為 2 ~ 7 朵，但經人工溫室培育者則可達 22 ~ 24 朵。其葉片長約五公分，寬約三公分，呈圓卵形；葉面暗綠色有絨毛般的觸感，葉背則為淺紫紅色﹔葉片表面分布有耀眼且呈網狀相連的黃白色葉脈線條，故稱「金線連」，民間常有人寫成「金線蓮」，其實它與「蓮花」並沒有相近的親緣關係。值得一提的是，金線連在陽光反射下可見葉脈發出點點有如星鑽般燦爛的光芒，甚具觀賞價值，稱它為「超炫寶石蘭」一點也不為過 (蕭等，2003)。. 三、民間入藥用法早期日本人佐佐木舜一 (1924) 的調查指出，為滋養強狀劑，治肺病、廢勞，對其他補血、遺漏、遺精有效，或用於解熱、肝、脾等臟器之疾病，也用於毒蛇咬傷。甘偉松 (1979) 指出主治肺病、高血壓、蛇傷、腎虧、小兒發育不良。蔡吉雄 (2003) 對台灣金線連應用的心得，主要用於肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、青春痘及黑斑、大便出血、小便出血、咳嗽痰中帶血、高血壓、糖尿病等。. 6.

(18) 四、金線連成份台灣金線連成分相關的研究整理如下： 1. 4-[β-Dglucopyranosyloxy)benzyl alcohol)即gastrodin (天麻素) (Ito et al., 1993) 2. Glucoside (Du et al., 2000) 1) 3-(R )-3-β-D-glucopyranosyloxybutanolide 2) 3-(R )-3-β-D-glucopyranosyloxy-4-hydroxybutanoic acid 3) 1-O-isopropyl-β-D-glucopyranoside 4) (R)-(+)-3,4-dihydroxybutanoic acid γ-lactone 5) 4-(β-D-glucopyranosyloxy) benzyl alcohol 6) (6R,9S)-9-hydroxy-megastigma-4,7-dien-3-one-9-one-O-βD-glucopyranoside 7) corchoionoside 3. Flavonoid (Wang et al., 2002) 1) isorhamnetin 2) quercetin 4. Kinsenone (Wang et al., 2002) 大陸種的金線連，花葉開唇蘭[A. roxburghii (Wall.) Lindl.]，最近的研究得知有下列成分 1.oleanolic acid、ursolic acid (Huang et al., 2007) 2. triterpenoid: sorghumol 3-O-Z-p-coumarate Sorghumol 3-O-E-p-coumarate (Han et al., 2008) 3. alkaloid: anoectochine (Han et al., 2008). 7.

(19) 五、台灣金線連藥理活性 1. 抗氧化台灣金線連水萃取物具有抗氧化作用，可以抑制自由基的產生，及抑制低密度脂蛋白的氧化 (Shih et al., 2003; Wang et al., 2002)。對 HL-60 細胞株因 H2O2 產生的氧化壓力所造成的凋亡也有保護作用 (Wang et al., 2005)。. 2. 心血管保護台灣金線連萃取液能抑制血小板中前列凝素 (thromboxanes) 合成和促進動脈內皮組織中前列環素 (prostacyclin) 的產生，這些主要是透過抑制前列凝素合成酵素及活化環化加氧酵素 (cyclooxygenase) 所產生的作用 (Mak et al., 1989) 最近的臨床研究，台灣金線連對高血脂病人具有降低血中總膽固醇、低密度脂蛋白及極低密度脂蛋白的效果 (Du et al., 2007)。. 3. 護肝台灣金線連水萃取物可保護大鼠初代細胞對抗四氯化碳引起的損傷 (Du et al., 2003)。對四氯化碳或 Dimethylnitrosamine 誘發大鼠慢性肝炎，所引起的肝臟萎縮、脾臟腫大、低白蛋白血症、凝血時間延長、及肝臟膠原蛋白增加等，台灣金線連水粗萃液都有改善作用 (Shih et al., 2004; Shih et al., 2005)；對大鼠以 Dimethylnitrosamine 造成肝損傷及部分切肝的實驗條件下，有促進肝臟再生的作用 (Shih et al., 2004)。我們進以四氯化碳誘發小鼠肝損傷的模式，確認金線連糖苷具保肝作用 (Wu et al., 2007)。在四氯化碳誘發小鼠肝纖維化的模式，台灣金線連水萃液可以提升肝組織的. 8. methionine.

(20) adenosyltransferase 1A mRNA 表現，及降低 transforning growth factor-β1 mRNA 的表現，顯示其具有保護肝細胞及減弱星狀細胞活化的作用 (Fang et al., 2007)。最近以 thioacetamide 誘發小鼠肝纖維化的研究，發現台灣金線連水萃液減輕肝臟發炎，與抑制肝臟吞噬細胞 (Kupffer cell) 的活性有密切關系 (Wu et al., 2008)。. 4. 降血糖金線連能抑制腎上腺素對糖元分解的促進作用，且對於四氧嘧啶引起小鼠血糖升高具有防治的效果 (陳 & 黃，2000)。台灣金線連對於 streptozotocin 誘發高血糖大鼠，有驟降血糖的作用，可降低血清糖化蛋白，且使抗氧化酵素有顯著性的回升 (Shih et al., 2002)。最近的文獻也指出金線連糖苷對 streptozotocin 引起大鼠胰島β-細胞損傷有修補作用 (Zhang et al., 2007)。. 5. 調節免疫金線連含有多醣的成分，具有重要的免疫調節功能 (Chen et al., 2004)。本研究室證實口服給予鼷鼠台灣金線連多醣分劃二週後，其腹腔的巨噬細胞作用明顯上升，體外試驗也顯示該多醣能活化 RAW264.7 巨噬細胞的吞噬作用以及釋出 NO、IL-2 及 γ-干擾素 (徐，2004)。其機制推測為金線連多醣會與巨噬細胞表面的接受器結合，造成內在訊息傳導並導致 NO 的生成增加，進而影響細胞骨架蛋白質的變化，使得吞噬細胞伸出偽足、增加吞噬活性 (廖，2005)。將 CT-26 癌化細胞利用皮下移植到 BABL/c 小鼠體內時發現，金線連水萃取物，可促進巨噬細胞的存活率及吞噬作用 (Tseng et al., 9.

(21) 2006)。另外，藉由卵蛋白誘導氣喘小鼠的模式，亦證實金線連水萃取物可能透過 CD25+/CD4+T 細胞的作用，而達到免疫調節的效果 (蕭，2004)。. 6. 抗癌金線連萃取物可以加速 MCF-7 乳癌細胞的凋亡，並阻斷癌細胞的結構分子途徑，以抑制癌細胞增生 (Shyur et al., 2004; Yang et al., 2004)。亦有研究利用皮下移植方式將 CT-26 colon cancer cell 移植到 BALB/c 小鼠體內誘導癌症發生，發現金線連水萃物可以抑制腫瘤的生長 (Tseng et al., 2006)。. 7. 抗疲勞過去學者發現，餵食金線連萃取物的小鼠，可以增加游泳的運動強度以及延長游泳時間，同時可以減少脂肪堆積，推測金線連萃取物可以提高小鼠對脂質的利用率 (Ikeuchi et al., 2005)。. 8. 改善骨質疏鬆本實驗室曾利用金線連水粗萃物餵食去卵巢大鼠，結果發現可以降低血中鹼性磷酸酶、有效抑制去卵巢大鼠體重增加以及改善第四腰椎骨的骨密度以及骨鈣含量 (Shih et al., 2001)。最近日本人的研究也發現台灣金線連可抑制去卵巢大鼠破骨細胞的活而減少骨質流失 (Masuda et al., 2008)。. 10.

(22) 第三節. 肝臟損傷的相關因素. 一、肝臟的結構肝臟是人體最大的器官，位於腹腔上方右側，成人肝臟約重 1300 克，表面平滑呈暗紅色，肝臟可以接受來自胰臟、脾臟及腸所輸送而來的靜脈血液，這些血液中包含了養分、毒素及廢棄的代謝物 (Williams, 1995)。肝臟的細胞主要可以分為兩大類，ㄧ類為實質細胞 (parenchymal cells)，另一類為非實質細胞 (non-parenchymal cells)，實質細胞主要由肝細胞所構成，大約佔肝臟細胞 80 % 左右，外觀上為不規則多面體，有數個細胞核。而非實質細胞則包括膽管細胞 (cholangiocyte)、庫氏細胞 (kupffer cells)、內皮細胞 (endothelial cell)、星狀細胞 (stellaet cells) 等。. 1. 肝臟細胞 (Hepatocyte) 人體有許多重要的生合成反應都在肝細胞進行，包括醣類、脂質、蛋白質等營養的代謝、利用及儲存，固醇類激素、類固醇、凝血因子、白蛋白的合成，膽汁、尿素之形成，藥物毒素代謝，長鏈不飽和脂肪酸、磷脂質、脂蛋白、酮體等合成等 (Ganong, 1997)。肝臟細胞進行許多重要的代謝合成反應，需要多種酶來輔助進 11.

(23) 行，如丙氨酸轉氨酶 (Alanine aminotransferase, ALT)、天門冬胺酸轉氨酶 (Aspartate aminotransferase, AST)，進行胺基酸代謝產生氨。ALT 即 GPT (Glutamyl pyruvic transaminase)主要存在於肝臟。AST 即 GOT (Glutamyl oxaloacetic transaminase) 存在於肝臟、心臟、骨骼肌，較不具肝臟專一性。當肝細胞受損時，ALT 和 AST 會被釋放到血液中，偵測血中此兩種酵素的活性，可以推知肝損傷的程度。這兩項生化值檢驗是偵測肝功能損傷的重要指標 (Sturgill & Lambert, 1997)。膽紅素是紅血球的代謝產物，老舊的紅血球在脾臟中被破壞後，攜帶氧氣的血紅素被釋放出來變成膽紅素。這些膽紅素大部分經由膽管注入腸道內，經糞便排出體外。如果肝細胞受損或膽道阻塞，膽紅素無法順利排出，就逆流進入血液中，於是血中膽紅素值就會升高。總膽紅素包括直接膽紅素和間接膽紅素。直接膽紅素即結合膽紅素，是經過肝臟處理後與葡萄糖醛酸結合的水溶性的膽紅素，間接膽紅素即非結合膽紅素，是紅血球破壞後游離出的未被肝臟處理的非水溶性的膽紅素 (Turgut et al., 1997)。. 2. 庫氏細胞 (Kupffer cells) 巨噬細胞是起源於骨髓。單核球先驅細胞 (myeloid progenitor) 先. 12.

(24) 分化成前單核球 (promonocyte)，然後離開骨髓進入血液時才進ㄧ步分化成單核球 (monocyte)。當單核球由血液移行進入組織後便稱為巨噬細胞 (macrophages)。巨噬細胞只存在於組織並不出現於血液中，其體積比單核球大，約 20 ~ 50 μm，形狀呈卵圓狀。細胞質比單核球更為成熟，含有內質網、高基氏體、粒線體及空泡等構造。細胞核呈 bilobate kidney 形狀，含有核仁。巨噬細胞遍佈全身各組織，因而構築成ㄧ單核吞噬細胞系統。在各器官中巨噬細胞的名稱及型態略異。如在皮膚則稱為 langerhans 氏細胞，在皮內組織稱為組織細胞 (histiocytes)，在骨骼則稱為破骨細胞 (osteoclast) ，在肺部稱為肺巨噬細胞 (alveolar macrophage)，在神經系統則成為小神經細胞質細胞 (microglia)，在肝臟則稱為 Kupffer cell。庫氏細胞即為位於肝臟的巨噬細胞，於 1876 年由 Kupffer 先生首度在肝臟的竇狀隙發現這些特化的內皮細胞，當時命名為 sternzellen (star cells)，但其他學者為區別庫氏細胞與星狀細胞，改稱呼為 Kupffer cells (庫氏細胞) (Haubrich, 2004)。庫氏細胞的大小約 15 ~ 20 μM 的不規則形態，細胞上有 70 nm 厚的絨毛外殼，有 15 nm 的莢膜，貼附於肝臟竇狀隙的內皮細胞上，約佔肝臟非實質細胞總數的 35 %，以肝門脈區數量較多 (Gregory et. 13.

(25) al., 2002)。庫氏細胞能吞噬廢棄血球細胞，如紅血球和白血球，或細菌碎片、細菌內毒素 (Muriel et al., 2001; Muriel & Escobar, 2003)。庫氏細胞與慢性肝臟疾病的發炎過程息息相關，包括外來毒素、酒精等引起之免疫反應、由 B、C 型肝炎病毒引發的免疫反應、肝臟的自體免疫反應 (Gregory & Wing, 2002)。. 3. 內皮細胞 (endothelial cell) 單層的內皮細胞圍成靜脈竇，管腔比微血管較寬，由肝門靜脈及肝動脈分枝流入，並流進肝靜脈。內皮細胞具高度通透性，能讓血漿物質通過，達到肝細胞 (Ganong, 1997)。. 4. 星狀細胞 (Hepatic stellate cells) 肝臟星狀細胞是 Ito 學者在人類肝細胞切片中發現有儲存脂肪滴的細胞 (Ito & Nemoto, 1952)。Suzuki 在迪氏腔發現外型似星狀的細胞因而得名 (Wake, 1980)。星狀細胞約佔肝細胞總數的 5 ~ 8 %，與肝實質細胞的比例約 13：100，因為儲存維他命 A，故又稱 fat-storing cell、vitamine A rich cell 等等 (Geerts, 2001)。因含有油滴，在波長 328 nm 時，會發出微綠自體螢光 (Wake, 1971)，利用此特性可以鑑別星狀細胞和與其相似的纖維母細胞之差別。. 14.

(26) 二、肝臟發炎 1. 庫氏細胞的活化庫氏細胞是巨噬細胞的一種，在正常生理狀態之下巨噬細胞是處於不活化狀態，只有在受到外來病菌或其產物，例如脂多糖 (lipopolysaccharide; LPS)、lipoteichoic acid 等刺激才會活化。被活化的庫氏細胞會釋放出 Tumor necrosis factor-α (TNF-α)、Transforming growth factor-β1 (TGF-β1)、Interleukin 6 (IL-6)、Interleukin-10 (IL-10) 等細胞激素和發炎因子促使傷害進行 (Su, 2002)。在四氯化碳、酒精等毒性物質引發肝臟受損的過程中，會引發庫氏細胞活化，釋出細胞激素如 TNF-α 等。這些細胞激素會進ㄧ步活化發炎路徑，促使肝細胞釋出 TGF-β1 活化星狀細胞，庫氏細胞等持續發炎，引起周圍肝細胞受損或死亡 (Son et al., 2007)。因此，阻斷庫氏細胞活化，被視為一種阻止肝臟纖維化病程進展的方式 (Luckey & Petersen, 2001; Rivera et al., 2001)。. 1 ) LPS LPS 為革蘭氏陰性菌細胞壁上的物質，會由腸道進入肝門脈血流，其細胞壁會釋放 LPS，或稱內毒素，引起發炎反應 (Nanji, 2002)。大鼠給予四氯化碳誘發肝纖維化，可以發現血清中有大量的 LPS 存在，進而活化庫氏細胞 (Lorenzo-Zuniga et al., 2006; Qiu et al., 2005)。 15.

(27) 當巨噬細胞受到 LPS 刺激後，會誘導許多發炎媒介物的基因表現。而 LPS 會與 LPS 結合蛋白 (LPS-binding protein, LBP) 在血漿中結合形成 LPS / LBP 複合體，運送並促進 LPS 與巨噬細胞膜上的接受體 CD14 結合，進一步轉移並結合到 Toll-like receptor-4，才將訊息傳入細胞內。之後藉由相關的蛋白的調節作用活化 Nuclear factor-κB (NFκB)。一般活化 NFκB 的路徑分兩種 (1) inhibitory κB (IκB) kinase (IKK) / NF-κB 途徑、(2) mitogenactivated protein kinases (MAPKs) 途徑。NFκB的活化可以調節發炎相關基因，如誘發性表現型一氧化氮合成酶 (inducible nitric oxide synthase, iNOS) 、環氧酵素 -2 (cyclooxygenase-2, COX-2)、細胞激素 (IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α)。. 2 ) IKK / NFκB 途徑 NF-κB 是由不同的次單元體 (subunits) 組成的同二聚體 (homodimers) 或是異二聚體 (heterodimers)。家族成員被分為五種不同的相關結構蛋白質：p50、p52、p65 (RelA)、RelB 以及 c-Rel。 NF-κB 的活化必須自細胞質外移入 (translocation) 細胞核中，來執行其調節作用。因此，NF-κB 移入細胞核的能力，是討論 NF-κB 活性的重要指標。NF-κB 以 p65/p50 異二聚體存在最為普遍。p65/p50 異二聚體具有很強的轉錄活性 (transcriptional activity) (Teng et al., 2006)。在. 16.

(28) 未受到活化細胞，細胞質中的 p65/p50會與抑制其活性的 IκBα 結合。IκBα 會遮蔽掉 NF-κB 的 nuclear localization signal (NLS)，使其無法進入細胞核內，而停留在細胞質中。在 IKK/NF-κB 途徑，LPS 的刺激會活化上游的 NFκB-inducing kinase (NIK)，造成 Iκ-B kinase 磷酸化，進而使 IκBα 磷酸化。當 IκBα 被磷酸化後與 polyubquitin 結合，使 IκBα 與 NF-κB 的結合分開，NF-κB 成為自由態暴露 NLS，NF-κB 異二聚體可以進入到細胞核內，活化 NF-κB 所調節的基因表現，產生並釋放相關蛋白，包括 iNOS、COX2、TNF-α、IL-6 等 (Szabo et al., 2007)。. 3) MAPK 路徑在哺乳動物細胞，MAPK 訊息傳遞路徑扮演相當重要的生物功能調控角色。當細胞接受不同的外界環境因子刺激活化了 MAPK 訊息傳導路徑，進而調控細胞增殖、分化、存活或細胞凋亡。MAPK 訊息傳遞路徑可分為三大類，extracellular signal-regulated kinase (ERK 1/2) 路徑、c-Jun N-terminal kinase (JNK) 路徑及 p38 MAPK 路徑 (Papatsoris & Papavassiliou, 2001)。此三條 MAPK 路徑在 LPS 誘發 NF-κB 的活化過程中扮演重要的角色。MAPK 被激活以後，轉移至细胞核内，進而影響核内 NF-κB 基因的調控作用 (Liao et al., 2004)。. 17.

(29) 在未受刺激的细胞内，MAPK 為静止型，當其接收上游分子 MAP Kinase Kinase (MAPKK) 的磷酸化調控信號後，MAPK 會被磷酸化，轉為活化形式的 MAPK。使 MAPK 磷酸化的 MAPKK 又受到 MAP Kinase Kinase Kinase 的調節。. ( http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/25160/LPS-stimulated-MAPK -small.jpg ). 2. 發炎反應當 LPS 入侵後會引起體內的免疫反應，促使巨噬細胞活化以對抗外來病原，而降低其對體內之傷害。以 LPS 刺激巨噬細胞時，所 18.

(30) 生成的物質有三類， reactive oxygen species (ROS)、脂質衍生物、細胞激素。. 1 ) ROS：NO NO 是一種具有多種生物活性的自由基，可由 nitric oxide synthase (NOS) 的催化而產生。NOS 一有三種亞型，包括 eNOS、 NOS、NOS。一般 eNOS 及 nNOS 是在平常狀態即存在 (constitutive expression)，以維持正常的生理功能。相反的 type II NOS，又稱作 inducible NOS (iNOS)，它在平常的細胞中並沒有表現，只有在受到發炎等刺激下才會被誘發出來，iNOS 與受質 L-arginine 作用產生 NO，釋放到細胞外。許多血管中的細胞，例如巨噬細胞、平滑肌細胞和纖維母細胞等，在受到發炎細胞激素的刺激都會表現出 iNOS (Luoma & Yla-Herttuala, 1999)。平滑肌細胞藉由 iNOS 所產生的 NO 可以代償 eNOS 的作用，使得血管舒張 (Fukumoto et al., 1997)，抑制血管平滑肌細胞增生 (Tanner et al., 2000)、血小板附著 (Yan et al., 1996) 及 LDL 的氧化 (Rikitake et al., 1998)，使原本增厚的血管壁有漸漸復原的趨勢。雖然 NO 如上述有保護的角色，但實際上它的作用是一刀的兩面，其在不同的病理狀態下有時反而是一有害的分子。舉例來說，革蘭氏細菌感染產生敗血症時，細菌細胞膜上的組成 LPS. 19.

(31) 會誘發 iNOS 大量表現，產生大量的 NO 而導致血管舒張、血壓下降、休克及多重器官衰竭。因此同樣一種分子所扮演的角色是保護性還是傷害性，會因其釋放量的高低及在不同病理狀況下而呈現不同的作用。除 LPS 外，iNOS 的表現也受細胞激素的調節。由 T 淋巴球細胞釋放的 interferon-γ (IFN- γ) 在發炎反應過程中也扮演一個重要角色，因為它可以加強 LPS 誘發許多發炎媒介物質的基因表現， iNOS 即是其中一例。. 2 ) 脂質衍生物在人體中有兩種環氧化酵素 (Cyclooxygenase，COX)，COX-1與 COX-2，基因大小分別為 25 kb 與 8 kb，在細胞中 COX-1 大多分部在內質網與核膜，COX-2 則只存在核膜，兩者參與完全不同的生理作用。COX-1 酵素，平時即出現在體內，在正常生理狀況下，COX-2 是不表現的；只有當細胞受到外來刺激時，COX-2 才會大量表現，並將細胞膜上的花生四烯酸催化成 Prostaglandin，引起嚴重的發炎反應 (Genc et al., 2007)。. 3 ) 細胞激素 (1) TNF-α (tumor necrosis factor-α) TNF-α 是從單核球細胞及巨噬細胞中所產生出來，其功能可以誘 20.

(32) 導單核白血球及巨噬細胞分化、活化巨噬細胞、刺激補體及凝血系統。在 LPS 誘導的發炎反應中，TNF-α 是一個最早期被誘發的調節因子，其次誘發 IL-1、IL-6 及 IL-8 的產生，進而誘導感染區域血管表達黏附分子，促使內皮細胞產生血小板活化因子，以催化血液凝結及局部血管阻塞，防止病原菌擴散，當其產生量不足或過度時反而會傷害宿主，許多疾病如敗血症、風濕性關節炎、氣喘等皆與 TNF-α 的過量形成有關 (Tracey & Cerami, 1993)，因此產生適量的 IL-1β、 IL-6 及 TNF-α 之調控是相當重要。TNF-α 在四氯化碳誘導的發炎反應中，扮演十分重要的角色 (Elsharkawy & Mann, 2007; Horn et al., 2000)。. (2) INF ( Interferon ) 是最先發現的細胞激素，具有干擾病毒感染和複製的能力。干擾素分為 α、β 和 γ。IFN-α、β 主要由白血球、成纖維細胞和病毒感染的組織細胞產生，也稱為 I 型干擾素。IFN-γ 主要由活化 T 細胞和 NK 細胞產生，也稱為 Ⅱ 型干擾素 (Obara et al., 2005)。在 LPS 誘導的肝發炎反應中，IFN-γ 也是一個會被刺激產生的細胞激素 (Wang, 2008 )。. (3) IL-6 ( Interleukin-6 ) 21.

(33) IL-6 屬多功能之細胞素，是由巨噬細胞、T 細胞、纖維母細胞及內皮細胞所分泌，其功能包括誘導急性期蛋白質之生合成、增加體溫、刺激 T 細胞的活化及刺激 B 細胞產生抗體等。研究發現，在四氯化碳誘導肝損傷之下，IL-6 的表現量會增加 (Elsharkawy & Mann, 2007)。. (4) IL-10 (Interleukin-10) IL-10 可以抑制發炎反應時 NF-κB 的活化、減緩吞噬細胞產生促發炎細胞激素 (proinflammatory cytokine)，例如 TNF-α、IL-6、 IL-12；抑制 cell-mediated immunity (TH1 response) 所引發的發炎反應，調控 B cell 功能、導向 humoral immunity (Th2 response)。 IL-10 對許多發炎反應、自體免疫實驗動物模式有顯著療效，例如：胰臟炎 (pancreatitis)、糖尿病 (diabetes mellitus) 、敗血性休克 (septic shock)、和器官移植 (organ transplantation) 等實驗動物模式。在四氯化碳誘導肝損傷之下，IL-10 的存在可降低纖維化的程度，但其也抑制了肝細胞的增生 (Louis et al., 1998)。. 三、肝臟纖維化肝臟纖維化是由於長期的肝損傷，造成庫氏細胞、內皮細胞等釋出細胞激素，進而刺激星狀細胞，使其活化成纖維母細胞，產生大量 22.

(34) 的細胞外間質，過度的堆積之下，便造成了纖維化。正常生理狀態下，星狀細胞多數處於靜止期 (quiescent) 狀態 (Gressner, 1996)。星狀細胞負責細胞外間質的維持，分泌的物質包括膠原蛋白第一、三、四、五、七型，及結構醣蛋白 (如：fibronectin、 laminin 等) (Geerts, 2001)。星狀細胞的生理反應，依序進展為 (a) 起始期 initiation (quiescent HSC) (b) 活化期 perpetuation (activated HSC) ( c) 修復期 resolution (apoptosis HSC) (Geerts et al., 1991)。當肝臟受到傷害，肝細胞受損，發炎細胞及內皮細胞釋出發炎因子，庫氏細胞活化。庫氏細胞及肝細胞釋出 TGF-β1 (Bataller & Brenner, 2005)，直接刺激活化星狀細胞由靜止態轉變為活化態，如傷害持續進行，則星狀細胞會持續活化，發炎細胞和活化態的性狀細胞會聚集，主要分泌的細胞外間質為膠原蛋白第一及第三型，以第一型的量居多 (Lee et al., 2001)。但身體的自我調節機制 (resolution) 會促使星狀細胞凋亡，此時星狀細胞進入修復期，膠原蛋白也會漸漸被分解 (Geerts et al., 1991)。活化態的星狀細胞骨架蛋白，主要是 desmin、α-smooth muscle actin (α-SMA)，desmin 約 70 ~ 80 % 的星狀細胞會表現，α-SMA 則是所有活化態星狀細胞都會表現，但正常細胞不會有 desmin、α-SMA 表現 (Zhang et al., 2006)。α-SMA 表現量為星狀細胞活化程度的主要. 23.

(35) 指標 (Geerts et al., 1991)。. 四、肝臟再生肝臟是哺乳動物體內少數具有再生能力的器官，當肝臟組織發生損傷或切除時，肝臟會進行再生作用，這是肝臟器官回應受傷最主要的一個反應。此過程是由於特殊的外部刺激所引起的補償反應，其中涉及許多基因表現的改變，如：生長因子的產生和型態架構有順序的變化。在此過程中，肝細胞會提供 mitogenic stimulin，促使肝臟內其他種類的細胞進行增生。在部分肝臟切除之後，肝細胞在 portal triads (periportal) 周圍的區域於 30 ~ 60 小時之間開始進行增生，其他的細胞則是在肝細胞增生 24 小時之後才陸續進入 DNA 合成。有許多因子在這個過程中扮演著重要的角色 (Michalopoulos & DeFrances, 1997)。不同於其他的再生組織，肝臟的再生不需依賴幹細胞或是先驅細胞。肝臟再生是藉由所有現存的肝臟成熟細胞一起增生來完成的，包含肝細胞、膽管上皮細胞、內皮細胞、庫氏細胞。在這些細胞中，肝細胞是最先增生的。肝臟再生的實驗中，其方式主要分為兩種，一種是由毒素引起損傷，例如：四氯化碳或酒精等；另ㄧ種則是利用肝臟部分切除的手術。. 24.

(36) 過去的研究發現，TNF-α 以及 IL-6 在肝臟一開始再生時扮演十分重要的角色 (Scotte et al., 1997)。在肝臟再生的過程中，庫氏細胞會產生 IL-10 來調控 TNF 的表現 (Rai et al., 1997)。當肝臟受到毒素刺激而損傷時，會促使肝臟修復，肝臟的修復情形關係到其存活與否。增生細胞核抗原 (Proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 是一個 DNA polymerase-δ 的輔助蛋白，在細胞週期 S-phase 時濃度最高，可利用其抗體來偵測細胞增生 (Connolly & Bogdanffy, 1993)。增生細胞核抗原 (Proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 亦稱 Cyclin，是一種與 DNA polymerase delta 有關的 nonhistone nuclear protein，存在增生細胞的整個細胞週期。PCNA 基因在增生期與靜止期細胞都會被轉錄；PCNA mRNA 只有蓄積在增生細胞，S 期量達最高 (Cardone et al., 2008)。利用其抗體對包埋固定的組織來偵測細胞增生的技術已被建立 (Connolly & Bogdanffy, 1993)。有文獻指出四氯化碳誘導肝損傷，PCNA 會大量的表現 (Jeong et al., 2001; Taniguchi et al., 2004)。. 五、四氯化碳肝臟損傷造成肝損傷的原因包括：化學性傷害如毒物、藥物濫用，B、C 型病毒引起之肝炎，非酒精性脂肪肝炎和酒精過量引起的酒精性脂肪. 25.

(37) 肝炎，這些原因都可能導致肝纖維化、肝硬化的發生。當肝臟受到損傷時，會產生發炎反應，剛開始較輕微的損傷，可以藉由身體的免疫系統或肝細胞再生而恢復；若傷害持續存在，發炎反應一直持續，肝臟會進ㄧ步發展成肝纖維化 (Friedman, 2000)。肝纖維化為一可逆性的過程，主要是細胞外間質沉積，此時停止對肝的傷害刺激，肝臟則能自行回復，所以肝纖維化也可以視為一種癒合的過程；但傷害一直持續，則會進ㄧ步轉變為肝硬化，此則為不可逆的過程，會產生粗大細胞外間質，聚集於肝細胞周圍，嚴重時會導致肝衰竭、肝癌甚至死亡 (Alcolado et al., 1997)。自由基及過氧化脂質對肝細胞的傷害以 CCl4 之化學藥物最為人所知。四氯化碳誘導肝損傷模式，此模式為動物模式中最被廣泛使用的方法。四氯化碳在工業上為脫脂劑及有機溶劑。在 1936 年的時候，已有人提出四氯化碳會誘導大鼠肝硬化的形成。藉由口服或是腹腔注射的給藥方式，應用於慢性或急性肝損傷的誘導模式。誘導初期或急性期，在組織學即可見明顯發炎及肝損傷現象；在 6 ~ 8 週後，組織會出現肝細胞壞死、變性，細胞失去界線融合，嚴重纖維化發生。四氯化碳肝毒性機轉主要是經由肝臟中之細胞色素 P450 (Cytochrome P-450) 中的 CYP2E1 將四氯化碳代謝為三氯甲烷自由基 (trichloromethyl) CCl3· 及 CCl3OO· ，進而形成脂質過氧化物 26.

(38) (LPO) 或與蛋白質結合，造成肝損傷。給予 CCl4 誘發肝損傷，會造成體內鈣離子運輸系統的破壞，最終致使細胞死亡 (Comporti, 1985)。當四氯化碳等傷害肝細胞時，庫氏細胞會活化ㄧ些發炎媒介物和細胞激素 (Luckey & Petersen, 2001; Muriel et al., 2001; Muriel & Escobar, 2003)。所以，庫氏細胞的活化被認為是四氯化碳引發肝損傷過程中的重要因素。Sipes 氏等人研究指出四氯化攤之所以造成肝損傷，可能與 kupffer cell 的活性有關 (Sipes et al., 1991)。四氯化碳的給予會誘導 kupffer cell 活化而產生大量的 ROS 對生物造成破壞。. 27.

(39) 第二章金線連糖苷對四氯化碳誘發小鼠肝損傷的保護作用. 前言. 病毒性肝炎、酗酒、自體免疫肝臟疾病，及膽汁淤積等原因，都會造成肝臟損傷發炎，促使肝纖維化發生，以修復受傷的肝細胞。當損傷移除，肝臟能夠復原；但若損傷持續，肝臟發炎的情形會持續，肝纖維化就會惡化成不可復原的肝硬化，甚至轉變成肝癌。為了避免肝硬化的形成，抑制肝臟發炎發展是必要的。本實驗室過去的研究顯示台灣金線連水萃物能減輕四氯化碳誘發的大鼠肝損傷 (Du et al., 2003)。由四氯化碳誘發的小鼠肝損傷及肝細胞的實驗追蹤出有效成分為金線連糖苷 (Kinsenoside) (Wu et al., 2007)。金線連糖苷為台灣金線連的主要成分 (Du et al., 2001)，解明金線連糖苷的保肝作用機轉有助於瞭解台灣金線連的保肝作用。. 材料與方法. ㄧ、金線連糖苷的製備本實驗所使用的金線連糖苷是本校藥物化學研究所吳金濱副教授所提供 (Wu et al., 2007)，純度為 80 %。. 二、藥品試劑編號 1. 名稱. 廠牌. Carbon Tetrachloride. Osaka 28.

(40) 2. Olive oil. Wako. 3. ALT ( GPT 分析套組 ). Roche,. 4. AST ( GOT 分析套組 ). Roche. 5. TBIL ( total bililubin 分析套組 ). Roche. 6. HCl. Sigma-Aldrich. 7. NaOH. Sigma-Aldrich. 8. CuSO4. Sigma-Aldrich. 9. H2O2. Roche. 10. p-dimethylaminobenzaldehyde. Sigma-Aldrich. 11. H2SO4. Fluka. 12. Enzyme-link immunosorbent assay kit. BioScience. ( TNF-α ) 13. Enzyme-link immunosorbent assay kit. BioScience. ( INF-γ ) 14. Enzyme-link immunosorbent assay kit. BioScience. ( IL-6 ) 15. Enzyme-link immunosorbent assay kit. BioScience. ( IL-10 ) 16. KCl. Wako. 17. PCNA ( proliferating cell nuclear antigen ). Santa cruz. antibody 18. NFκB p65 ( nuclear factor-κB p65 ). Cell Signalling. antibody 19. CD14. Santa cruz 29.

(41) 20. Alcohol. Panreac. 21. diamiobenzidine ( DAB ). Sigma-Aldrich. 23. trizol. Invitrogen. 24. chloroform. Showa. 25. isopropanol. Scharlau Chemie S.A.. 26. DEPC water. Biotecx. 27. MMLV RT buffer. GeneMark. 28. MMLV RT. GeneMark. 29. dNTP. GeneMark. 30. DTT. GeneMark. 31. oligo dt primer. GeneMark. 32. PCR Master Mix kit. GeneMark. 33. Gen-50 DNA Ladder. GeneMark. 34. 6X DNA Loading Dye. GeneMark. 35. Agarose I. Amresco. 36. TBE buffer. Amresco. 37. Ethidium Bromide ( EtBr ). Fermentas. 三、設備器材編號 1. 名稱. 廠牌. CoBAS MIRA PLUS. Roche. 生化自動析儀 2. TOA pH Meter HM-5S. TOA Electronics. 酸鹼度計 30.

(42) 3. PCR system 9700. A&B (Applied Biosystems). 4. KUBOTA 3500. KUBOTA. 5. Microplate Reader Model 550. Bio-RAD. 6. Electronic Balance AB104. Mettler toledo. 7. AlphaDigDoc. Alpha Innotech. 離心機. Coporation 8. Spectrophotometer. Hitachi. 四、動物實驗動物選用 25 ~ 30 g (5 週大) 的 ICR 小鼠，購自樂斯科生物科技公司。餵養環境維持 22 ± 3℃，相對溼度 55 ± 5 %，光照為 12 小時明亮 12 小時黑暗的環境，採自由飲水及攝食。小鼠分為四組，控制組 (n = 6)，及四氯化碳組。四氯化碳組每週管餵兩次 10 % 四氯化碳 (溶於橄欖油)，為期 3 週。四氯化碳組又分成 3 組，每組 9 隻，由投與四氯化碳開始，每天分別經口投與去離子水或金線連糖苷 (100、300 mg/kg body weight)，為期 3 週。投與體積為每 10 克體重給予 0.1 ml。. 五、肝功能試驗投藥期滿後，小鼠在乙醚麻醉下，以 1 ml 針筒由下腔靜脈採血。全血收集在微量離心管中，在室溫下以冷凍離心機每分鐘 4700 rpm 31.

(43) 離心 10 分鐘以分離出血漿。再以自動分析儀檢測天門冬胺酸轉氨酵素 (AST)、麩氨酸轉氨酵素 (ALT) 及總膽紅素 (Total bilirubin； TBIL)。. 六、Hydroxyproline 的測定肝臟 Hydroxyproline 含量測定的方法乃參考 Neuman and Logan (1950) 之方法。將肝臟組織秤取約 0.3 克左右，於 100℃ 烘箱中隔夜乾燥。將乾燥的肝臟組織秤重後放入試管中，加入 3 ml 的 6N HCl，在 100℃ 的烘箱中放置 16 小時以上，使其水解。肝臟組織充分水解後，便可放置室溫冷卻，取 1 ml 的水解液至微量離心管，以 10,000 rpm 離心 30 分鐘。取 1 ml 的上清液加入適量的 1N NaOH 中和，之後分別加入 1 ml 的 CuSO4 (0.01M)、NaOH (2.5N)、 H2O2 (6 %) 震盪後靜置反應五分鐘，之後再將試管放入 80℃ 的水浴鍋中，將過多的過氧化物去除。待冷卻後，再加入 2 ml 之 5 % p-dimethylaminobenzaldehyde 及 4 ml 的 3N H2SO4 ，之後再放入 70℃ 的水浴鍋中反應 16 分鐘使其呈色，以分光光度計於 540 nm 測量其吸光值，其單位表示為 μg/g tissue。. 七、細胞激素 TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10 之分析細胞激素的測定是利用酵素連結免疫吸附分析法 (enzyme-link 32.

(44) immunosorbent assay；ELISA) 來偵測。將肝臟組織秤取約 0.3 克左右，加入 3 ml 1.15 % 的 KCl，以均質機將肝臟打碎後，取 1ml 於微量離心管，以 3000 rpm, 4℃, 5 min 離心，之後取上清液及細胞激素標準液加入事先 coating 好且已 blocking 的 96 well plate 中，室溫放置 2 小時，之後以 Phosphate Buffered Saline Tween 20 (PBS-T) 清洗 3 ~ 5 次，再加入 detection antibody，室溫放置 1 小時，然後以 PBS-T 清洗 3 ~ 5 次，加入 Horse Radish peroxidase，室溫放置 30 分鐘，再以 PBS-T 清洗 3 ~ 5 次，加入 subatrate，室溫放置 15 分鐘，此時呈現藍色，最後加入 2N H2SO4，此時呈現黃色，以波長 450 nm 測其吸光值。. 八、肝臟病理切片評估取肝臟最大葉 1/3 以 10 % 福馬林固定，進行石蠟包埋及切片，再以蘇木青和伊紅染色法染色後，觀察肝臟之變性程度。肝臟切片經 proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 和 nuclear factor-κB p65 (NFκB p65) 以及 CD14 之免疫組織化學染色，可將肝細胞染成褐色，以此估算細胞之數目。其方法為將肝臟組織以 10 % 中性福馬林固定後，經過修整後置入石蠟包埋，切成 5 μm 切片經 xylene 脫蠟及依序以不同濃度之酒精脫水處理，以 10 mM sodium. 33.

(45) citrate buffer (pH 6.0) 煮沸處理 20 ~ 40 分鐘後靜置於室溫下 20 分鐘，之後將切片以 5 % 的 milk block 30 min，而後加入一級抗體 (1：500) 室塭培養 2 小時，以 PBS-T 清洗後，加入 3 % H2O2 去除內源性過氧化酶，反應 10 分鐘後，以 PBS-T 清洗，之後加入二級抗體室塭培養 30 分鐘，再利用免疫偵測套組以及 diamiobenzidine 呈色，最後以蘇木紫染色，脫水完成後封片。. 九、mRNA 表現分析 1. RNA 萃取取大約 0.1 g Tissue 於研缽中，磨碎後加到 1ml trizol 中，過 18G → 23G 針頭數次，將組織均質化，6400 rpm、10 min、4℃ 條件下離心，取離心後上清液，加入 0.2 ml chloroform votex 15 sec，於冰上靜置 3 分鐘，再以 12,700 rpm、15 min、4℃ 離心後，輕輕將上清液吸出 300 μl，加入 0.5 ml isopropanol，上下搖晃後，冰上靜置 10 min，於 12,700 rpm、10 min、4℃ 離心後，肉眼可見底部白色沉澱物，留 pellet，加 1 ml 75 % 酒精上下搖動，於 - 30℃ 放置 30 min，再以 10,000 rpm、5 min、4℃ 離心，倒掉酒精留 pellet，加入 Diethyl pyrocarbonate 水 60 μl 充分溶解，用波長 260 nm 測定吸光，換算 RNA 濃度。置於 - 80℃ 下儲存備用。. 34.

(46) 2. 反轉錄－聚合酶連鎖反應 ( Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR ) cDNA 的製備主要以 Moloney murine leukemia virus Reverse Transcriptase (MMLV RT) 進行 cDNA 合成，取 1 μg mRNA 加入 2.5 μl 10 × MMLV RT buffer, 0.6 μl MMLV RT, 5 μl dNTP, 2.5 μl 0.1 M DTT, 1 μl oligo dt primer，混合後置於 37℃，60 分鐘之後立即置於冰上，保存於 - 20℃。. 3. DNA 電泳分析 PCR 的部份是利用 PCR Master Mix kit 進行 specific DNA fragments amplification，反應所得的 PCR 產物以 2 % 洋菜膠於 0.5 × TBE buffer 電泳液，以 100 伏特的電壓進行電泳分離，再用影像分析軟體 (AlphaDigi Doc 1201) 進行分析。採用的 primer 序列如 Table 1。. 十、統計方法數據結果以平均值 (mean) ± 標準差 (standard deviation, SD) 表示，各組與對照組間的數據以 One-way ANOVA 方法分析，並進行 Dunnett test，以 p 值小於 0.05 表示在統計學上有顯著異差。. 35.

(47) 結果. ㄧ、對血清生化值的影響四氯化碳誘導三週後，小鼠犧牲採血，取血漿測試其 ALT、AST 活性以及 TBIL 濃度。四氯化碳組之 ALT 和 AST 值與控制組比較顯著上升。金線連糖苷低劑量與高劑量均能降低四氯化碳所提升的 ALT 和 AST 值 (Fig. 1和Fig. 2)。四氯化碳組的血漿 TBIL 值明顯高於控制組，金線連糖苷組雖有減少 TBIL 的趨勢但無統計上差異 (Fig. 3)。. 二、Hydroxyproline 含量的分析於四氯化碳誘導三週後，比較小鼠肝臟膠原蛋白之含量，結果顯示四氯化碳組比正常組高，金線連糖苷高劑量組的肝臟膠原蛋白含量較四氯化碳組顯著降低，低劑量組與四氯化碳組比較有降低之趨勢但無統計上之差異 (Fig. 4)。. 三、細胞激素的含量四氯化碳誘導三週後，小鼠犧牲，取肝臟均漿測試 TNF-α、 IFN-γ、IL-6 和 IL-10 濃度。四氯化碳組肝臟的 TNF-α、IFN-γ、IL-6 和 IL-10 度明顯較控制組高。金線連糖苷能降低四氯化碳所提升的 36.

(48) NF-α、IFN-γ、IL-6 和 IL-10 度 (Fig. 5 - 8)。. 四、病理切片的評估肝臟的損傷程度及型態觀察以經蘇木青和伊紅染色之肝臟切片進行判讀，四氯化碳組可見局部至廣泛之肝細胞空泡樣變性，金線連糖苷高、低劑量組均較四氯化碳組有顯著減輕變性之情形，其中又以高劑量組較為明顯 (Fig. 9)。染 PCNA 關察肝臟增生程度。結果顯示，控制組無增生情形，四氯化碳組明顯的有增生的情形。金線連糖苷的肝臟增生情形較較四氯化碳組明顯，且以高劑量組差異較大 (Fig. 10)。以經 p65 和 CD14 之免疫組織化學染色關察肝臟庫氏細胞活化的情形，結果顯示控制組組無庫氏細胞活化的表現，四氯化碳組明顯有 p65 和 CD14 的表現，即庫氏細胞被活化。金線連糖苷組 p65 和 CD14 的表現均較四氯化碳組輕 (Fig. 11)。. 五、RT-PCR 的結果以 RT-PCR 輔以電泳影像分析軟體來分析 α-SMA、CD14、iNOS 及 COX-2 mRNA 的表現量。四氯化碳組肝臟 α-SMA、CD14、iNOS 及 COX-2 mRNA 之表現量明顯較控制組高，分別為控制組 189 ％、 274 ％、174 ％和 200 ％。與四氯化碳組比較，金線連糖苷 (100 和 37.

(49) 300 mg/kg) 分別降低 α-SMA 和 CD14 mRNA 之表現 112 % 和 109 %， 152 % 和 150 % (Fig 12和13)。與四氯化碳組比較，金線連糖苷 (300 mg/kg) 分別降低 iNOS 和 COX-2 mRNA 之表現 93 % 和 81 %， 136 % 和 118 %. (Fig 14和15)。. 討論. 在本實驗中，以小鼠投與四氯化碳與金線連糖苷，探討金線連糖苷對 CCl4 所誘導的肝損傷是否有減輕的作用。結果發現金線連糖苷具劑量依存性減輕了四氯化碳所誘發的肝損傷。 AST、ALT 酵素大量存在於肝細胞中，當肝臟受到損傷 AST、 ALT 會釋出至血液中。血漿中的 AST、ALT 值常用來當作肝損傷的指標。其中 ALT 較具專一性，因 AST 除了在肝臟中含有外，心臟、腎臟、骨骼肌、腦部也都含有 (Sturgill & Lambert, 1997)。小鼠投與四氯化碳三週，其血漿中的 AST、ALT 明顯的高於控制組，顯示四氯化碳的確造成肝臟的損傷。而投與金線連糖苷的小鼠，血漿中的 AST、ALT 值明顯的比四氯化碳組低，並呈現劑量關係。在總膽紅素的部份，四氯化碳組比控制組高出許多，金線連糖苷雖無顯著使總膽紅素下降，但有降低總膽紅素的趨勢，顯示其肝臟功能的受損情形的確有改善。金線連糖苷減輕肝損傷的程度，在在肝臟病理檢切片檢 38.

(50) 察(蘇木青和伊紅染色)得到一致的結果。肝臟發炎會刺激膠原蛋白增生，促使纖維化的產生。膠原蛋白含有特別的氨基酸 hydroxyproline，肝臟中 hydroxyproline 的含量可反應膠原蛋白的含量，推知纖維化的程度 (Hanauske-Abel, 1996)。本實驗中，四氯化碳明顯的增加肝臟 hydroxyproline 含量，金線連糖苷減低四氯化碳所增加的 hydroxyproline 含量，顯示其具有減輕纖維化的作用。當肝臟受到傷害，肝細胞受損，發炎細胞及內皮細胞釋出發炎因子，庫氏細胞活化。庫氏細胞及肝細胞釋出 TGF-β1，刺激活化星狀細胞由靜止態轉變為活化態 (Bataller & Brenner, 2005)，活化態的星狀細胞會聚集，分泌細胞外間質 (Lee et al., 2001)。α-SMA 表現量為星狀細胞活化程度的主要指標 (Geerts et al., 1991)。本實驗中偵測了 α-SMA mRNA 表現量，發現四氯化碳明顯的促使 α-SMA mRNA 表現量增加，而金線連糖苷能減低其表現量。由此可知金線連糖苷能抑制星狀細胞活化，進而減少細胞外間質堆積，而減輕了纖維化的情形。四氯化碳是一個具有肝毒性的物質，它所造成的肝損傷主要是其所釋放的自由基刺激活化肝中的非實質細胞，例如：庫氏細胞，進而引發發炎反應。肝臟發炎會促使細胞激素釋放，包括 TNF-α、IFN-γ、 IL-6、IL-10 等。TNF-α 是調控 NFκB ㄧ重要因子，過去研究發現，. 39.

(51) 在四氯化碳誘導的發炎反應中，TNF-α 會大量表現，並促進 NFκB 的活化 (Reyes-Gordillo et al., 2007)。在發炎過程中，TNF-α 會刺激 IL-6 的產生 (Scotte et al., 1997; Zuinen et al., 2007)。在四氯化碳所造成的肝損傷中，IFN-γ 亦會上升，在 IFN-γ knockout 小鼠身上可以發現，由四氯化碳所誘導的損傷有減輕的現象 (Horn et al., 2000; Neubauer et al., 2008)。在本實驗也確認四氯化碳的確使得小鼠肝中的 TNF-α、IFN-γ、IL-6 含量明顯上升，而給予金線連糖苷的小鼠肝中 TNF-α、IFN-γ、IL-6 含量明顯減少。 IL-10 是一抗發炎因子，它可以抑制一些發炎相關的細胞激素合成，如：TNF-α、IL-6、IL-1 (Zuinen et al., 2007)。在急性試驗，大鼠口服四氯化碳後 12 和 24 小時，血中的 IL-10 和肝中的 IL-10 mRNA 表現明顯上升 (Zuinen et al., 2007)。有文獻指出，在給予四氯化碳誘導之下，大鼠肝臟的 IL-10 表現有明顯的上升 (Yu et al., 2004)。在本實驗，四氯化碳投予三週，小鼠肝臟 IL-10 有上升的情形，餵食金線連糖苷的小鼠肝臟 IL-10 的含量明顯下降。依據這些推測，四氯化碳誘發肝臟發炎，導致 IL-10 含量提升來抗發炎，金線連糖苷能抑制四氯化碳所誘導的肝臟發炎，因此 IL-10 含量提升較少。肝損傷的過程中會啟動肝臟再生、主要是為了修復受損的組織，. 40.

(52) 適度的再生可幫助肝臟功能的回復，增加存活 (Rao et al., 1997)。四氯化碳造成肝損傷，因此刺激肝臟再生，若肝臟損傷太嚴重，則肝臟再生能力會被減弱 (Rao et al., 1997)。PCNA 所染的是增生的細胞，因此 PCNA 的表現增強代表促進了肝臟再生作用 (Connolly & Bogdanffy, 1993)。PCNA 在四氯化碳組的肝組織表現明顯的增生，確認了四氯化碳造成肝損傷誘發肝臟再生。金線連糖苷的處理，小鼠肝臟 PCNA 的表現較四氯化碳組強，顯示金線連糖苷能促進肝臟細胞的增生。過去對台灣金線連的研究也有同樣的結果 (Shih et al., 2004)，庫氏細胞的活化被認為是四氯化碳引發肝損傷過程中的重要因素，引發肝臟受損的過程中，受損肝細胞會會釋出細胞激素引發庫氏細胞活化 (Sipes et al., 1991; Son et al., 2007)。四氯化碳誘導的肝損傷中，亦可發現 NFκB 的大量表現 (Son et al., 2007)。NFκB 主要由 p65/p50 所組成，NFκB 活化路徑有很多，其中 LPS 的路徑會透過 CD14 的結合，啟動訊息傳遞，CD14 位於庫氏細胞表面 (Zhao et al., 2008)。因此，肝臟庫氏細胞活化情形的觀察以經 p65 和 CD14 之免疫組織化學染色之肝臟切片進行判讀，從結果可知，四氯化碳促使庫氏細胞活化，而金線連糖苷則減輕其發炎活化的情形。另外 CD14 mRNA 表現也有同的結果。. 41.

(53) iNOS 和 COX-2 也是庫氏細胞活化所產生的發炎相關物質。在 iNOS 和 COX-2 mRNA 表現中可發現，四氯化碳明顯的促使. iNOS. 和 COX-2 mRNA 的表現，而給予金線連糖苷則減少其表現。由這些結果推測，金線連糖苷抑制了庫氏細胞的活化，降低發炎程度。. 42.

(54) Table 1. Oligonucleotide sequences used in RT-PCR mRNA. Sequence. Annealing. Cycle. Product size (bp). temperature (°C) α-SMA. F:CTGCTCTGCCTCTAGCACAC. 56. 40. 138. 58. 35. 375. 57. 30. 306. 55. 36. 274. 59. 30. 76. R:TTAAGGGTAGCACATGTCTG CD14. F:CCTAGTCGGATTCTATTCGGAGCC R:AACTTGGAGGGTCGGGAACTTG. iNOS. F:TGGGAATGGAGACTGTCCCAG R:GGGATCTGAATGTGATGTTTG. COX-2. F:ACACACTCTATCACTGGCACC R:TTCAGGGAGAAGCGTTTGC. GAPDH F:TGTGTCCGTCGTGGATCTGA R:CCTGCTTCACCACCTTCTTGA. 43.

(55) 3000. ###. ALT (U/L). 2500. *. 2000. 1500. ***. 1000. 500. 0. control. H 2O. 100. 300. (mg/kg BW). kinsenoside CCl4. Fig. 1. Effect of kinsenoside on the activity of plasma ALT in CCl4-treated mice. Values are means ± S.D. ( n = 6 - 9 ). ###P < 0.001 compared with control group. *P < 0.05, ***P < 0.001 compared with CCl4 + H2O group.. 44.

(56) 2500. ### 2000. AST (U/L). * 1500. **. 1000. 500. 0. control. H 2O. 100. 300. (mg/kg BW). kinsenoside CCl4. Fig. 2.. Effect of kinsenoside on the activity of plasma AST in CCl4-treated mice.. Values are means ± S.D. (n = 6 - 9). ###P < 0.001 compared with control group. *P < 0.05, **P < 0.01 compared with CCl4 + H2O group.. 45.

(57) 0.7. TBIL (mg/dl). 0.6. 0.5. 0.4. 0.3. 0.2. 0.1. 0.0. control. H2O. 100. 300. (mg/kg BW). kinsenoside CCl4. Fig. 3.. Effect of kinsenoside on the concentration of plasma total bilirubin in CCl4-treated mice.. Values are means ± S.D. ( n = 6 - 9 ).. 46.

(58) 800. Hydroxyproline (μg/g). # 600. * 400. 200. 0. control. H2O. 100. 300. (mg/kg BW). kinsenoside CCl4. Fig. 4. Effect of kinsenoside on the hepatic content of hydroxyproline in CCl4-treated mice. Values are means ± S.D. ( n = 6 - 9 ). #P < 0.05 compared with control group. *P < 0.05 compared with CCl4 + H2O group.. 47.

(59) TNFα (pg/mg protein). 18. ###. 16 14. **. 12. ***. 10 8 6 4 2 0. control. H2 O. 100. 300 kinsenoside CCl4. (mg/kg BW). Fig. 5. Effect of kinsenoside on the hepatic content of TNF-α in CCl4-treated mice. Values are means ± S.D. ( n = 6 - 9 ). ###P < 0.001 compared with control group. **P < 0.01, ***P < 0.001 compared with CCl4 + H2O group.. 48.

(60) IFNγ (pg/mg protein). 100. ###. 80. * 60. *** 40. 20. 0. control. H2O. 100. 300. (mg/kg BW). kinsenoside CCl4. Fig. 6. Effect of kinsenoside on the hepatic content of IFN-γ in CCl4-treated mice. Values are means ± S.D. ( n = 6 - 9 ). ###P < 0.001 compared with control group. *P < 0.05, ***P < 0.001 compared with CCl4 + H2O group.. 49.

(61) 18. ###. IL-6 (pg/mg protein). 16. ***. 14 12. ***. 10 8 6 4 2 0. control. H2O. 100. 300. (mg/kg BW). kinsenoside CCl4. Fig. 7. Effect of kinsenoside on the hepatic content of IL-6 in CCl4-treated mice. Values are means ± S.D. ( n = 6 - 9 ). ###P < 0.001 compared with control group. ***P < 0.001 compared with CCl4 + H2O group.. 50.

(62) IL-10 (pg/mg protein). 600. ###. 500. **. 400. ***. 300. 200. 100. 0. control. H2O. 100. 300. (mg/kg BW). kinsenoside CCl4. Fig. 8. Effect of kinsenoside on the hepatic content of IL-10 in CCl4-treated mice. Values are means ± S.D. ( n = 6 - 9 ). ###P < 0.001 compared with control group. **P < 0.01, ***P < 0.001 compared with CCl4 + H2O group.. 51.

(63) Fig. 9. Treatment with kinsenoside improved the histology of CCl4-treated mice liver. Hematoxylin and eosin staining of liver sections from: (A) control group ; (B) CCl4+ H2O group, showing gross necrosis, broad infiltration of lymphocytes around the central vein; (C, D) CCl4 + kinsenoside (100, 300 mg/kg BW) group, showing a reduction in gross necrosis, broad infiltration of lymphocytes around the central vein. (40X).. 52.

(64) Fig. 10 Localization of liver PCNA expression in CCl4-induced mice liver injury. Immunohistochemistry staining of liver sections from: (A) control mouse ; (B) CCl4-treated mouse; (C, D) CCl4 + kinsenoside (100 , 300 mg/kg BW) group. (100X).. 53.

(65) p65. CD14. Fig. 11 Localization of liver p65 and CD14 expressions in CCl4-induced mice liver injury. Immunohistochemistry staining of liver sections from: (A) control mouse ; (B) CCl4-treated mouse; (C, D) CCl4 + konsenoside (100 and 300 mg/kg BW). (100X).. 54.

(66) αSMA/GAPDH. Relative mRNA level (%). 250. ## 200. ***. 150. ***. 100. 50. 0. control. H2O. 100. 300 kinsenoside CCl4. (mg/kg BW). Fig. 12. RT-PCR analysis of α-SMA mRNA level in CCl4-treated mouse liver tissue. Values are means ± S.D. (n = 6 - 9). ##P < 0.01 compared with control group. ***P < 0.001 compared with CCl4 + H2O group.. 55.

(67) CD14/GAPDH. Relative mRNA level (%). 500. # 400. 300. 200. *. *. 100. 300. 100. 0. control. H2O. (mg/kg BW). kinsenoside CCl4. Fig. 13. RT-PCR analysis of CD14 mRNA level in CCl4-treated mouse liver tissue. Values are means ± S.D. (n = 6 - 9). #P < 0.05 compared with control group. *P < 0.05 compared with CCl4 + H2O group.. 56.

(68) iNOS/GAPDH. Relative mRNA level (%). 300. 250. 200. 150. *. 100. 50. 0. control. H2 O. 100. 300 kinsenoside CCl4. (mg/kg BW). Fig. 14. RT-PCR analysis of iNOS mRNA level in CCl4-treated mouse liver tissue. Values are means ± S.D. (n = 6 - 9). *P < 0.05 compared with CCl4 + H2O group.. 57.

(69) COX−2/GAPDH. 300. Relative mRNA level (%). #. 250. 200. *. 150. 100. 50. 0. control. H2O. 100. 300 kinsenoside CCl4. (mg/kg BW). Fig. 15. RT-PCR analysis of COX-2 mRNA level in CCl4-treated mouse liver tissue. Values are means ± S.D. (n = 6 - 9). #P < 0.05 compared with control group. *P < 0.05 compared with CCl4 + H2O group.. 58.

(70) 第三章金線連糖苷抑制脂多糖誘發巨噬細胞活化. 前言. 在前章的實驗，顯示金線連糖苷可能經由抑制庫氏細胞的活化而減輕四氯化碳引起的小鼠肝臟發炎。因此，本章實驗進一步使用具噬細胞 246.7，來探討金線連糖苷抑制 LPS 誘發巨噬細胞產生發炎物質 NO 的作用基轉。. 材料與方法. 一、藥品試劑編號 1. 名稱. 廠牌. Dulbecco’s modified Eagle’s medium. HyClone. ( DMEM ) 2. MTS assay. Promega. 3. lipopolysaccharides. Sigma-Aldrich. 4. Griess Reagent. Sigma-Aldrich. 5. 蛋白質萃取試劑. Intron. 6. Coomassie Blue dye. Sigma-Aldrich. 7. SDS. Amresco. 8. 40% Acrylamide. Amresco 59.