第三章 實驗結果與討論
3.3 類核黃素薄膜電極生化應用潛力探討
酵素固定是生化感測重要課題之一，目前多藉由avidin-biotin 或 金-硫鍵等修飾方式將所需酵素固定於偵測元表面。本實驗室研究發 現類核黃素可吸附蛋白質，具有作為分子膠的應用潛力。在本論文 中，我們嘗試藉由漫射式螢光光譜分析法，探討以類核黃素薄膜電極 定量分析蛋白質的可行性。首先我們在不同pH 環境下對 GOx 吸附 行為進行探討，實驗結果如圖3-12 所示。發現 pH ﹤5 時，GOx 的 吸附速率較快，且不會因pH 值不同而變化。推測其原因是 GOx 的 等電點約為4，在 pH 大於 5 的環境中，蛋白質表面多帶負電荷，故 可與TC 修飾膜相互吸引而吸附於其表面。有鑒於此，本實驗便以去 離子水(pH ≈ 5)作為載體，逐量將葡萄糖氧化脢(簡稱 GOx)送經 TC 修
飾膜表面，再分析TC 的螢光強度，所得實驗結果如圖 3-13 所示。由 於所降低的螢光強度不會回復至原有狀態，我們推測該現象應是由蛋 白質吸附所造成，而非因能量轉移所致。實驗也顯示：若改注入儲鐵 蛋白(Ferritin)或鮭魚精蛋白(Salmon testes)，螢光變化並不顯著(圖 3-14、3-15)。造成此一差異的原因，推測可能是蛋白質的等電點不盡 相同所致。根據文獻報導：類核黃素的等電點約為 4.4(25)，GOx 的等 電點約為4(26)，二者得以靜電引力吸引而結合。反觀儲鐵蛋白的等電 點約為5~8(27)，而鮭魚卵蛋白 DNA 約為 10(28)，相較之下，二者較難
以靜電引力吸引而吸附於TC 薄膜表面。
0 100 200 300 400 500 1.0
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
1.6 pH 8
pH 7 pH 6 pH 5 pH 4 pH 3
Time (sec)
Intensity (a.u.)
圖3-12 在不同 pH 值環境中，GOx 吸附量的變化
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec) (D)
圖3-13 逐量將 GOx 注入 TC 氧化聚合修飾電極時所測得的漫射式 螢光強度( λex：570 nm；λem：621 nm ) 與 GOx 濃度關係圖，其中：
(A) 400 mg/mL；(B) 600 mg/mL；(C) 800 mg/mL；(D) 1.0 g/mL。箭 頭所指為注射點，注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
(A)
圖3-14 儲鐵蛋白注入 TC 氧化聚合薄膜修飾電極時所測得的漫射式 螢光強度( λex：570 nm；λem：621 nm )與儲鐵蛋白濃度之關係圖，其 中：(A) 4.25 mg/mL；(B) 8.5 mg/mL；(C)17 mg/mL；(D) 25.5mg /mL。
注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。
Intensity (a.u.)
Time (sec) mg/mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。
我們也以AFM (conductive mode) 對前述 GOx 吸附現象進行探 討。實驗結果如圖3-16，顯示經流體注射分析實驗後的電極若以導電 模式AFM 測量其 I-V 曲線，其與實驗前的 ITO|TC 電極以及空白 ITO 電極存在不同結果，其中僅有空白 ITO 電極的 I-V 曲線遵守歐姆定 律，而ITO|TC 與吸附有 GOx 的電極(簡稱 ITO|TC|GOx)則呈現非線 性變化。若進一步在± 0.5 V 處觀察三者電流差異，電流比約為 104： 102：1。有鑒於此，我們對各電極施加偏壓 0.5 V，再進行表面影像 分析，所得的結果如圖3-17 所示。我們發現 GOx 會吸附於 TC 微粒 上，與前述實驗結論頗為一致。我們也以AFM 觀察注入儲鐵蛋白與 鮭魚卵蛋白後之電極表面，我們發現它們也會吸附於ITO|TC 表面，
只是吸附量較低，結果如附錄6-4~6-5 所示。
1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -20
-10 0 10 20
ITO ITO|TC ITO|TC|GOx
I/ nA
Bias (V)
圖3-16 以鍍有白金的 AFM 導電探針對 ITO、ITO|TC 與 ITO|TC|GOx 電極進行分析所測得之I-V 曲線。
250 nm (A)
250 nm 250 nm 250 nm
250 nm (A) 250 nm250 nm250 nm (B)(B)(B)
250 nm (C)(C)(C)
250 nm
250 nm 250 nm250 nm250 nm (D)(D)(D)
圖3-17 導電模式 AFM 影像分析，其中 (A)為 ITO；(B)為 ITO|TC；
(C)為 ITO|TC|GOx；(D)為(C)再注射一次 GOx。掃描速率：1 Hz，偏 壓︰0.5 V (探針接地)。
(C) (A)
(A) (B)
我們也對GOx 與 TC 間的吸引力進行探討。實驗結果(圖 3-18)顯 示：AFM 探針與 ITO|TC|GOx 表面間的接觸力(Fappl)若小於 0.8 μN，
電極所顯現的I-V 曲線幾乎不變。但當 Fappl大於 0.8 μN 時，電極的 I-V 曲線會開始改變。當 Fappl接近1.2 μN 時，I-V 曲線呈現出 ITO|TC 的特徵。若 Fappl增加至3.1 μΝ，則 I-V 曲線會再褪變成類似空白 ITO 的特徵。根據這些變化，我們推論：當GOx 流經於 ITO|TC 表面時，
GOx 會黏附於 TC 上方而非黏附在空白 ITO 表面。此外，又因為 Fappl
> 1.2 μN 時，ITO|TC|GOx 表面出現 ITO|TC 的特徵，我們因此推論：
GOx 與 TC 間的引力強度應介於 0.8~1.2 μΝ之間，此一假設也證實 TC 是一具應用潛力的分子膠。
1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0
-20 -10 0 10 20
(E) (D) (C)
(B)
I/ nA
Bias/ V
(A)
圖3-18 以 Pt-coated AFM 探針所測得之 I-V 曲線，其中探針與 ITO|TC|GOx 電極間的接觸力為：(A) 480；(B) 850；(C) 1160；（D）
我們也藉由定時電流法(Chronoamperometry)量測蛋白質流經 ITO|TC 電極時對 TC 的氧化還原峰所造成的干擾。實驗結果顯示：電 流變化與電位有關，也會隨GOx 注射入而變化，如圖 3-19 所示。但 若與漫射式螢光光譜分析結果相比較，所得結果頗為吻合，惟二者差 異在電流變化幅度較小。由此可知，漫射式螢光光譜分析法對蛋白質 分析而言是一靈敏的分析方法。
圖3-19 以氧化聚合法 (30 圈) 所得的 ITO|TC 電極在 (A) 0.2 V；(B) 0.1 V；(C) 0 V；(D) -0.1 V；(E) - 0.2 V 與(F) -0.3 V 下所測得的電流 以及即時漫射式螢光強度( λex：570 nm；λem：621 nm，插圖) 與時間 之關係圖。GOx 濃度：400 mg/mL，注射體積：20 μL，流速：0.25
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
0 100 200 300 400 500 600
Time (sec)
(A)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
為證實TC 可吸附蛋白質，我們改以溶液態 TC 代替 TC 膜進行實
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
圖3-20 TC (10-5 M) 隨流洗液以 (A) 0.5；(B) 1；(C) 2.5；與(D) 5 mL/min 不等流速流經空白 ITO 電極表面時注入 20 μL GOx (0.4 g/mL) 所得之漫射式螢光光譜圖 (λex：570 nm；λem：621 nm)。
為進一步了解 GOx 在 TC 修飾電極表面的吸附現象，我們改將 TC 修飾電極置於一定濃度的GOx 溶液中進行動態分析，實驗結果如圖 3-21 所示，其中電極所發出的螢光會隨時間呈指數函數遞減（紅色點 線）。假設 TC 被 GOx 吸附後成為 GOx-TC：
GOx + TC ---> GOx-TC (式 3-5) 則電極上TC site 的數目(nTC)會因被 GOx 佔據而遞減，其變化量便可 表示為：
-dnTC/dt = k[GOx] nTC (式 3-6) -dnTC/nTC = k[GOx]dt (式 3-7) 若對式3-7 積分，則可得到下式：
∫t0 dnTC/nTC = -∫t0 k[GOx]dt ln(dnTC/nTC t=0) = -k[GOx]t
nTC = nTC t=0 × exp (-k[GOx]t) (式3-8)
假設TC的螢光強度F與nTC成正比，則式3-8可改寫為：
F/Ft=0 = exp (-k[GOx]t) (式3-9) 根據式3-9，螢光下架的初速率則為：
dF/dt (t = 0) = - k[GOx] (式3-10) 下降速率會與[GOx]的一次方成正比。根據式3-10，我們進行數據模
0 20 40 60 80 100
Intensity (a.u.)
Time (sec) 0 20 40 60 80 100
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
0 20 40 60 80 100
Intensity (a.u.)
Time (sec)
圖3-21 在一定濃度的 GOx 條件下，GOx 吸附於 TC 修飾電極表面的 動態螢光分析，其中[GOx]：(A) 0；(B) 400；(C) 600；(D) 800；(E) 1000 mg/mL，紅色者為模擬數據。
400 500 600 700 800 900 1000 -0.030
-0.025 -0.020 -0.015 -0.010 -0.005
dF/dt (t = 0)
[GOx]/ mg/mL
圖3-22 dF/dt (t = 0)與[GOx]之關係圖。
我們也對TB 修飾電極進行比較分析。實驗結果顯示以氧化聚合 或偶氮化方式製備而成的薄膜電極，其螢光差異性不大，但 TB 氧化 聚合膜在電極上較不均勻，故實驗誤差較大(附錄 6-1)，因此我們主 要以偶氮化還原法製備的TB 修飾電極 (修飾 30 圈) 對蛋白質進行分 析，所得結果如圖3-23 所示。我們發現注入葡萄糖氧化脢、儲鐵蛋 白或是鮭魚精蛋白，薄膜所產生的螢光強度並無減弱。為了解釋此一 現象，我們也利用conductive mode AFM 進行探討，結果顯示蛋白質 可吸附於電極表面，只是數量較低(附錄 6-6~6-8 )。有鑒於此，我們 認為蛋白質無法引起TB 膜的螢光顯著變化之原因，可能是蛋白質吸 附不均或是TB 修飾膜較薄之故。
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
其中葡萄糖氧化脢濃度：(i) 400、(ii) 600、(iii) 800 與(iv) 1000 mg/mL；
儲鐵蛋白濃度：(A) 4.25、(B) 8.5、(C)17、與(D) 25.5 mg /mL；鮭魚 精蛋白濃度：(A) 10、(B) 20、(C) 30 與(D) 40 mg/mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。
我們也對MB 修飾電極進行探討，所得結果如圖 3-24 所示。可能 是MB 不含一級胺基之故，難以氧化聚合或偶氮化還原法製備電極，
導致螢光強度極弱。實驗結果顯示：葡萄糖氧化脢、儲鐵蛋白或鮭魚 精蛋白注入MB 薄膜電極時，電極上所顯現的螢光沒有明顯變化。對 此，我們同樣以導電式AFM 觀測 ITO|MB 薄膜電極的表面，我們發 現蛋白質可吸附於MB，或許是因 MB 粒子較少，難以產生明顯螢光 變化 (附錄 6-9~6-11)。
根據上述分析，我們發現以氧化聚合方式製備出的ITO|TC 薄膜 電極吸附蛋白質的效果最好，其中又以葡萄糖氧化脢的吸附效果最 佳。
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
(i) (ii) (iii) (iv)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
(iii) 800 與(iv) 1000 mg/mL；儲鐵蛋白(i) 4.25、(ii) 8.5、(iii)17 與(iv) 25.5mg/mL；鮭魚精蛋白：(i) 10、(ii) 20、(iii) 30 與(iv) 40 mg/mL。
注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。
3.4 TC 薄膜螢光放射探討
有鑒於固定態TC 受到可見光激發時可顯現螢光，我們也對其本性 進行探討。紫外光-可見光吸收光譜分析顯示：溶液態 TC 的特徵吸收 峰(λabs：590 nm)的吸收度會隨還原劑如維生素 C (Ascorbic acid)的添
加而降低，同時也會導致其螢光隨之下降。反觀若改添加氧化劑如 H2O2，則其變化不甚明顯，如圖3-25~3-28 所示。若進一步以螢光強 度對吸收度作圖，二者存在線性關係，如圖3-29 所示。根據這些結 果，我們推論氧化態TC 是其螢光的主要發射元。根據類似分析，我 們也對TC 氧化聚合膜修飾電極進行探討，所得結果與溶液態結果相 似，如圖3-30~圖 3-34 所示。我們也改以其他還原劑如 Na2S2O3與 NADH，以及以 Na2S2O8與NAD+代替過氧化氫進行實驗，所得結果 與添加Ascorbic acid 與 H 2O2相似(附錄 6-12 ~ 6-27)。此外，我們也 嘗試在添加Ascorbic acid 後，逐量添加 H 2O2，探討TC 膜的可逆性，
實驗結果如圖3-35 所示，我們發現添加 Ascorbic acid 後若再加入 H
2O2，則 TC 膜的螢光會再上升，雖然無法百分之百回復，但可達百分 之八十。由此可知，氧化態TC 應是 TC 產生螢光的主要發光元。
400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
(A) (a)
[Ascorbic acid] (mM)
Absorbance
(B)
圖3-25 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 所測得之 紫外光-可見光吸收光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.498；(c) 0.664；(d) 0.83；(e) 0.996；(f) 1.328；(g) 1.494；(h) 3.125；
與(i) 4.545 mM。 (B)為吸收度 (λabs：590 nm) 與 Ascorbic acid 濃度
580 600 620 640 660 680 700 0.0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 (A)
(i)
In ten sity (a.u.)
Wavelength (nm)
(a)
0 1 2 3 4 5
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 (B)
[Ascorbic acid] (mM)
Intensi ty (a.u.)
圖3-26 (A) TC (10-5M) 在水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 測得之螢 光光光譜圖，其中Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.498；(c) 0.664；
(d) 0.83；(e) 0.996；(f) 1.328；(g) 1.494；(h) 3.125；(i) 4.545 mM。(B) 為螢光強度與Ascorbic acid 濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem： 621 nm。
400 500 600 700 800 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 (A)
(j) (a)
Ab so rb an ce
Wavelength (nm)
0 50 100 150 200 250 300 0.0
0.1 0.2 0.3 0.4
(B)
[H 2 O 2 ] (mM)
Absorba nce
圖3-27 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 H2O2 所測得之紫外光-可見光吸收光譜圖，其中H2O2濃度為(a) 0；(b) 20；(c) 40；(d)60；(e) 80；(f) 100；(g) 120；(h) 140；(i)160 (j) 300 mM。(B)為吸收度 (λabs： 590 nm) 與 H2O2濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem：621 nm。
580 600 620 640 660 680 700
In te ns ity (a. u .)
Wavelength (nm)
0 50 100 150 200 250 300
Intensity (a.u.)
[H2O2 ] (mM)
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.1
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.34 0.35 0.36 0.37 0.38 0.39 0.760
0.765 0.770 0.775 0.780 0.785
Intensity (a.u.)
Absorbance
Int ensit y (a .u.)
Absorbance
圖3-29 TC (10-5M) 在水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 與添加 H2O2
(插圖)測得之螢光強度( λex：570 nm)與特徵吸收峰( λem：621 nm)吸收 度之關係。
400 500 600 700 800 0.0
0.1 0.2 0.3
(A)
Absor bance
Wavelength (nm)
(a) (h)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0.05
0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
[Ascorbic acid] (mM)
Absorbance
(B)
圖3-30 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 Ascorbic acid 測得之紫 外光-可見光吸收光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為(a) 0；(b) 0.498；
(c) 0.664；(d)0.83；(e)0.996；(f) 1.328；(g) 1.494 與(h) 3.125 mM。(B) 為吸收度 (λabs：590 nm) 與 Ascorbic acid 濃度間的關係。
580 600 620 640 660 680 700
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
(a)
[Ascorbic acid] (mM)
Intensity (a.u.)
(B)
圖3-31 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 Ascorbic acid 測得之漫 射式螢光光譜圖；其中Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.498；(c) 0.664；(d)0.83；(e)0.996；(f) 1.328；(g) 1.494 與(h) 3.125 mM。(B) 為螢光強度與Ascorbic acid 濃度間的關係﹔其中 λex：570 nm；λem：
400 500 600 700 800 0.00
0.05 0.10 0.15 (A)
Absorbance
Wavelength (nm)
0 50 100 150 200 250 300 0.147
0.148 0.149 0.150 0.151 0.152 0.153 0.154 0.155 0.156 0.157
[H2O2 ] (mM)
Absorbance
(B)
圖3-32 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 H2O2測得之紫外光-可 見光吸收光譜圖，其中H2O2濃度為(a) 0；(b) 20；(c) 40；(d)60；(e)80；
(f) 100；(g) 120；(h) 140；(i)160 與(j) 300 mM。(B)為吸收度 (λabs： 590 nm) 與 H2O2濃度間的關係。
580 600 620 640 660 680 700
In te nsi ty (a. u .)
Wavelength (nm)
0 20 40 60 80 100120140160180200 0.33
Intensity (a.u.)
圖3-33 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 H2O2測得之漫射式螢 光光譜圖，其中 H2O2濃度為(a) 0；(b) 20；(c) 40；(d)60；(e)80；(f) 100；
(g) 120；(h) 140；(i) 160 與(j) 300 mM。(B)為螢光強度與 H2O2濃度 的關係。；其中λex：570 nm；λem：621 nm。
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.44
0.48 0.52 0.56 0.60 0.64
0.148 0.150 0.152 0.154 0.156 0.33
0.34 0.35 0.36 0.37 0.38
Intensity (a.u.)
Absorbance
Intensity (a.u.)
Absorbance
圖3-34 TC 薄膜在水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 與添加 H2O2 (插圖) 測得之螢光強度 ( λem：621 nm) 與特徵吸收峰 ( λem ：590 nm) 吸收 度之關係。
580 600 620 640 660 680 700 0.0
[Ascorbic acid] (mM)
Intensity (a.u.)
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
580 600 620 640 660 680 700 0.0
Intensity (a.u.)
Intensity (a .u.)
Wacelength (nm)
圖3-35 TC 薄膜 (氧化聚合 10 圈)逐量添加 Ascorbic acid(上圖)後，再 逐量添加H2O2(下)所得之漫射式螢光光譜圖；插圖為螢光強度對濃度 之關係，其中λex：570 nm；λem：621 nm。
根據上述實驗結果，我們也嘗試利用電化學技巧對TC 薄膜電極 施加電壓，探討其是否也具有與添加還原劑與氧化劑同樣的效果，所 得結果如圖3-36 所示。我們發現施加負電壓時，TC 膜的特徵吸收峰 吸收度與螢光強度均隨電壓變負而下降，如圖3-37 所示，與前述添 加還原劑的效應頗為一致。但若進一步與還原劑所得的效應進行比
根據上述實驗結果，我們也嘗試利用電化學技巧對TC 薄膜電極 施加電壓，探討其是否也具有與添加還原劑與氧化劑同樣的效果，所 得結果如圖3-36 所示。我們發現施加負電壓時，TC 膜的特徵吸收峰 吸收度與螢光強度均隨電壓變負而下降，如圖3-37 所示，與前述添 加還原劑的效應頗為一致。但若進一步與還原劑所得的效應進行比