類核黃素修飾電極分析與應用:漫射式螢光光譜分析

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文. 指導教授. 王忠茂. 博士. 類核黃素修飾電極分析與應用:漫射式螢光光譜分析. 研究生. 邱柏豪. 中華民國一百零一年六月.

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(3) 目錄圖目錄-----------------------------------------------------------------------------I 中文摘要-----------------------------------------------------------------------XV 英文摘要----------------------------------------------------------------------XVI 第一章緒論--------------------------------------------------------------------1 1.1. 電化學聚合薄膜--------------------------------------------------1. 1.2 電化學聚合方法--------------------------------------------------2 1.3. 漫射式光譜分析法-----------------------------------------------4. 1.4. 流動式注入分析法-----------------------------------------------6. 第二章實驗--------------------------------------------------------------------8 2.1. 化學藥品-----------------------------------------------------------8. 2.2. 實驗設備----------------------------------------------------------10. 2.3. 類核黃素修飾電極：前處理與製備--------------------------12. 2.4. FIA 操作流程-----------------------------------------------------13. 第三章實驗結果與討論--------------------------------------------------15 3.1 ITO 表面修飾類核黃素酵素電極螢光光譜分析----------15 3.2 類核黃素修飾電極之膜厚與螢光分析----------------------23 3.3 類核黃素薄膜電極生化應用潛力探討----------------------30 3.4. TC 薄膜螢光放射探討------------------------------------------48.

(4) 3.5 pH 值對 TC 薄膜電極螢光放射之影響----------------------65 3.6 葡萄糖感測-------------------------------------------------------69. 第四章結論-------------------------------------------------------------------74 第五章參考文獻------------------------------------------------------------75 第六章附錄-------------------------------------------------------------------77.

(5) 圖目錄圖 1-1 Thionine 氧化聚合示意圖。......................................................2 圖 1-2. Thionine 經偶氮化還原法吸附於 ITO 電極表面示意圖。......3. 圖 1-3 光纖示意圖，其中黑色、紅色箭頭分別為光纖運輸激發光源與接收漫射光行進之方向。 ........................................................................4 圖 1-4 漫射式光譜分析示意圖。 ...........................................................5 圖 1-5 FIA 操作示意圖。..........................................................................6 圖 3-1 三種常見類核黃素。 .................................................................15 圖 3-2 TC、TB 與 MB 在水溶液中(10 μM)所測得之激發與螢光放射光譜圖。...................................................................................................17 圖 3-3. TC、TB 與 MB (10 μM) 經不同掃描圈數氧化後所得漫射式. 螢光光譜圖與掃瞄圈數之關係。 ..........................................................19 圖 3-4. TC、TB 與 MB (10 μM) 在偶氮還原修飾中經不同圈數還原. 後，電極所測得的漫射式螢光強度與掃瞄圈數之關係。 ..................20 圖 3-5. TC、TB 與 MB (10 μM) 在電位 -0.4~1.2 V 間連續掃描 30. 圈後再置於乾淨 KCL 溶液中所得之 CV 圖譜，掃描速率：0.02 V/s。 ...................................................................................................................21 圖 3-6. TC、TB 與 MB (10 μM) 在電位 0 ~ -0.6 V 間連續掃描 30 圈. 後再置於乾淨 KCL 溶液中所得之 CV 圖譜，掃描速率：0.02 V/s。 ...................................................................................................................22 I.

(6) 圖 3-7 以氧化聚合法掃描 5 圈後所得的 ITO|TC 修飾電極表面，經刮除法刮除一定面積 (1 ×0.5 μm2 ) 後，所得影像之俯視圖 (上) 與剖面圖 (下)，其中掃描速率為 0.5 Hz。 ..................................................23 圖 3-8 以氧化聚合法所得 TC、TB 與 MB 聚合膜刮除數次後所得深度與刮除次數之關係，其中接觸力︰0.4 N，刮除尺寸：1×0.5 μ m2 ；掃描速率：2 Hz。...................................................................................25 圖 3-9. TC、TB 與 MB 氧化聚合膜之漫射式螢光光譜與膜厚關係；. 插圖中實線為模擬數據：F (TC) = 1.45×[1-exp(-x)]；F (TB) = 1.35×[1-exp(-x)]。 ...................................................................................26 圖 3-10. TC、TB 與 MB 偶氮化修飾膜之漫射式螢光光譜圖與膜厚之. 關係；插圖中實線為模擬數據：F (TC) = 1.45×[1-exp(-x)]；F (TB) = 1.35×[1-exp(-x)]。 ...................................................................................27 圖 3-11 TC 膜厚分析示意圖。 ..........................................................29 圖 3-12. 在不同 pH 值環境中，GOx 吸附量的變化。 ......................32. 圖 3-13. 逐量將 GOx 注入 TC 氧化聚合修飾電極時所測得的漫射式. 螢光強度(λex：570 nm；λem：621 nm ) 與 GOx 濃度關係圖，其中： (A) 400 mg/mL；(B) 600 mg/mL；(C) 800 mg/mL；(D) 1.0 g/mL。箭頭所指為注射點，注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。 ...........33 圖 3-14 儲鐵蛋白注入 TC 氧化聚合薄膜修飾電極時所測得的漫射式. II.

(7) 螢光強度(λex：570 nm；λem：621 nm )與儲鐵蛋白濃度之關係圖，其中：(A) 4.25 mg/mL；(B) 8.5 mg/mL；(C)17 mg/mL；(D) 25.5mg /mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。.................................34 圖 3-15 鮭魚精蛋白 DNA 注入 TC 氧化聚合薄膜修飾電極時所測得的漫射式螢光強度(λex：570 nm；λem：621 nm)與鮭魚精蛋白濃度之關係圖，其中：(A) 10 mg/mL；(B) 20 mg/mL；(C) 30 mg/mL；(D) 40 mg/mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。............................34 圖 3-16 以鍍有白金的 AFM 導電探針對 ITO、ITO|TC 與 ITO|TC|GOx 電極進行分析所測得之 I-V 曲線。.......................................................36 圖 3-17 導電模式 AFM 影像分析，其中 (A)為 ITO；(B)為 ITO|TC； (C)為 ITO|TC|GOx；(D)為(C)再注射一次 GOx。掃描速率：1 Hz，偏壓︰0.5 V (探針接地)。 ..........................................................................36 圖 3-18 以 Pt-coated AFM 探針所測得之 I-V 曲線，其中探針與 ITO|TC|GOx 電極間的接觸力為：(A) 480；(B) 850；(C) 1160；（D） 3130；（E）3350 nN。 ............................................................................37 圖 3-19 以氧化聚合法 (30 圈) 所得的 ITO|TC 電極在 (A) 0.2 V；(B) 0.1 V；(C) 0 V；(D) -0.1 V；(E) - 0.2 V 與(F) -0.3 V 下所測得的電流以及即時漫射式螢光強度(λex：570 nm；λem：621 nm，插圖) 與時間之關係圖。GOx 濃度：400 mg/mL，注射體積：20 μL，流速：0.25. III.

(8) mL/min。..................................................................................................39 圖 3-20. TC (10-5 M) 隨流洗液以 (A) 0.5；(B) 1；(C) 2.5；與(D) 5. mL/min 不等流速流經空白 ITO 電極表面時注入 20 μL GOx (0.4 g/mL) 所得之漫射式螢光光譜圖 (λex：570 nm；λem：621 nm)。............40 圖 3-21 在一定濃度的 GOx 條件下，GOx 吸附於 TC 修飾電極表面的動態螢光分析，其中[GOx]：(A) 0；(B) 400；(C) 600；(D) 800；(E) 1000 mg/mL，紅色者為模擬數據。...............................................................42 圖 3-22. dF/dt (t = 0)與[GOx]之關係圖。 ............................................43. 圖 3-23. TB 修飾電極注入葡萄糖氧化脢(A)、儲鐵蛋白(B) 與鮭魚精. 蛋白(C) 時所測得的漫射式螢光強度 (λex：623 nm；λem：672 nm)，其中葡萄糖氧化脢濃度：(i) 400、(ii) 600、(iii) 800 與(iv) 1000 mg/mL；儲鐵蛋白濃度：(A) 4.25、(B) 8.5、(C)17、與(D) 25.5 mg /mL；鮭魚精蛋白濃度：(A) 10、(B) 20、(C) 30 與(D) 40 mg/mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。.....................................................................45 圖 3-24. MB 氧化聚合薄膜修飾電極注入 (A)葡萄糖氧化脢；(B)儲鐵. 蛋白；(C)鮭魚精蛋白；時所測得的漫射式螢光強度(λex ：671 nm； λem ：703 nm) 與濃度之關係圖，其中葡萄糖氧化脢：(i) 400、(ii) 600、(iii) 800 與(iv) 1000 mg/mL；儲鐵蛋白(i) 4.25、(ii) 8.5、(iii)17 與(iv) 25.5mg/mL；鮭魚精蛋白：(i) 10、(ii) 20、(iii) 30 與(iv) 40. IV.

(9) mg/mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。............................47 圖 3-25 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 所測得之紫外光-可見光吸收光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.498；(c) 0.664；(d) 0.83；(e) 0.996；(f) 1.328；(g) 1.494；(h) 3.125；與(i) 4.545 mM。 (B)為吸收度 (λabs：590 nm) 與 Ascorbic acid 濃度的關係。...................................................................................................49 圖 3-26 (A) TC (10-5 M) 在水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 測得之螢光光光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.498；(c) 0.664； (d) 0.83；(e) 0.996；(f) 1.328；(g) 1.494；(h) 3.125；(i) 4.545 mM。(B) 為螢光強度與 Ascorbic acid 濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem： 621 nm。 ..................................................................................................50 圖 3-27 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 H2O2 所測得之紫外光可見光吸收光譜圖，其中 H2O2 濃度為(a) 0；(b) 20；(c) 40；(d)60；(e) 80；(f) 100；(g) 120；(h) 140；(i)160 (j) 300 mM。(B)為吸收度 (λabs： 590 nm) 與 H2O2 濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem：621 nm。 ...................................................................................................................51 圖 3-28. (A) TC (10-5M) 水溶液中逐量添加 H2O2 測得之漫射式螢光. 光譜圖，其中 H2O2 濃度為 (a) 0； (b)20；(c) 40； (d)60； (e)80；(f) 100；(g) 120；(h) 140；(i)160；(j) 300 mM。(B)為螢光強度與 H2O2 濃度間的關係﹔；其中λex：570 nm；λem：621 nm。 ....................52 V.

(10) 圖 3-29. TC (10-5M) 在水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 與添加 H2O2. (插圖)測得之螢光強度(λex：570 nm)與特徵吸收峰(λem：621 nm)吸收度之關係。...........................................................................................53 圖 3-30. (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 Ascorbic acid 測得之. 紫外光-可見光吸收光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為(a) 0；(b) 0.498； (c) 0.664；(d) 0.83；(e)0.996；(f) 1.328；(g) 1.494 與(h) 3.125 mM。(B) 為吸收度 (λabs：590 nm) 與 Ascorbic acid 濃度間的關係。............54 圖 3-31. (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 Ascorbic acid 測得之. 漫射式螢光光譜圖；其中 Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.498；(c) 0.664；(d)0.83；(e)0.996；(f) 1.328；(g) 1.494 與(h) 3.125 mM。(B) 為螢光強度與 Ascorbic acid 濃度間的關係﹔其中 λex：570 nm；λ em：621. nm。 ...........................................................................................55. 圖 3-32. (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 H2O2 測得之紫外光-. 可見光吸收光譜圖，其中 H2O2 濃度為(a) 0；(b) 20；(c) 40；(d)60； (e)80；(f) 100；(g) 120；(h) 140；(i)160 與(j) 300 mM。(B)為吸收度 (λ abs：590. nm) 與 H2O2 濃度間的關係。 .................................................56. 圖 3-33 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 H2O2 測得之漫射式螢光光譜圖，其中 H2O2 濃度為(a) 0；(b) 20；(c) 40；(d)60；(e)80；(f) 100； (g) 120；(h) 140；(i) 160 與(j) 300 mM。(B)為螢光強度與 H2O2 濃度. VI.

(11) 的關係。；其中λex：570 nm；λem：621 nm。 ................................57 圖 3-34. TC 薄膜在水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 與添加 H2O2 (插. 圖)測得之螢光強度 (λem：621 nm) 與特徵吸收峰 (λem ：590 nm) 吸收度之關係。 ......................................................................................58 圖 3-35. TC 薄膜 (氧化聚合 10 圈)逐量添加 Ascorbic acid(上圖)後，. 再逐量添加 H2O2(下)所得之漫射式螢光光譜圖；插圖為螢光強度對濃度之關係，其中λex：570 nm；λem：621 nm。 ................................59 圖 3-36. TC 薄膜電極(氧化聚合 10 圈所得) 施加電壓：0.1~-0.5 V 時. 所得的 (A)紫外光-可見光吸收光譜圖以及 (B)漫射式螢光光譜圖。(C) 與(D)為吸收度與螢光強度分別與電壓之關係圖。.............................61 圖 3-37. ITO|TC 修飾電極所顯現的氧化態 TC 特徵峰吸收度以及螢. 光強度與施予電壓之關係。 ..................................................................62 圖 3-38 TC (氧化聚合 30 圈)薄膜電極加入(A) Fe3+、(B) Cu2+與(C) Fe2+離子所得之漫射式螢光光譜圖；插圖為螢光強度與金屬濃度之 Stern-Volmer plot。..................................................................................64 圖 3-39 溶液態 TC (10-5M) 於不同 pH 值溶液中所測得之紫外光-可見光吸收光譜圖；插圖為吸收度與 pH 值之關係。 ...............................66 圖 3-40 溶液態 TC (10-5M)於不同 pH 值溶液中所測得之螢光光譜圖；插圖為螢光強度與 pH 值之關係。 ...............................................66. VII.

(12) 圖 3-41. TC 氧化聚合薄膜修飾電極於不同 pH 值溶液中所測得之紫. 外光-可見光吸收光譜圖；插圖為吸收度與 pH 值之關係。.............67 圖 3-42. TC 氧化聚合薄膜修飾電極於不同 pH 值溶液中所測得之漫. 射式螢光光譜圖。 ..................................................................................67 圖 3-43. TC 氧化聚合薄膜修飾電極於不同 pH 值溶液中所測得之漫. 射式螢光光譜圖；插圖為漫射式螢光強度與 pH 值之關係圖。 .......68 圖 3-44 葡萄糖在 GOx 催化下被氧氣氧化產生葡萄糖酸與過氧化氫的示意圖。...................................................................................................70 圖 3-45 在氧氣下，ITO|TC|GOx 薄膜電極逐量添加葡萄糖所得之漫射式螢光光譜；插圖為螢光強度與葡萄糖濃度的關係（上圖）。下圖為在氮氣下所進行的控制實驗。 ..............................................................71 圖 3-46 在 pH 7 緩衝溶液下，ITO|TC|GOx 薄膜電極逐量添加葡萄糖所得之漫射式螢光光譜；插圖為螢光強度與葡萄糖濃度的關係。 ..72 圖 3-47 在氧氣下，ITO|TC 薄膜電極逐漸添加葡萄糖所得之漫射式螢光光譜圖；插圖為螢光強度與葡萄糖之關係。 ..................................73 圖 6-1. TC、TB、MB 使用氧化聚合與偶氮化製備之修飾電極在載流. 液體下漫射式螢光穩定性與時間之關係。 ..........................................77 圖 6-2 以氧化聚合法掃描 5 圈後所得的 ITO|TB 修飾電極表面，經刮除法刮除一定面積 (1 ×0.5 μm2 ) 後，所得影像之俯視圖 (上) 與剖. VIII.

(13) 面圖 (下)，其中掃描速率為 0.5 Hz。 ..................................................78 圖 6-3 以氧化聚合法掃描 5 圈後所得的 ITO|MB 修飾電極表面，經刮除法刮除一定面積 (1 ×0.5 μm2 ) 後，所得影像之俯視圖 (上) 與剖面圖 (下)，其中掃描速率為 0.5 Hz。 ..................................................79 圖 6-4 導電模式 AFM 影像分析，其中(A)為 ITO；(B)為 ITO|TC；(C) 為 ITO|TC|FT；(D)為(C)再注射一次 FT。掃描速率：1 Hz，偏壓︰0.5 V (探針接地)。 ........................................................................................80 圖 6-5 導電模式 AFM 影像分析，其中(A)為 ITO；(B)為 ITO|TC；(C) 為 ITO|TC|DNA；(D)為(C)再注射一次 DNA。掃描速率：1 Hz，偏壓︰ 0.5 V (探針接地)。 ..................................................................................81 圖 6-6 導電模式 AFM 影像分析，其中(A)為 ITO；(B)為 ITO|TB；(C) 為 ITO|TB|GOx；(D)為(C)再注射一次 GOx。掃描速率：1 Hz，偏壓︰ 0.5 V (探針接地)。 ..................................................................................82 圖 6-7 導電模式 AFM 影像分析，其中 (A)為 ITO；(B)為 ITO|TB； (C)為 ITO|TB|FT；(D)為(C)再注射一次 FT。掃描速率：1 Hz，偏壓︰ 0.5 V (探針接地)。 ..................................................................................83 圖 6-8 導電模式 AFM 影像分析，其中 (A)為 ITO；(B)為 ITO|TB； (C)為 ITO|TB|DNA；(D)為(C)再注射一次 DNA。掃描速率：1 Hz，偏壓︰0.5 V (探針接地)。 ......................................................................84. IX.

(14) 圖 6-9 導電模式 AFM 影像分析，其中(A)為 ITO；(B)為 ITO|MB； (C)為 ITO|MB|GOx；(D)為(C)再注射一次 GOx。掃描速率：1 Hz，偏壓︰0.5 V (探針接地)。 ......................................................................85 圖 6-10. 導電模式 AFM 影像分析，其中(A)為 ITO；(B)為 ITO|MB；. (C)為 ITO|MB|FT；(D)為(C)再注射一次 FT。掃描速率：1 Hz，偏壓︰ 0.5 V (探針接地)。 ..................................................................................86 圖 6-11 導電模式 AFM 影像分析，其中 (A)為 ITO；(B)為 ITO|MB； (C)為 ITO|MB|DNA；(D)為(C)再注射一次 DNA。掃描速率：1 Hz，偏壓︰0.5 V (探針接地)。 ......................................................................87 圖 6-12 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 NAD+所測得之紫外光 -可見光吸收光譜圖，其中 NAD+濃度為 (a) 0；(b) 0.63；(c)1.26；(d) 2.52；(e) 3.15；(f) 3.84；(g) 4.45；(h) 6.25；(i) 11.76；(j) 14.285 mM。 (B)為吸收度 (λabs ：590 nm) 與 NAD+濃度的關係。 .....................88 圖 6-13. (A) TC (10-5M) 在水溶液中逐量添加 NAD+ 測得之螢光光. 光譜圖，其中 NAD+ 濃度為 (a) 0；(b) 0.63；(c)1.26；(d) 2.52；(e) 3.15； (f) 3.84；(g) 4.45；(h) 6.25；(i) 11.76；(j) 14.285 mM。(B)為螢光強度與 NAD+ 濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem：621 nm。.......89 圖 6-14. (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 NAD+測得之紫外光-. 可見光吸收光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.63；(c)1.26；. X.

(15) (d) 2.52；(e) 3.15；(f) 3.84；(g) 4.45；(h) 6.25；(i) 11.76；(j) 14.285 mM。 (B) 為吸收度與 NAD+ 濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem：621 nm。 .........................................................................................................90 圖 6-15. (A) TC 薄膜 (氧化聚合 10 圈) 逐量添加 NAD+ 測得之漫射. 式螢光光譜圖，其中 NAD+ 濃度為(a) 0；(b) 0.63；(c)1.26；(d) 2.52； (e) 3.15；(f) 3.84；(g) 4.45；(h) 6.25；(i) 11.76；(j) 14.285 mM。(B) 為螢光強度與 NAD+濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem：621 nm。 ...................................................................................................................91 圖 6-16 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 Na2S2O8 所測得之紫外光-可見光吸收光譜圖，其中 Na2S2O8 濃度為 (a) 0；(b) 16.66；(c) 31.5； (d) 47.61；(e) 62.5；(f) 76.92；(g) 90.9；(h) 104.47；(i) 117.647 mM (j) 130.43 mM。(B)為吸收度 (λabs ：590 nm) 與 Na2S2O8 濃度的關係。 ...................................................................................................................92 圖 6-17 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 Na2S2O8 所測得之螢光光譜圖，其中 Na2S2O8 濃度為 (a) 0；(b) 16.66；(c) 31.5；(d) 47.61； (e) 62.5；(f) 76.92；(g) 90.9；(h) 104.47；(i) 117.647；(j) 130.43 mM。 (B)為螢光強度與 Na2S2O8 濃度的關係，其中 λex：570 nm；λem：621 nm。 .........................................................................................................93 圖 6-18 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈) 逐量添加 Na2S2O8 所測得之紫外光-可見光吸收光譜圖，其中 Na2S2O8 濃度為 (a) 0；(b) 16.66；(c). XI.

(16) 31.5；(d) 47.61；(e) 62.5；(f) 76.92；(g) 90.9；(h) 104.47；(i) 117.647 mM (j) 130.43 mM。 (B)為吸收度 (λabs：590 nm) 與 Na2S2O8 濃度的關係。...................................................................................................94 圖 6-19 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈) 逐量添加 Na2S2O8 所測得之漫射式螢光光譜圖，其中 Na2S2O8 濃度為 (a) 0；(b) 16.66；(c) 31.5；(d) 47.61；(e) 62.5；(f) 76.92；(g) 90.9；(h) 104.47；(i) 117.647 mM (j) 130.43 mM。 (B)為螢光強度與 Na2S2O8 濃度的關係，其中λex：570 nm；λem：621 nm。 ..............................................................................95 圖 6-20. (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 NADH 所測得之紫外. 光-可見光吸收光譜圖，其中 NADH 濃度為 (a) 0；(b) 0.63；(c)1.26； (d) 2.52；(e) 3.15；(f) 6.25；(g) 7.69；(h) 10.447；(i) 11.76 mM。(B) 為吸收度 (λabs：590 nm) 與 NADH 濃度的關係。 ..........................96 圖 6-21. (A) TC (10-5M) 在水溶液中逐量添加 NADH 測得之螢光光. 光譜圖，其中 NADH 濃度為 (a) 0；(b) 0.63；(c)1.26；(d) 2.52；(e) 3.15； (f) 6.25；(g) 7.69；(h) 10.447；(i) 11.76 mM。(B)為螢光強度與 NADH 濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem：621 nm。 ........................97 圖 6-22 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 NADH 測得之紫外光 -可見光吸收光譜圖，其中 NADH 濃度為 (a) 0；(b) 0.63；(c)1.26；(d) 2.52；(e) 3.15；(f) 6.25；(g) 7.69；(h) 10.447；(i) 11.76 mM。(B) 為. XII.

(17) 吸收度 (λabs ：590 nm)與 NADH 濃度間的關係。 ..........................98 圖 6-23 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 NADH 測得之漫射式螢光光譜圖，其中 NADH 濃度為 (a) 0；(b) 0.63；(c)1.26；(d) 2.52； (e) 3.15；(f) 6.25；(g) 7.69；(h) 10.447；(i) 11.76 mM。(B)為螢光強度與 NADH 濃度間的關係﹔其中λex：570 nm；λem：621 nm。.......99 圖 6-24 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 Na2S2O3 所測得之紫外光-可見光吸收光譜圖，其中 Na2S2O3 濃度為 (a) 0；(b) 16.66；(c) 31.5； (d) 47.61；(e) 62.5；(f) 76.92；(g) 90.9；(h) 104.47；(i) 117.647 mM (j) 130.43 mM。 (B)為吸收度 (λabs：590 nm) 與 Na2S2O3 濃度的關係。 .................................................................................................................100 圖 6-25. (A) TC (10-5M) 在水溶液中逐量添加 Na2S2O3 測得之螢光光. 光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 16.66；(c) 31.5；(d) 47.61； (e) 62.5；(f) 76.92；(g) 90.9；(h) 104.47；(i) 117.647；(j) 130.43 mM。 (B)為螢光強度與 Na2S2O3 濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem： 621 nm。 ................................................................................................101 圖 6-26. (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 Na2S2O3 測得之紫外. 光-可見光吸收光譜圖，其中 Na2S2O3 濃度為 (a) 0；(b) 16.66；(c) 31.5； (d) 47.61；(e) 62.5；(f) 76.92；(g) 90.9；(h) 104.47；(i) 117.647 mM (j) 130.43 mM。(B) 為吸收度 (λabs：590 nm) 與 Na2S2O3 濃度間的關係。.........................................................................................................102 XIII.

(18) 圖 6-27. (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 Na2S2O3 測得之漫射. 式螢光光譜圖，其中 Na2S2O3 濃度為 (a) 0；(b) 16.66；(c) 31.5；(d) 47.61；(e) 62.5；(f) 76.92；(g) 90.9；(h) 104.47；(i) 117.647 mM (j) 130.43 mM。(B)為螢光強度與 Na2S2O3 濃度間的關係﹔其中 λex：570 nm；λem：621 nm。 ............................................................................103. XIV.

(19) 摘要 Phenothiazine 化合物如 Thionine、Toluidine Blue 與 Methylene Blue 具有黏附蛋白質的應用潛力，本實驗以電化學氧化聚合法以及偶氮化 -去氮還原固定法將 Thionine、Toluidine Blue 以及 Methylene Blue 固定於導電玻璃 (ITO) 上，再藉由 Flow Injection Analysis 以及 Chronoamperometry 技巧，對這三種物質吸附葡萄糖氧化脢、儲鐵蛋白以及鮭魚精蛋白之能力進行比較。實驗顯示：Thionine 最具應用潛力，當蛋白質被逐量注入時，蛋白質會被吸附於 Thionine 表面，導致其螢光逐漸減弱，與利用掃描探針式顯微鏡影像分技術 (AFM) 所得結果極吻合。雖然 Chronoamperometry 也具有類似性質，但其靈敏性較差，因此難以有效檢測蛋白質含量。根據上述實驗結果，我們證實 Phenothiazine 化合物具有作為蛋白質分子膠的應用潛力，而且漫射式螢光光譜分析法是檢測蛋白質含量的有效工具之一。. 關鍵字：類核黃素、漫射式光譜、流動式注入法 XV.

(20) Abstract Phenothiazines, such as thionine chloride (TC), toluidine blue (TB) and methylene blue (MB) are effective molecular adhesives for protein immobilization. In the light of the potential of phenothiazines in this respect, we prepared phenothiazine-modified electrodes via anodic polymerization and diazotization-reduction processes. With the help of diffuse-fluorescence spectroscopy (DFS) and flow injection analysis (FIA), we compared the biocompatibility of phenothiazines with glucose oxidase (GOx), ferritin (FT) and salmon testes (DNA). According to DFS and conductive-mode atomic force microscopy (C-AFM), we confirmed that TC is an effective molecular glue for GOx, compared to its structural analogues, TB and MB. When GOx was injected over the TC-modified electrodes, it could adsorb on TC and causing the fluorescence to decrease. We also compared DFS with other techniques in GOx analysis, such as chronoamperometry, DFS stood out as the most sensitive means. Based on these results, we conclude that phenothiazines are useful glues for protein immobilization, and diffuse-fluorescence spectroscopy is an effective tool for protein analysis.. Keywords：Phenothiazines；diffuse-fluorescence spectroscopy；flow injection analysis XVI.

(21) 第一章緒論 1.1 電化學聚合薄膜化學修飾在材料科學上具有重要應用價值，應用範圍包括：表面修飾(1-6)，催化(7-8)，合成(9-11)與偵測器製作(12-18)。就表面修飾而言，文獻報導指出：具有電化學應用潛力的材質可經由簡易電化學技巧如循環伏安法(Cyclic voltammetry，簡稱 CV) 將之黏附於電極表面，素材涵蓋沸石(19)、黏土(20)甚至苯硫醯胺 (Phenothiazine) (21)。有鑒於此，本論文即以循還伏安法或偶氮化還原法將 Phenothiazine 化合物，如 Thionine、Toluidine Blue 與 Methylene Blue，修飾於電極表面，藉以探討其光電化學性質與應用潛力。核黃素是生物體內重要的電子傳遞媒介，也是生化反應中進行能量轉移的輔脢之一，惟其在身物體外的活性較難以維持，至今多以人工核黃素，即所謂類核黃素模擬其生化行為。對於 Phenothiazine 之應用研究，早在 1984 年 Gorton 便利用 Dip coating 方式將 N-methylphenazinium 離子修飾於電極表面，再結合葡萄糖氧化脢偵測葡萄糖。. 1.

(22) 1.2 電化學聚合方法本論文所使用的電極修飾法為氧化聚合法與偶氮化還原法。理論上，若 Phenothiazine 分子結構上具有-NH2 官能基，此官能基便可被氧化而形成陽離子自由基 (Cation radical)，再經由 C-N coupling 脫去兩個 H+離子而成為雙聚物，或再經由類似機制形成多聚物而沉積在電極表面，如圖 1-1 所示：. 圖 1-1 Thionine 氧化聚合示意圖。. 2.

(23) 此外，含有胺基的芳香化合物 (Ar-NH2) 亦可在酸性環境下可與亞硝酸鈉 (NaNO2) 反應而產生偶氮衍生物 (Diazonium salt)。若將偶氮衍生物予以還原，則可使其進行脫氮反應而成為自由基。因自由基化性活潑，故會行吸附於電極表面上，可能涉及的反應如圖 1-2 所示：. N H2N. S. NH2. HCl NaNO2. N H2N. S + e-. S. NH2. N2 - N2. N. N. H 2N. S. 圖 1-2 Thionine 經偶氮化還原法吸附於 ITO 電極表面示意圖。. 3.

(24) 1.3 漫射式光譜分析法(Diffuse reflectance/fluorescence spectroscopy) 可見光波不易穿透固態樣品，因此難以穿透式光譜分析法得知其光電性質。雖然如此，吾人可以漫射式光譜分析法，如漫射式折射或反射式螢光光譜分析法 (Diffuse reflectance/fluorescence spectroscopy) 進行探討。漫射式光譜分析法主要是利用光纖傳送與收集從試樣表面所漫射的折射光或螢光分析樣品(22-23)，其示意圖如圖1-3 所示，其優點為可對固態或難溶性樣品進行定性分析。當漫反射光在樣品内部，經過多次反射、折射、散射及吸收時，已與樣品内部分子發生作用，因此當其返回至樣品表面時，可攜帶與樣品结構和化學特性有關的訊息，如圖1-4所示，因此可藉以進行定量分析。剖面圖. 圖1-3. 切面圖. 光纖示意圖，其中黑色、紅色箭頭分別為光纖運輸激發光源. 與接收漫射光行進之方向。 4.

(25) 光入射. 一次漫射二次漫射. 圖1-4. 漫射式光譜分析示意圖. 5.

(26) 1.4 流動式注入分析法 (Flow Injection Analysis) 流動式注入法(簡稱FIA)是ㄧ種簡單、快速的定量分析技術。根據文獻報導(24)，模擬手工操作的間歇式自動分析系統首次出現在1940 年。在1950年，繼而出現氣泡隔間式連續流動分析系統，其共同點為可將所需試劑或樣品依比例運輸至反應區，使之完成化學反應，並由偵測器記錄實驗結果。雖然如此，其速度仍受到限制。在1975年，丹麥學者 Ruzicka 和 Hansen 發表了第一篇有關 FIA 相關的文獻。文獻中指出可藉由一連續流動的液體，將待測物攜帶至反應區或偵測區，達到偵測目的。由於此種分析技術具有操作簡易、組裝方便與價格便宜等優點，故快速取代傳統手動分析法，成為定量分析的利器。 FIA 的基本裝置包括蠕動幫浦 (Pump)、注射閥 (Injection valve)、偵測器 (Detector) 與連接管線 (Connecting tubing)，如圖 1-5 所示。當樣品 (約 10 μL ~500 μL) 經注射閥注入載流液體時，二者可在管柱內混合、稀釋、擴散、濃縮或進行物質交換。當代測物流經偵測器時，偵測器上便會形成瞬時高峰，其面積或高度會與偵測物種的濃度成正比。 Pump mL/min. w Reaction coil. Carrier stream. Sample injection valve. 圖 1-5 FIA 操作示意圖。 6. Detector.

(27) 一般而言，影響偵測訊號的主要因素有：注入之樣品體積、載體流速與運輸管線長度或孔徑。此外，待測物在載體中的樣品分散係數也是影響因素之一。分散係數低的樣品可較準確地運輸至偵測器。有鑒於漫射式螢光光譜分析法與流動式注入法的優點，本論文結合此兩種技巧，藉由 Phenothiazine 修飾電極對蛋白質進行定量分析。我們發現 TC 修飾電極對葡萄糖氧化脢偵測具有優異的靈敏度，不僅證實 Phenothiazine 化合物具有作為蛋白質分子膠的應用潛力，也顯示漫射式螢光光譜分析法是檢測蛋白質含量的有效工具之一。. 7.

(28) 第二章實驗 2.1 化學藥品藥品名稱. 廠牌. 1. Thionine chloride. TCI. 2. Toluidine blue. TCI. 3. Methylene blue. TCI. 4. Glucose oxidase (GOx). Sigma. 5. Ferritin (FT). Sigma. 6. Salmon teste. Sigma. 7. -Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+). Sigma. 8. D-(+)-Glucose. Sigma. 9. L-Ascorbic acid. Sigma. 10. Hydrogen peroxide (35%). 景明化工. 11. Cupric Sulfate (CuSO4). 和光純藥. 12. Iron (III) sulfate n-hydrate (Fe2(SO4)3). 昭和化學. 13. Iron (II) sulfate (FeSO4．7H2O). 昭和化學. 14. Sodium Thiosulfate (Na2S2O3). 日本試藥. 15. Ammonium Persulfate ( (NH4)2S2O8). 和光純藥. 16. Ethanol. Showa. 8.

(29) 17. Sodium nitrite. Showa. 18. Potassium chloride. Showa. 19. Sulfuric acid. Echo. 20. Hydrochloric acid. Fisher. 21. 銀膠. Delta technologies. 22. 銅膠. 3M Milli-Q reagent. 23. 高純水 water system 24. 緩衝溶液 (pH 7). Merck. 9.

(30) 2.2 實驗設備儀器名稱. 廠牌規格. 1. 工作電極. ITO 導電玻璃(冠華科技). 2. 參考電極. SCE. 3. 輔助電極. Pt 電極. 4. 電位儀. Part 283、BAS-50 (Bioanalytical system)、CHI 400 或 CHI 614A (CH instrument). 5. 紫外-可見光光譜儀. HEWLETT PACKARD 8453. 6. 螢光儀. Amino-Bowman series 2 luminescence spectrometer. 7. 光纖. ORIEL. 8. 流體注射分析儀. (1) 蠕動幫浦：BAS PM-80 pump (2) 樣品注入閥：BAS 480 LC CC-5，含 20 μL 樣品迴管 (3) 參考電極：BAS MF 2021 Ag/AgCl. 9. 微量注射器. Hamilton 20 μL. 10. 超音波震盪器. DELTA D80H. 10.

(31) 11. 電子天平. Precisa 125A. 12. 微量吸量管. Nichiryo model 5000DG. 13. 三用電表. HOLA. 14. 原子力顯微鏡. Multimode AFM (NanoScope IIIA， Digital instruments and Veeco Metrology，Inc.，Santa Barbara，CA). 15. 非接觸式掃描顯微鏡探針. Budgetsensors TAP300Al. 16. 接觸式導電掃描顯微鏡探針 Budgetsensors ContE-G. 11.

(32) 2.3 類核黃素修飾電極：前處理與製備 A. ITO 電極製備： 1. 以鑽石刀將 ITO 導電玻璃切成約 1.0 × 3.5 cm2 的面積大小。 2. 以銀膠連接 ITO 導電玻璃與單芯線。待銀膠固化後再以環氧樹脂將銀膠與單芯線裸露處完全密封，並加溫(160 oC)使環氧樹脂硬化。 3. 依序將電極置於 0.1 M H2SO4、0.1 M NH4OH、95% C2H5OH 與高純水中，以超音波震盪器震盪 5 分鐘。完畢，烘乾備用。. B. 類核黃素氧化聚合於 ITO 電極之製備： 1. 取各類核黃素溶於高純水，濃度、電壓範圍、掃描速率及掃描圈數詳見各類核黃素氧化聚合修飾之圖說。 2. 製備完成後，再置於乾淨 KCl 溶液中掃瞄至 CV 圖譜穩定不變。完畢後，置於室溫下氮氣吹乾，備用。. C. 類核黃素偶氮修飾於 ITO 電極之製備： 1. 取各類核黃素溶於 0.1 M 的硫酸水溶液，濃度、亞硝酸鈉當量數、電壓範圍、掃描速率及掃描圈數詳見各類核黃素偶氮還原修飾之圖說。 2. 製備完成後，再置於乾淨 KCl 溶液中掃瞄至 CV 圖譜穩定不. 12.

(33) 變。完畢後，置於室溫下氮氣吹乾，備用。. D. 蛋白質或 DNA 固定於 ITO 電極之製備 1. 取 10 μM 的 TC 溶於 0.1 M 的 KCl 溶液，再於電壓範圍：-0.4~1.2 V vs. SCE 進行掃瞄，掃描圈數 30 圈，掃描速率 20 mV/ s。 2. GOx 修飾：依同樣方式，將步驟(A)所得的電極裝置在 FIA 上，在流速為 0.25 mL/min，載流液體為高純水，注入 GOx 濃度為：400 mg/mL，注射體積：20 μL。. 2.4 FIA 操作流程漫射式螢光光譜分析 1. 將製備好之 TC 修飾電極裝置於 FIA 注射槽中，再連接蠕動幫浦及反應槽。反應槽則藉由光纖連接至螢光光譜儀，螢光移設定激發與放射波長，選擇 Time trace 模式。 2. 藉由蠕動幫浦將載流液體輸送進系統，開關為下面綠色鈕，而上面黑色圓頭則可調整轉速，須將黑色圓頭往外拉才可轉動（照相說明）。. 13.

(34) 3. 系統流通載流液體，且確定載流液體沒有從反應槽中漏出後，再將欲注入之分析物利用針頭注入注射槽前端，注射之體積不可超過 20 μL，以免造成實驗誤差。 4. 未注射前將注射槽之旋轉閥調至上端，待樣品注射入注射槽後，再將旋轉閥轉至下方，停留約 5 秒鐘，將針頭拔出，使注射之液體進入流體系統而達反應槽內部。註：每次進樣時轉動閥的速率以及力道須一致，否則呈現之訊號強度不會與注射量成正比。 5. 進行注射，將螢光訊號記錄在螢光儀上。. 調整轉速. 開關. 14.

(35) 第三章結果與討論 3.1 ITO 表面修飾類核黃素酵素電極螢光光譜分析 Phenothiazine 是一具有氧化還原活性的雜環化合物，因其可加速或抑制生物體內電子的傳遞反應，是模擬核黃素在生物體中電子傳遞的理想素材之一，故可視為人工核黃素或類核黃素（artificial flavin），圖 3-1 所示為本論文所探討的三種類核黃素：. N. H2N. S. Cl. NH2. Thionine Chloride (TC) N H3C. N. S. CH3. NH2. CH 3. Toluidine Blue (TB) N H3C. N. S. CH 3. N. CH 3. CH3. Methylene Blue (MB) 圖 3-1 三種常見類核黃素。. 15.

(36) 根據本實驗室先前研究結果，phenothiazine 可經由化學或物理方式修飾於 ITO 導電玻璃上，並保有原有之光電性質，且具有作為蛋白質分子膠的應用潛力。有鑒於此，本論文將結合螢光光譜儀與流動式注射分析儀對此作進一步的分析與探討。實驗結果顯示 TC、TB 與 MB 均具有螢光發射潛力，如圖 3-2 顯示。. 16.

(37) Intensity (a.u.). 0.6. TC. 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 400 450 500 550 600 650 700 750. Wavelength (nm). Intensity (a.u.). 0.5. TB. 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 450 500 550 600 650 700 750 800. Wavelength (nm). 0.7 MB. Intensity (a.u.). 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 400. 500. 600. 700. Wavelength (nm). 800. 圖 3-2 TC、TB 與 MB 在水溶液中(10 μ M)所測得之激發與螢光放射光譜圖。. 17.

(38) 根據上述性質，我們進一步以氧化聚合法與偶氮還原法分別 TC、 TB 與 MB 修飾於 ITO 電極，再觀察其是否仍保有此項特性。實驗結果顯示：無論以氧化聚合法或偶氮還原法進行表面修飾，三者均可顯現螢光，而且其螢光強度會隨氧化圈數或是還原圈數增加而增加，實驗結果如圖 3-3 與 3-4 所示。我們也對兩種方法進行比較，發現以氧化聚合方式所得的 ITO 電極，其螢光強度普遍比以偶氮化方式修飾者強。推測其原因可能是當類核黃素被氧化成陽離子自由基後，可經由 C-N coupling 反應形成多層聚合而沉積於電極表面上，故比偶氮還原法修飾者，即僅能形成單層吸附，所發射出的螢光強度強。此外，我們也發現 TB 或 MB 薄膜電極所得到的螢光強度比 TC 弱。究其原因，可能是 TC 結構上擁有兩個一級胺基，TB 只有一個，至於 MB 則無，故 TC 較易被氧化聚合。反觀以偶氮化還原法所修飾的 TC 與 TB 較無此差異性，暗示以此法修飾者與所含一級胺基數目較為無關。至於 MB，因其不具一級胺基，故僅能以物理吸附方式沉澱於 ITO 上，所以其螢光強度比 TC 與 TB 弱。對於上述推測，我們也以循環伏安法對上述電極進行偵測，發現所修飾上的修飾物，其特徵峰高度以 TC 最高，TB 次之，而 MB 又次之，與漫射式螢光光譜所得結頗為相似，如圖 3-5、3-6 所示。. 18.

(39) 1.6 Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 1.4 TC 1.2 1.0. 1.5 1.0 0.5 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 Cycle. 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 620. 640. 660. 680. 700. Wavelength (nm). 1.2 TB 1.0. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 600. 0.8. 1.5 1.0 0.5 0.0. 0.6. 5 10 15 20 25 30 35 Cycle. 0.4 0.2 0.0 640. 660. 680. 700. 720. 740. Wavelength (nm). 760. Intensity (a.u.). 0.7. Intensity (a.u.). 0.6 MB 0.5 0.4. 0.5. 0.0. 0 5 10 15 20 25 30 35. 0.3. Cycle. 0.2 0.1 0.0 660. 680. 700. 720. 740. 760. Wavelength (nm). 780. 圖 3-3 TC、TB 與 MB (10 μM) 經不同掃描圈數氧化後所得漫射式螢光光譜圖與掃瞄圈數之關係。. 19.

(40) 0.8. 0.5 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 Cycle. 0.4 0.2 600. 620. 640. 660. 680. Wavelength (nm). TB. Intensity (a.u.). 1.2. Intensity (a.u.). 1.0. 0.6. 0.0. 1.0 0.8. 700. 1.0 0.5 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 Cycle. 0.6 0.4 0.2 0.0 640. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 1.0. 660. 680. 700. 720. 740. Wavelength (nm). 0.7 MB 0.6. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 1.2 TC. 0.5 0.4. 760. 0.5. 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 Cycle. 0.3 0.2 0.1 0.0 660. 680. 700. 720. 740. 760. Wavelength (nm). 780. 圖 3-4 TC、TB 與 MB (10 μM) 在偶氮還原修飾中經不同圈數還原後，電極所測得的漫射式螢光強度與掃瞄圈數之關係。. 20.

(41) 氧化聚合 20 ITO|TC. 15. I / μA. 10. Blank ITO. 5 0 -5. -10 -15 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2-0.4-0.6. E/V v.s SCE. 6. ITO|TB. I / μA. 4. Blank ITO. 2 0 -2 -4 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2-0.4-0.6. E/V v.s SCE. 8. I / μA. 6 4. ITO|MB Blank ITO. 2 0 -2 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2-0.4-0.6. E/V v.s SCE. 圖 3-5 TC、TB 與 MB (10 μM) 在電位 -0.4~1.2 V 間連續掃描 30 圈後再置於乾淨 KCL 溶液中所得之 CV 圖譜，掃描速率：0.02 V/s。. 21.

(42) 偶氮化還原 40. I / μA. ITO|TC. 20 Blank ITO. 0 -20 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6. E/V v.s SCE. 15. I/μA. 10. Blank ITO ITO|TB. 5 0 -5 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2-0.4-0.6. E/V v.s SCE. 6. I / μA. 4 2. ITO|MB Blank ITO. 0 -2 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2-0.4-0.6. E/V v.s SCE. 圖 3-6 TC、TB 與 MB (10 μM) 在電位 0 ~ -0.6 V 間連續掃描 30 圈後再置於乾淨 KCL 溶液中所得之 CV 圖譜，掃描速率：0.02 V/s。. 22.

(43) 3.2 類核黃素修飾電極之膜厚與螢光分析我們也嘗試以 AFM 技術對類核黃素膜厚與螢光強度間關係進行探討。進行膜厚測量時，主要是以高彈性係數(spring constant) AFM 探針藉由 Contact mode 模式，刮除修飾物，之後，再以 Tapping mode 模式掃描表面，以得知膜厚，代表性結果如圖 3-7 所示。( TB、MB 如附錄 6-3~6-4 所示)。. 圖 3-7 以氧化聚合法掃描 5 圈後所得的 ITO|TC 修飾電極表面，經刮除法刮除一定面積 (1 ×0.5 μm2 ) 後，所得影像之俯視圖 (上) 與剖面圖 (下)，其中掃描速率為 0.5 Hz。. 23.

(44) 為能確實估計膜厚，我們也對試片進行多次刮除。刮除次數與坑洞深度關係如圖 3-8 所示。我們發現：TC 氧化聚合膜經連續刮除三次後即可刮除完畢。因此再爾後實驗中我們即以刮除三次為度。若將不等膜厚電極之螢光強度對其膜厚作圖，所得結果如圖 3-9 與 3-10 所示。我們發現：當 TC 膜厚接近 2 nm 時，其螢光強度漸趨飽和。對此結果，我們推測可能是激發光僅能穿透 2 nm 深或是深度超過 2 nm 處所激發出螢光無法穿透而出。我們也觀察比較其他類核黃素之膜厚與螢光強度關係，實驗結果極為相似，與修飾膜本性無關也與修飾法 (氧化聚合法或偶氮還原法) 無關。. 24.

(45) Depth (nm). 5.0. TC. 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5. Depth (nm). 1. 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2. Depth (nm). 3. 4. 5. 6. 2. 3. 4. 5. 6. 4. 5. 6. 7. TB. 1. 1.15. 2. Number of scratching. Number of Scratching. 7. MB. 1.10 1.05 1.00 0.95 1. 2. 3. Number of Scratching. 7. 圖 3-8 以氧化聚合法所得 TC、TB 與 MB 聚合膜刮除數次後所得深度與刮除次數之關係，其中接觸力︰0.4 N，刮除尺寸：1×0.5 μm2 ；掃描速率：2 Hz。. 25.

(46) 氧化聚合 1.6. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). TC. 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 600. 620. 640. 660. 680. 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 1. 700. 2. Wavelength (nm). TB. 1.2. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 1.4 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 640. 660. 680. 700. 720. 740. 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2. Wavelength (nm). 0.8. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 660. 680. 700. 720. 740. 4. 5. 6. 7. 1.5. 2.0. 2.5. 3.0. 3.5. 4.0. Depth (nm). 0.9. MB. 0.7. 1.0. 3. Depth (nm). 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.4. 760. Wavelength (nm). 0.5. 0.6. 0.7. 0.8. Depth (nm). 0.9. 1.0. 圖 3-9 TC、TB 與 MB 氧化聚合膜之漫射式螢光光譜與膜厚關係；插圖中實線為模擬數據：F (TC) = 1.45×[1-exp(-x)]；F (TB) = 1.35×[1-exp(-x)]。. 26.

(47) 偶氮化還原 1.6. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). TC. 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 600. 620. 640. 660. 680. 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0. 1. 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1.0. 1.5. 700. Wavelength (nm). 1.4. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). TB. 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 640. 660. 680. 700. 720. 740. Wavelength (nm). 2. 3. Depth (nm). 2.0. 2.5. 4. 3.0. Depth (nm). 5. 3.5. 4.0. 0.8. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). MB. 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 660. 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2. 680. 700. 720. 740. 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1. 760. Depth (nm). Wavelength (nm). 圖 3-10 TC、TB 與 MB 偶氮化修飾膜之漫射式螢光光譜圖與膜厚之關係；插圖中實線為模擬數據：F (TC) = 1.45×[1-exp(-x)]；F (TB) = 1.35×[1-exp(-x)]。. 27.

(48) 對於光纖所收集到的螢光強度與膜厚關係，我們假設 TC 修飾膜是由多層單層 TC 所構成，總厚度為 b，每一單層膜內每單位體積含有 c 個分子，且分布均勻，則理論上我們可將之分割成 n 層，每層厚度為 dx，如圖 3-11 所示。若每一個 TC 分子所發出的螢光強度相同，均為 fo，則穿透過距離 x 時，強度會衰退成 f： fx = fo × exp(-κx). (式 3-1). 其中κ為吸收係數或為消光係數。偵測器若置於 x = 0，則各層 TC 所發射出的螢光總和應為 F： F = ∫ fx dn = ∫ fx × c × dV = ∫0b{fo × exp(-κx) ×c × A}dx. (式 3-2). = (foc A/κ)[1 - exp(-κb)]. (式 3-3). 其中 A 為光纖面積。根據式 3-3，F 會隨膜厚增加而上升。當膜厚趨近無限大，即 b→∞時，F 將趨近於定值，與實驗結果相吻合。 F(∞) = foκ A/κ. (式 3-4). 在此條件下，光纖所收集到的螢光強度將與 A、fo 以及κ成正比，而與消光係數成反比。根據實驗結果，TC 膜厚為 1 nm 時，其所發出的螢光強度約為 F(∞)/2，當膜厚接近 2 nm 時，其螢光接近百分之九十總強度。據此，我們估計κ 約為 1 × 109 m-1。我們也對 TB 膜進行觀察，其結果與 TC 極為相似，只是兩者的 F(∞) 有差異。對於 MB，由於其難以聚合或以偶氮化修飾於 ITO 表面，因此無法進行比較。 28.

(49) 根據式 3-4，我們認為 TC 膜與 TB 膜間的差異來自於 foc /κ， FTC(∞)/ FTB(∞) = 1.45/1.35 = (fo,TC ×cTC /κTC)/(fo,TB ×cTB /κTB) 由於 TC ≒ TB ，所以 TC 膜的 fo, 或 c 應大於 TB 膜的 fo, 或 c。依據溶液態螢光分析，TC 與 TB 的螢光量子效率幾乎一致，因此我們推論 TC 膜中的單位體積分子數 c 可能大於 TB 膜的單位體積分子數。對此，我們分析等面積的 TC 與 TB 薄膜修飾電極，發現 TC 所顯示之養化還原電流比 TB 大。因此，我們推論二者 F(∞) 的差異可能是 TC 分子較小，可在一定體積薄膜內聚合較多分子之故。. fx f0. X=0. f0. dx. 圖 3-11 TC 膜厚分析示意圖。. 29. X=b.

(50) 3.3 類核黃素薄膜電極生化應用潛力探討酵素固定是生化感測重要課題之一，目前多藉由 avidin-biotin 或金-硫鍵等修飾方式將所需酵素固定於偵測元表面。本實驗室研究發現類核黃素可吸附蛋白質，具有作為分子膠的應用潛力。在本論文中，我們嘗試藉由漫射式螢光光譜分析法，探討以類核黃素薄膜電極定量分析蛋白質的可行性。首先我們在不同 pH 環境下對 GOx 吸附行為進行探討，實驗結果如圖 3-12 所示。發現 pH ﹤5 時，GOx 的吸附速率較快，且不會因 pH 值不同而變化。推測其原因是 GOx 的等電點約為 4，在 pH 大於 5 的環境中，蛋白質表面多帶負電荷，故可與 TC 修飾膜相互吸引而吸附於其表面。有鑒於此，本實驗便以去離子水(pH ≈ 5)作為載體，逐量將葡萄糖氧化脢(簡稱 GOx)送經 TC 修飾膜表面，再分析 TC 的螢光強度，所得實驗結果如圖 3-13 所示。由於所降低的螢光強度不會回復至原有狀態，我們推測該現象應是由蛋白質吸附所造成，而非因能量轉移所致。實驗也顯示：若改注入儲鐵蛋白(Ferritin)或鮭魚精蛋白(Salmon testes)，螢光變化並不顯著(圖 3-14、3-15)。造成此一差異的原因，推測可能是蛋白質的等電點不盡相同所致。根據文獻報導：類核黃素的等電點約為 4.4(25)，GOx 的等電點約為 4(26)，二者得以靜電引力吸引而結合。反觀儲鐵蛋白的等電點約為 5~8(27)，而鮭魚卵蛋白 DNA 約為 10(28)，相較之下，二者較難. 30.

(51) 以靜電引力吸引而吸附於 TC 薄膜表面。. 31.

(52) Intensity (a.u.). 1.6. pH 8 pH 7 pH 6 pH 5 pH 4 pH 3. 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0. 0. 100. 200. 300. 400. 500. Time (sec). 圖 3-12 在不同 pH 值環境中，GOx 吸附量的變化. 32.

(53) 1.5. 1.4. 1.4. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 1.5. 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9. (A) 0. 1.3 1.2 1.1 1.0. 100 200 300 400 500 600. (B) 0. 1.5. 1.5. 1.4. 1.4. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). Time (sec). 1.3 1.2 1.1 1.0. (C) 0. 1.2 1.1. (D) 0. Time (sec). Time (sec). 1.3. 1.0. 100 200 300 400 500 600. 100 200 300 400 500 600. 100 200 300 400 500 600. Time (sec). 圖 3-13 逐量將 GOx 注入 TC 氧化聚合修飾電極時所測得的漫射式螢光強度( λex：570 nm；λem：621 nm ) 與 GOx 濃度關係圖，其中： (A) 400 mg/mL；(B) 600 mg/mL；(C) 800 mg/mL；(D) 1.0 g/mL。箭頭所指為注射點，注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。. 33.

(54) 1.60. Intensity (a.u.). 1.55 (A). 1.50. (B). (C) (D). 1.45 1.40 1.35 1.30 1.25 1.20 0. 100 200 300 400 500 600. Time (sec). 圖 3-14 儲鐵蛋白注入 TC 氧化聚合薄膜修飾電極時所測得的漫射式螢光強度( λex：570 nm；λem：621 nm )與儲鐵蛋白濃度之關係圖，其中：(A) 4.25 mg/mL；(B) 8.5 mg/mL；(C)17 mg/mL；(D) 25.5mg /mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。. Intensity (a.u.). 1.6 (A). 1.5. (C) (D). (B). 1.4 1.3 1.2 0. 100 200 300 400 500 600. Time (sec). 圖 3-15 鮭魚精蛋白 DNA 注入 TC 氧化聚合薄膜修飾電極時所測得的漫射式螢光強度(λex：570 nm；λem：621 nm)與鮭魚精蛋白濃度之關係圖，其中：(A) 10 mg/mL；(B) 20 mg/mL；(C) 30 mg/mL；(D) 40 mg/mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。. 34.

(55) 我們也以 AFM (conductive mode) 對前述 GOx 吸附現象進行探討。實驗結果如圖 3-16，顯示經流體注射分析實驗後的電極若以導電模式 AFM 測量其 I-V 曲線，其與實驗前的 ITO|TC 電極以及空白 ITO 電極存在不同結果，其中僅有空白 ITO 電極的 I-V 曲線遵守歐姆定律，而 ITO|TC 與吸附有 GOx 的電極(簡稱 ITO|TC|GOx)則呈現非線性變化。若進一步在± 0.5 V 處觀察三者電流差異，電流比約為 104： 102：1。有鑒於此，我們對各電極施加偏壓 0.5 V，再進行表面影像分析，所得的結果如圖 3-17 所示。我們發現 GOx 會吸附於 TC 微粒上，與前述實驗結論頗為一致。我們也以 AFM 觀察注入儲鐵蛋白與鮭魚卵蛋白後之電極表面，我們發現它們也會吸附於 ITO|TC 表面，只是吸附量較低，結果如附錄 6-4~6-5 所示。. 35.

(56) 20. I/ nA. 10. ITO ITO|TC ITO|TC|GOx. 0. -10 -20 1.0. 0.5. 0.0. -0.5. -1.0. Bias (V). 圖 3-16 以鍍有白金的 AFM 導電探針對 ITO、ITO|TC 與 ITO|TC|GOx 電極進行分析所測得之 I-V 曲線。. 250 nm. 250 nm. 250 nm. (A). (C). 250 nm. (B). (D). (A) (A)為 ITO；(B)為 ITO|TC；圖 3-17 導電模式 AFM 影像分析，其中 (C). (C)為 ITO|TC|GOx；(D)為(C)再注射一次 GOx。掃描速率：1 Hz，偏壓︰0.5 V (探針接地)。 (A). (B). 36.

(57) 我們也對 GOx 與 TC 間的吸引力進行探討。實驗結果(圖 3-18)顯示：AFM 探針與 ITO|TC|GOx 表面間的接觸力(Fappl)若小於 0.8 μN，電極所顯現的 I-V 曲線幾乎不變。但當 Fappl 大於 0.8 μN 時，電極的 I-V 曲線會開始改變。當 Fappl 接近 1.2 μN 時，I-V 曲線呈現出 ITO|TC 的特徵。若 Fappl 增加至 3.1 μΝ，則 I-V 曲線會再褪變成類似空白 ITO 的特徵。根據這些變化，我們推論：當 GOx 流經於 ITO|TC 表面時， GOx 會黏附於 TC 上方而非黏附在空白 ITO 表面。此外，又因為 Fappl > 1.2 μN 時，ITO|TC|GOx 表面出現 ITO|TC 的特徵，我們因此推論： GOx 與 TC 間的引力強度應介於 0.8~1.2 μΝ之間，此一假設也證實 TC 是一具應用潛力的分子膠。 20. I/ nA. (D). (E). 10. (C) (B). 0 (A). -10 -20 1.0. 0.5. 0.0. -0.5. -1.0. Bias/ V 圖 3-18 以 Pt-coated AFM 探針所測得之 I-V 曲線，其中探針與 ITO|TC|GOx 電極間的接觸力為：(A) 480；(B) 850；(C) 1160；（D） 3130；（E）3350 nN。. 37.

(58) 我們也藉由定時電流法(Chronoamperometry)量測蛋白質流經 ITO|TC 電極時對 TC 的氧化還原峰所造成的干擾。實驗結果顯示：電流變化與電位有關，也會隨 GOx 注射入而變化，如圖 3-19 所示。但若與漫射式螢光光譜分析結果相比較，所得結果頗為吻合，惟二者差異在電流變化幅度較小。由此可知，漫射式螢光光譜分析法對蛋白質分析而言是一靈敏的分析方法。. 38.

(59) 55. 40 35. 1.3 1.2 1.1 1.0. 30. 0. 100 200 300 400 500 600. 1.5. -6. -10. (A) 0. -4. -8. Time (sec). 25 20. (D). -2. 1.4. I / μA. Intensity (a.u.). 45. I/μA. 0. 1.5. Intensity (a.u.). 50. 100 200 300 400 500 600. 0. 100. 200. 1.1 100 200 300 400 500 600. -15. Time (sec). 100 200. 300 400 500. 600. 0. 1.1 1.0 100 200 300 400 500 600. Time (sec). 100 200 300 400 500 600. (F). -5. 1.3 1.2 1.1 1.0 0. 100 200 300 400 500 600. Time (sec). -10. 1.5. -15. 1.4. Intensity (a.u.). 1.4. I / μA. Intensity (a.u.). I/ μA. 1.2. Time (sec). 1.5. -20 -25. 6. (C) 0. 1.3. 0. 0. 18. 4. 600. 1.4. -25. 16. 400 500. 1.5. -10. Time (sec). 8. Time (sec). 300. (E). Intensity (a.u.). 1.2. (B). 10. 100 200 300 400 500 600. -5. 1.3. I/ μA. Intensity (a.u.). I / μA. 1.4. -20. 12. 1.1. Time (sec). 0. 0. 14. 1.2. 0. 1.5. 0. 1.3. -12. Time (sec). 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8. 1.4. 1.2 1.1. -30 100 200 300 400 500 600. 1.3. 0. 0. 100 200 300 400 500 600. Time (sec). 100 200 300 400 500 600. Time (sec). Time (sec). 圖 3-19 以氧化聚合法 (30 圈) 所得的 ITO|TC 電極在 (A) 0.2 V；(B) 0.1 V；(C) 0 V；(D) -0.1 V；(E) - 0.2 V 與(F) -0.3 V 下所測得的電流以及即時漫射式螢光強度( λex：570 nm；λem：621 nm，插圖) 與時間之關係圖。GOx 濃度：400 mg/mL，注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。. 39.

(60) 為證實 TC 可吸附蛋白質，我們改以溶液態 TC 代替 TC 膜進行實驗。我們發現若將 TC 溶在高純水中而不固定於電極上，所注入的蛋白質只會引起些許螢光變化，如圖 3-20 所示，顯示 TC 若不固定，蛋白質不會吸附於電極因而不會引起螢光變化。由此可知，TC 具有吸. 6.0. 6.0. 5.5. 5.5. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 附蛋白質的潛力。. 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 (A) 0. 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 (B) 0. 100 200 300 400 500 600. 6.0. 5.5. 5.5. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 6.0. 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 (C) 0. 100 200 300 400 500 600. Time (sec). Time (sec). 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0. 100 200 300 400 500 600. (D) 0. Time (sec). 100 200 300 400 500 600. Time (sec). 圖 3-20 TC (10-5 M) 隨流洗液以 (A) 0.5；(B) 1；(C) 2.5；與(D) 5 mL/min 不等流速流經空白 ITO 電極表面時注入 20 μL GOx (0.4 g/mL) 所得之漫射式螢光光譜圖 (λex：570 nm；λem：621 nm)。. 40.

(61) 為進一步了解 GOx 在 TC 修飾電極表面的吸附現象，我們改將 TC 修飾電極置於一定濃度的 GOx 溶液中進行動態分析，實驗結果如圖 3-21 所示，其中電極所發出的螢光會隨時間呈指數函數遞減（紅色點線）。假設 TC 被 GOx 吸附後成為 GOx-TC： GOx + TC ---------> GOx-TC. (式 3-5). 則電極上 TC site 的數目(nTC)會因被 GOx 佔據而遞減，其變化量便可表示為： -dnTC/dt = k[GOx] nTC. (式 3-6). -dnTC/nTC = k[GOx]dt. (式 3-7). 若對式 3-7 積分，則可得到下式： ∫t0 dnTC/nTC = -∫t0 k[GOx]dt ln(dnTC/nTC t=0) = -k[GOx]t nTC = nTC t=0 × exp (-k[GOx]t). (式3-8). 假設TC的螢光強度F與nTC成正比，則式3-8可改寫為： F/Ft=0 = exp (-k[GOx]t). (式3-9). 根據式3-9，螢光下架的初速率則為： dF/dt (t = 0) = - k[GOx]. (式3-10). 下降速率會與[GOx]的一次方成正比。根據式3-10，我們進行數據模擬，其結果如圖3-22，與實驗結果極為吻合。. 41.

(62) 1.5. 1.4. 1.4. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 1.5. 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9. (A). 0. 20. 40. 60. 80. 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9. 100. 1.5. 1.5. 1.4. 1.4. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). Time (sec). 1.3 1.2 1.1 1.0. (B). 0. 20. 40. 60. 40. 60. Time (sec). 80. 100. 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 (D). 0.9 (C) 0. 20. 40. 60. 80. 0. 100. Time (sec). 20. 80. 100. Time (sec). Intensity (a.u.). 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9. (E). 0. 20. 40. 60. 80. 100. Time (sec). 圖 3-21 在一定濃度的 GOx 條件下，GOx 吸附於 TC 修飾電極表面的動態螢光分析，其中[GOx]：(A) 0；(B) 400；(C) 600；(D) 800；(E) 1000 mg/mL，紅色者為模擬數據。. 42.

(63) dF/dt (t = 0). -0.005 -0.010 -0.015 -0.020 -0.025 -0.030 400 500 600 700 800 900 1000. [GOx]/ mg/mL. 圖 3-22 dF/dt (t = 0)與[GOx]之關係圖。. 43.

(64) 我們也對 TB 修飾電極進行比較分析。實驗結果顯示以氧化聚合或偶氮化方式製備而成的薄膜電極，其螢光差異性不大，但 TB 氧化聚合膜在電極上較不均勻，故實驗誤差較大(附錄 6-1)，因此我們主要以偶氮化還原法製備的 TB 修飾電極 (修飾 30 圈) 對蛋白質進行分析，所得結果如圖 3-23 所示。我們發現注入葡萄糖氧化脢、儲鐵蛋白或是鮭魚精蛋白，薄膜所產生的螢光強度並無減弱。為了解釋此一現象，我們也利用 conductive mode AFM 進行探討，結果顯示蛋白質可吸附於電極表面，只是數量較低(附錄 6-6~6-8 )。有鑒於此，我們認為蛋白質無法引起 TB 膜的螢光顯著變化之原因，可能是蛋白質吸附不均或是 TB 修飾膜較薄之故。. 44.

(65) 0.9. 0.8 (i). (ii). Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 0.9. (iii) (iv). 0.7 0.6 0.5 0.4 (A) 0. 0.8 0.7. (ii). (iii) (iv). 0.6 0.5 0.4 (B) 0. 100 200 300 400 500 600. (i). 100 200 300 400 500 600. Time (sec). Time (sec). Intensity (a.u.). 0.9 0.8. (i). (ii). (iii) (iv). 0.7 0.6 0.5 0.4 (C) 0. 100 200 300 400 500 600. Time (sec). 圖 3-23 TB 修飾電極注入葡萄糖氧化脢(A)、儲鐵蛋白(B) 與鮭魚精蛋白(C) 時所測得的漫射式螢光強度 (λex：623 nm；λem：672 nm)，其中葡萄糖氧化脢濃度：(i) 400、(ii) 600、(iii) 800 與(iv) 1000 mg/mL；儲鐵蛋白濃度：(A) 4.25、(B) 8.5、(C)17、與(D) 25.5 mg /mL；鮭魚精蛋白濃度：(A) 10、(B) 20、(C) 30 與(D) 40 mg/mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。. 45.

(66) 我們也對 MB 修飾電極進行探討，所得結果如圖 3-24 所示。可能是 MB 不含一級胺基之故，難以氧化聚合或偶氮化還原法製備電極，導致螢光強度極弱。實驗結果顯示：葡萄糖氧化脢、儲鐵蛋白或鮭魚精蛋白注入 MB 薄膜電極時，電極上所顯現的螢光沒有明顯變化。對此，我們同樣以導電式 AFM 觀測 ITO|MB 薄膜電極的表面，我們發現蛋白質可吸附於 MB，或許是因 MB 粒子較少，難以產生明顯螢光變化 (附錄 6-9~6-11)。根據上述分析，我們發現以氧化聚合方式製備出的 ITO|TC 薄膜電極吸附蛋白質的效果最好，其中又以葡萄糖氧化脢的吸附效果最佳。. 46.

(67) 0.40. 0.35. (i). (ii) (iii). Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 0.40 (iv). 0.30 0.25 0.20 (A) 0. 0.35. (ii). (iii). (iv). 0.30 0.25 0.20 (B) 0. 100 200 300 400 500 600. (i). 100 200 300 400 500 600. Time (sec). Time (sec). 0.50. Intensity (a.u.). 0.45 0.40. (i). 0.35. (ii). (iii). (iv). 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10. (C). 0. 100 200 300 400 500 600. Time (sec). 圖 3-24 MB 氧化聚合薄膜修飾電極注入 (A)葡萄糖氧化脢；(B)儲鐵蛋白；(C)鮭魚精蛋白；時所測得的漫射式螢光強度( λex ：671 nm； λem ：703 nm) 與濃度之關係圖，其中葡萄糖氧化脢：(i) 400、(ii) 600、 (iii) 800 與(iv) 1000 mg/mL；儲鐵蛋白(i) 4.25、(ii) 8.5、(iii)17 與(iv) 25.5mg/mL；鮭魚精蛋白：(i) 10、(ii) 20、(iii) 30 與(iv) 40 mg/mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。. 47.

(68) 3.4 TC 薄膜螢光放射探討有鑒於固定態 TC 受到可見光激發時可顯現螢光，我們也對其本性進行探討。紫外光-可見光吸收光譜分析顯示：溶液態 TC 的特徵吸收峰(λabs：590 nm)的吸收度會隨還原劑如維生素 C (Ascorbic acid)的添加而降低，同時也會導致其螢光隨之下降。反觀若改添加氧化劑如 H2O2，則其變化不甚明顯，如圖 3-25~3-28 所示。若進一步以螢光強度對吸收度作圖，二者存在線性關係，如圖 3-29 所示。根據這些結果，我們推論氧化態 TC 是其螢光的主要發射元。根據類似分析，我們也對 TC 氧化聚合膜修飾電極進行探討，所得結果與溶液態結果相似，如圖 3-30~圖 3-34 所示。我們也改以其他還原劑如 Na2S2O3 與 NADH，以及以 Na2S2O8 與 NAD+代替過氧化氫進行實驗，所得結果與添加 Ascorbic acid 與 H 2O2 相似(附錄 6-12 ~ 6-27)。此外，我們也嘗試在添加 Ascorbic acid 後，逐量添加 H 2O2 ，探討 TC 膜的可逆性，實驗結果如圖 3-35 所示，我們發現添加 Ascorbic acid 後若再加入 H 2O2，則. TC 膜的螢光會再上升，雖然無法百分之百回復，但可達百分. 之八十。由此可知，氧化態 TC 應是 TC 產生螢光的主要發光元。. 48.

(69) 1.0. Absorbance. 0.8. (A). (a). 0.6. (i). 0.4 0.2 0.0 400. 500. 600. 700. 800. Absorbance. Wavelength (nm). 1.0 (B) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0. 1. 2. 3. 4. 5. [Ascorbic acid] (mM) 圖 3-25 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 所測得之紫外光-可見光吸收光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.498；(c) 0.664；(d) 0.83；(e) 0.996；(f) 1.328；(g) 1.494；(h) 3.125；與(i) 4.545 mM。 (B)為吸收度 (λabs：590 nm) 與 Ascorbic acid 濃度的關係。. 49.

(70) Intensity (a.u.). 0.6 (A) 0.5. (a). 0.4. (i). 0.3 0.2 0.1 0.0 580. 600. 620. 640. 660. 680. 700. Wavelength (nm). Intensity (a.u.). 0.6 (B) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0. 1. 2. 3. 4. 5. [Ascorbic acid] (mM) 圖 3-26 (A) TC (10-5M) 在水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 測得之螢光光光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.498；(c) 0.664； (d) 0.83；(e) 0.996；(f) 1.328；(g) 1.494；(h) 3.125；(i) 4.545 mM。(B) 為螢光強度與 Ascorbic acid 濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem： 621 nm。. 50.

(71) Absorbance. 0.35 (A) 0.30. (a). 0.25. (j). 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 400. 500. 600. 700. 800. Wavelength (nm). Absorbance. 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0. (B). 0. 50. 100 150 200 250 300. [H O ] (mM) 2 2 圖 3-27 (A) TC (10-5 M) 於水溶液中逐量添加 H2O2 所測得之紫外光可見光吸收光譜圖，其中 H2O2 濃度為(a) 0；(b) 20；(c) 40；(d)60；(e) 80；(f) 100；(g) 120；(h) 140；(i)160 (j) 300 mM。(B)為吸收度 (λabs： 590 nm) 與 H2O2 濃度間的關係；其中λex：570 nm；λem：621 nm。. 51.

(72) Intensity (a.u.). 0.8 (A) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 580 600. (a) (j). 620. 640. 660. 680. 700. Intensity (a.u.). Wavelength (nm). 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 (B) 0.0 0. 50. 100 150 200 250 300. [H2O2 ] (mM). 圖 3-28 (A) TC (10-5M) 水溶液中逐量添加 H2O2 測得之漫射式螢光光譜圖，其中 H2O2 濃度為 (a) 0； (b)20；(c) 40； (d)60； (e)80；(f) 100； (g) 120；(h) 140；(i)160；(j) 300 mM。(B)為螢光強度與 H2O2 濃度間的關係﹔；其中λex：570 nm；λem：621 nm。. 52.

(73) 0.5 0.4 0.3. 0.785. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 0.6. 0.780 0.775 0.770 0.765 0.760. 0.34 0.35 0.36 0.37 0.38 0.39. Absorbance. 0.2 0.1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0. Absorbance. 圖 3-29 TC (10-5M) 在水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 與添加 H2O2 (插圖)測得之螢光強度( λex：570 nm)與特徵吸收峰( λem：621 nm)吸收度之關係。. 53.

(74) 0.3. Absorbance. (A). (a). 0.2 (h). 0.1. 0.0 400. 500. 600. 700. Wavelength (nm). 800. Absorbance. 0.30 (B) 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5. [Ascorbic acid] (mM) 圖 3-30 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 Ascorbic acid 測得之紫外光-可見光吸收光譜圖，其中 Ascorbic acid 濃度為(a) 0；(b) 0.498； (c) 0.664；(d)0.83；(e)0.996；(f) 1.328；(g) 1.494 與(h) 3.125 mM。(B) 為吸收度 (λabs：590 nm) 與 Ascorbic acid 濃度間的關係。. 54.

(75) 0.7. Intensity (a.u.). 0.6. (A). (a). 0.5. (h). 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 580. 600. 620. 640. 660. 680. 700. Wavelength (nm). Intensity (a.u.). 0.64. (B). 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5. [Ascorbic acid] (mM) 圖 3-31 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 Ascorbic acid 測得之漫射式螢光光譜圖；其中 Ascorbic acid 濃度為 (a) 0；(b) 0.498；(c) 0.664；(d)0.83；(e)0.996；(f) 1.328；(g) 1.494 與(h) 3.125 mM。(B) 為螢光強度與 Ascorbic acid 濃度間的關係﹔其中 λex：570 nm；λem： 621 nm。. 55.

(76) Absorbance. 0.15 (A) 0.10 0.05 0.00 400. 500. 600. 700. 800. Absorbance. Wavelength (nm). 0.157 (B) 0.156 0.155 0.154 0.153 0.152 0.151 0.150 0.149 0.148 0.147 0. 50. 100 150 200 250 300. [H2O2 ] (mM) 圖 3-32 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 H2O2 測得之紫外光-可見光吸收光譜圖，其中 H2O2 濃度為(a) 0；(b) 20；(c) 40；(d)60；(e)80； (f) 100；(g) 120；(h) 140；(i)160 與(j) 300 mM。(B)為吸收度 (λabs： 590 nm) 與 H2O2 濃度間的關係。. 56.

(77) Intensity (a.u.). 0.40 (A) 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 580 600. (a) (j). 620. 640. 660. 680. 700. Intensity (a.u.). Wavelength (nm). 0.38. (B). 0.37 0.36 0.35 0.34 0.33. 0 20 40 60 80 100120140160180200. [H2O2 ] (mM ) 圖 3-33 (A) TC 薄膜(氧化聚合 10 圈)逐量添加 H2O2 測得之漫射式螢光光譜圖，其中 H2O2 濃度為(a) 0；(b) 20；(c) 40；(d)60；(e)80；(f) 100； (g) 120；(h) 140；(i) 160 與(j) 300 mM。(B)為螢光強度與 H2O2 濃度的關係。；其中λex：570 nm；λem：621 nm。. 57.

(78) 0.60 0.56. 0.38. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 0.64. 0.52 0.48. 0.37 0.36 0.35 0.34 0.33 0.148. 0.44. 0.150. 0.152. 0.154. 0.156. Absorbance. 0.05. 0.10. 0.15. 0.20. 0.25. 0.30. Absorbance 圖 3-34 TC 薄膜在水溶液中逐量添加 Ascorbic acid 與添加 H2O2 (插圖) 測得之螢光強度 ( λem：621 nm) 與特徵吸收峰 ( λem ：590 nm) 吸收度之關係。. 58.

(79) Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 1.2 1.0 0.8. 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 [Ascorbic acid] (mM). 0.6 0.4 0.2 0.0 580. 600. 620. 640. 660. 680. 700. Wavelength (nm). 0.7. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 0.8 0.6 0.5. 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0. 0.4. 50 100 150 [H2O2] (mM). 200. 0.3 0.2 0.1 0.0 580. 600. 620. 640. 660. 680. 700. Wacelength (nm). 圖 3-35 TC 薄膜 (氧化聚合 10 圈)逐量添加 Ascorbic acid(上圖)後，再逐量添加 H2O2(下)所得之漫射式螢光光譜圖；插圖為螢光強度對濃度之關係，其中λex：570 nm；λem：621 nm。. 59.

(80) 根據上述實驗結果，我們也嘗試利用電化學技巧對 TC 薄膜電極施加電壓，探討其是否也具有與添加還原劑與氧化劑同樣的效果，所得結果如圖 3-36 所示。我們發現施加負電壓時，TC 膜的特徵吸收峰吸收度與螢光強度均隨電壓變負而下降，如圖 3-37 所示，與前述添加還原劑的效應頗為一致。但若進一步與還原劑所得的效應進行比較，發現電壓效應較不顯著。推測其原因，可能是電場效應僅能影響接近 ITO 電極表面週遭的 TC，難延伸至薄膜外部所致。雖然此，我們若以各電壓所顯現的螢光強度對氧化態 TC 的特徵峰之吸收度進行分析，二者在 TC0/-的形勢電位(0 V)附近呈現線性關係，顯示氧化態 TC 是 TC 發射螢光的主要結構。. 60.

(81) 0.35. 1.0 0.9. (a). 0.25 0.20. Intensity (a.u.). Absorbance. 0.30 (A). (f). 0.15 0.10 0.05 0.00. (B). (g). 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1. 400. 500. 600. 700. 800. 600. 620. 640. 660. 680. 700. Wavelength (nm). Wavelength (nm). (C). (D). Intensity (a.u.). Absorbance. (a). 0.8. 0.28. 0.9. 0.8. 0.24 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 -0.5. 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 -0.5. Potential (V). Potential (V). 圖 3-36 TC 薄膜電極(氧化聚合 10 圈所得) 施加電壓：0.1~-0.5 V 時所得的 (A)紫外光-可見光吸收光譜圖以及 (B)漫射式螢光光譜圖。(C) 與(D)為吸收度與螢光強度分別與電壓之關係圖。. 61.

(82) Intensity (a.u.). 0.94 0.92 0.90 0.88 0.86. 0V -0.1V. 0.84. -0.2V. 0.82. -0.3V -0.4V -0.5V. 0.80. 0.1V. 0.24 0.25 0.26 0.27 0.28 0.29 0.30. Absorbance 圖 3-37 ITO|TC 修飾電極所顯現的氧化態 TC 特徵峰吸收度以及螢光強度與施予電壓之關係。. 62.

(83) 我們也嘗試探討 TC 薄膜對金屬離子是否具有的反應性，實驗結果如圖 3-38 所示。我們發現 TC 薄膜所發射的螢光不易受金屬離子添加而變異，顯示利用氧化聚合製備出來的 TC 薄膜電極，具有極佳化學穩定度。. 63.

(84) 1.10 1.05 I0/I. Intensity (a.u.). 0.4 0.3. 1.00 0.95 0.90. 0 5 10 15 20 25 30 35. 0.2. [Fe 3+ ] (eq). 0.1 0.0 580. 600. 620. 640. 660. 680. 700. Wavelength (nm) 0.5 I0 / I. Intensity (a.u.). 1.10. 0.4 0.3. 1.05 1.00 0.95 0.90. 0 5 10 15 20 25 30 35 [C u 2+ ] (eq). 0.2 0.1 0.0 580. 600. 620. 640. 660. 680. 700. 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 580. I0 / I. Intensity (a.u.). Wavelength (nm). 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90. 0 5 10 15 20 25 30 35 [Fe 2+ ] (eq). 600. 620. 640. 660. 680. 700. Wavelength (nm). 圖 3-38 TC (氧化聚合 30 圈)薄膜電極加入(A) Fe3+、(B) Cu2+與(C) Fe2+ 離子所得之漫射式螢光光譜圖；插圖為螢光強度與金屬濃度之 Stern-Volmer plot。. 64.

(85) 3-5 pH 值對 TC 薄膜電極螢光放射之影響根據紫外光-可見光光譜分析，溶液態 TC 在 599 nm 處的吸收度會隨環境的 pH 值增高而增大，螢光光譜也呈現類似變化，如圖 3-39 與 3-40 所示。推測其原因，應是在酸性溶液中，TC 結構上的-NH2 基可與 H+離子結合形成-NH3+，導致其共振結構受到抑制，螢光放射效率也因而隨之下降，類似於 pH 值對苯胺的影響。我們也對 TC 氧化聚合薄膜(氧化聚合 30 圈)進行探討，所得結果與溶液態相似，如圖 3-41 與 3-42 所示。若再對圖 3-38 中螢光強度進行分析，我們發現其變化極為規律，顯示 TC 與氫離子間的反應應不涉及複雜結構變化。此外，我們也發現在 pH <3 或 pH > 7 時，其螢光強度趨近最低與最高值。據此，我們估計 TC 結構上所形成的-NH3+其 pKa 值應接近 5，與苯胺的 pKa 值極為吻合。. 65.

(86) 0.6 0.4. pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9. Absorbance. Absorbance. 0.8. 0.80 0.75 0.70 0.65 2. 4. 6 pH. 8. 10. 0.2 0.0 400. 500. 600. 700. 800. Wavelength (nm). 圖 3-39 溶液態 TC (10-5M) 於不同 pH 值溶液中所測得之紫外光-可見. 3.0 2.5 2.0 1.5. pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9. Intensity (a.u.). Intensity (a.u.). 光吸收光譜圖；插圖為吸收度與 pH 值之關係。. 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0. 2. 4. 6 pH. 8. 10. 1.0 0.5 0.0 580. 600. 620. 640. 660. Time (sec). 680. 700. 圖 3-40 溶液態 TC (10-5M)於不同 pH 值溶液中所測得之螢光光譜圖；插圖為螢光強度與 pH 值之關係。. 66.

(87) pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9. 400. Absorbance. Absorbance. 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00. 0.35 0.30 0.25 2. 500. 600. 4. 6 pH. 8. 10. 700. 800. Wavelength (nm). 圖 3-41 TC 氧化聚合薄膜修飾電極於不同 pH 值溶液中所測得之紫外. Intensity (a.u). 光-可見光吸收光譜圖；插圖為吸收度與 pH 值之關係。. 2.0 1.8. pH 2. 9 9. 2. 1.6 1.4 0. 圖 3-42. 200. 400. 600. Time (sec). 800. TC 氧化聚合薄膜修飾電極於不同 pH 值溶液中所測得之漫. 射式螢光光譜圖。. 67.

(88) Intensity (a.u.). 1.85 1.80 1.75 1.70 1.65 1.60 1.55. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. pH 圖 3-43 TC 氧化聚合薄膜修飾電極於不同 pH 值溶液中所測得之漫射式螢光光譜圖；插圖為漫射式螢光強度與 pH 值之關係圖。. 68.

(89) 3.6 葡萄糖感測由於 TC 具有吸附葡萄糖氧化脢的應用潛力，我們也嘗試利用 ITO|TC 修飾電極對葡萄糖進行偵測。實驗結果顯示：當此電極吸附 GOx 後，其螢光強度會隨著葡萄糖添加而增加，結果如圖 3-45 所示。控制實驗顯示：若無氧氣，其螢光強度不會顯現類似變化。根據這些實驗結果，我們推測其螢光上升原因可能是氧氣在 GOx 的催化下可將葡萄糖氧化為葡萄糖酸內酯，自行被還原成 H2O2（圖 3-44）。由於氧氣還原成過氧化氫是一 2e- – 2H+ 的反應，故在轉換的過程中會使 TC 膜附近的 pH 值升高，導致其螢光隨之上升。為了驗證此一推論，我們也嘗試以緩衝溶液將溶液 pH 值控制於 7，探討葡萄糖對 TC 修飾電極螢光的影響，實驗結果如圖 3-46 所示，顯示當溶液 pH 值固定在 7 時，TC 修飾電極螢光幾乎不受葡萄糖的影響。有鑒於此，我們認為葡萄糖添加所引起的 pH 變化是造成 TC 修飾電極螢光變化的主要因素。. 69.