第二章 實驗
2.4 FIA 操作流程
1. 將製備好之 TC 修飾電極裝置於 FIA 注射槽中，再連接蠕動幫 浦及反應槽。反應槽則藉由光纖連接至螢光光譜儀，螢光移設 定激發與放射波長，選擇Time trace 模式。
2. 藉由蠕動幫浦將載流液體輸送進系統，開關為下面綠色鈕，而 上面黑色圓頭則可調整轉速，須將黑色圓頭往外拉才可轉動
（照相說明）。
3. 系統流通載流液體，且確定載流液體沒有從反應槽中漏出後，
再將欲注入之分析物利用針頭注入注射槽前端，注射之體積不 可超過20 μL，以免造成實驗誤差。
4. 未注射前將注射槽之旋轉閥調至上端，待樣品注射入注射槽 後，再將旋轉閥轉至下方，停留約 5 秒鐘，將針頭拔出，使注 射之液體進入流體系統而達反應槽內部。
註：每次進樣時轉動閥的速率以及力道須一致，否則呈現之訊號 強度不會與注射量成正比。
5. 進行注射，將螢光訊號記錄在螢光儀上。
調整轉速
開關 調整轉速
開關
Methylene Blue (MB)
第三章 結果與討論
3.1 ITO 表面修飾類核黃素酵素電極螢光光譜分析
Phenothiazine 是一具有氧化還原活性的雜環化合物，因其可加速 或抑制生物體內電子的傳遞反應，是模擬核黃素在生物體中電子傳遞 的理想素材之一，故可視為人工核黃素或類核黃素（artificial flavin），
圖3-1 所示為本論文所探討的三種類核黃素：
Toluidine Blue (TB) Thionine Chloride (TC)
根據本實驗室先前研究結果，phenothiazine 可經由化學或物理方 式修飾於ITO 導電玻璃上，並保有原有之光電性質，且具有作為蛋白 質分子膠的應用潛力。有鑒於此，本論文將結合螢光光譜儀與流動式 注射分析儀對此作進一步的分析與探討。實驗結果顯示TC、TB 與 MB 均具有螢光發射潛力，如圖 3-2 顯示。
400 450 500 550 600 650 700 750
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
TC
450 500 550 600 650 700 750 800 0.0
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
TB
400 500 600 700 800
0.0
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
MB
圖3-2 TC、TB 與 MB 在水溶液中(10 μM)所測得之激發與螢光放射 光譜圖。
根據上述性質，我們進一步以氧化聚合法與偶氮還原法分別TC、
TB 與 MB 修飾於 ITO 電極，再觀察其是否仍保有此項特性。實驗結 果顯示：無論以氧化聚合法或偶氮還原法進行表面修飾，三者均可顯 現螢光，而且其螢光強度會隨氧化圈數或是還原圈數增加而增加，實 驗結果如圖3-3 與 3-4 所示。我們也對兩種方法進行比較，發現以氧 化聚合方式所得的ITO 電極，其螢光強度普遍比以偶氮化方式修飾者 強。推測其原因可能是當類核黃素被氧化成陽離子自由基後，可經由 C-N coupling 反應形成多層聚合而沉積於電極表面上，故比偶氮還原 法修飾者，即僅能形成單層吸附，所發射出的螢光強度強。此外，我 們也發現TB 或 MB 薄膜電極所得到的螢光強度比 TC 弱。究其原因，
可能是TC 結構上擁有兩個一級胺基，TB 只有一個，至於 MB 則無，
故TC 較易被氧化聚合。反觀以偶氮化還原法所修飾的 TC 與 TB 較 無此差異性，暗示以此法修飾者與所含一級胺基數目較為無關。至於 MB，因其不具一級胺基，故僅能以物理吸附方式沉澱於 ITO 上，所 以其螢光強度比TC 與 TB 弱。對於上述推測，我們也以循環伏安法
對上述電極進行偵測，發現所修飾上的修飾物，其特徵峰高度以TC
最高，TB 次之，而 MB 又次之，與漫射式螢光光譜所得結頗為相似，
如圖3-5、3-6 所示。
600 620 640 660 680 700
Intensity (a.u.)
Cycle
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
TC
640 660 680 700 720 740 760 0.0
Intensity (a.u.)
Cycle
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
TB
660 680 700 720 740 760 780 0.0
Intensity (a.u.)
Cycle
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
MB
圖3-3 TC、TB 與 MB (10 μM) 經不同掃描圈數氧化後所得漫射式 螢光光譜圖與掃瞄圈數之關係。
600 620 640 660 680 700
Intensity (a.u.)
Cycle
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
TC
640 660 680 700 720 740 760 0.0
Intensity (a.u.)
Cycle
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
TB
660 680 700 720 740 760 780 0.0
Intensity (a.u.)
Cycle
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
MB
圖3-4 TC、TB 與 MB (10 μM) 在偶氮還原修飾中經不同圈數還原 後，電極所測得的漫射式螢光強度與掃瞄圈數之關係。
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2-0.4-0.6 Blank ITO
I / μA
6 ITO|TB
Blank ITO
I / μA
Blank ITO ITO|MB
I / μA
E/V v.s SCE
圖3-5 TC、TB 與 MB (10 μM) 在電位 -0.4~1.2 V 間連續掃描 30 圈
氧化聚合
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6
Blank ITO ITO|TB
Blank ITO ITO|MB
3.2 類核黃素修飾電極之膜厚與螢光分析
我們也嘗試以AFM 技術對類核黃素膜厚與螢光強度間關係進行 探討。進行膜厚測量時，主要是以高彈性係數(spring constant) AFM 探針藉由Contact mode 模式，刮除修飾物，之後，再以 Tapping mode 模式掃描表面，以得知膜厚，代表性結果如圖3-7 所示。( TB、MB 如附錄6-3~6-4 所示)。
圖3-7 以氧化聚合法掃描 5 圈後所得的 ITO|TC 修飾電極表面，經刮 除法刮除一定面積 (1 ×0.5 μm2 ) 後，所得影像之俯視圖 (上) 與剖面 圖 (下)，其中掃描速率為 0.5 Hz。
為能確實估計膜厚，我們也對試片進行多次刮除。刮除次數與坑洞 深度關係如圖3-8 所示。我們發現：TC 氧化聚合膜經連續刮除三次 後即可刮除完畢。因此再爾後實驗中我們即以刮除三次為度。若將不 等膜厚電極之螢光強度對其膜厚作圖，所得結果如圖3-9 與 3-10 所 示。我們發現：當TC 膜厚接近 2 nm 時，其螢光強度漸趨飽和。對 此結果，我們推測可能是激發光僅能穿透2 nm 深或是深度超過 2 nm 處所激發出螢光無法穿透而出。我們也觀察比較其他類核黃素之膜厚 與螢光強度關係，實驗結果極為相似，與修飾膜本性無關也與修飾法 (氧化聚合法或偶氮還原法) 無關。
1 2 3 4 5 6 7
Depth (nm)
Number of scratching
TC
Depth (nm)
Number of Scratching
TB
Depth (nm)
Number of Scratching
MB
圖3-8 以氧化聚合法所得 TC、TB 與 MB 聚合膜刮除數次後所得深 度與刮除次數之關係，其中接觸力︰0.4 N，刮除尺寸：1×0.5 μm2； 掃描速率：2 Hz。
氧化聚合
600 620 640 660 680 700 0.0
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm) 1 2 3 4 5 6 7
Intensity (a.u.)
Depth (nm)
640 660 680 700 720 740 0.0
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm) 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
Intensity (a.u.)
Depth (nm)
660 680 700 720 740 760
0.1
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm) 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
Intensity (a.u.)
Depth (nm)
圖3-9 TC、TB 與 MB 氧化聚合膜之漫射式螢光光譜與膜厚關係；
插圖中實線為模擬數據：F (TC) = 1.45×[1-exp(-x)]；F (TB) = 1.35×[1-exp(-x)]。
偶氮化還原
600 620 640 660 680 700 0.0
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
Intensity (a.u.)
Depth (nm)
640 660 680 700 720 740 0.0
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
Intensity (a.u.)
Depth (nm)
660 680 700 720 740 760
0.1
Intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
Intensity (a.u.)
Depth (nm)
圖3-10 TC、TB 與 MB 偶氮化修飾膜之漫射式螢光光譜圖與膜厚之 關係；插圖中實線為模擬數據：F (TC) = 1.45×[1-exp(-x)]；F (TB) = 1.35×[1-exp(-x)]。
對於光纖所收集到的螢光強度與膜厚關係，我們假設TC 修飾膜 是由多層單層TC 所構成，總厚度為 b，每一單層膜內每單位體積含 有c 個分子，且分布均勻，則理論上我們可將之分割成 n 層，每層厚 度為dx，如圖 3-11 所示。若每一個 TC 分子所發出的螢光強度相同，
均為 fo，則穿透過距離x 時，強度會衰退成 f：
fx = fo × exp(-κx) (式 3-1) 其中κ為吸收係數或為消光係數。偵測器若置於 x = 0，則各層 TC 所 發射出的螢光總和應為F：
F = ∫ fx dn = ∫ fx × c × dV
= ∫0b{fo × exp(-κx) ×c × A}dx (式 3-2)
= (foc A/κ)[1 - exp(-κb)] (式 3-3) 其中 A 為光纖面積。根據式 3-3，F 會隨膜厚增加而上升。當膜厚趨 近無限大，即b→∞時，F 將趨近於定值，與實驗結果相吻合。
F(∞) = foκ A/κ (式 3-4)
在此條件下，光纖所收集到的螢光強度將與A、fo以及κ成正比，而 與消光係數成反比。根據實驗結果，TC 膜厚為 1 nm 時，其所發出的 螢光強度約為F(∞)/2，當膜厚接近 2 nm 時，其螢光接近百分之九十 總強度。據此，我們估計κ 約為 1 × 109 m-1。我們也對TB 膜進行觀 察，其結果與TC 極為相似，只是兩者的 F(∞) 有差異。對於 MB，
根據式 3-4，我們認為 TC 膜與 TB 膜間的差異來自於 foc /κ，
FTC(∞)/ FTB(∞) = 1.45/1.35 = (fo,TC×cTC /κTC)/(fo,TB ×cTB /κTB)
由於 TC ≒ TB ，所以 TC 膜的 fo, 或c 應大於 TB 膜的 fo, 或 c。依據 溶液態螢光分析，TC 與 TB 的螢光量子效率幾乎一致，因此我們推 論TC 膜中的單位體積分子數 c 可能大於 TB 膜的單位體積分子數。
對此，我們分析等面積的TC 與 TB 薄膜修飾電極，發現 TC 所顯示 之養化還原電流比TB 大。因此，我們推論二者 F(∞) 的差異可能是 TC 分子較小，可在一定體積薄膜內聚合較多分子之故。
f
xf
0f
0dx X = b
X = 0 f
xf
0f
0dx X = b
X = 0
圖3-11 TC 膜厚分析示意圖 。
3.3 類核黃素薄膜電極生化應用潛力探討
酵素固定是生化感測重要課題之一，目前多藉由avidin-biotin 或 金-硫鍵等修飾方式將所需酵素固定於偵測元表面。本實驗室研究發 現類核黃素可吸附蛋白質，具有作為分子膠的應用潛力。在本論文 中，我們嘗試藉由漫射式螢光光譜分析法，探討以類核黃素薄膜電極 定量分析蛋白質的可行性。首先我們在不同pH 環境下對 GOx 吸附 行為進行探討，實驗結果如圖3-12 所示。發現 pH ﹤5 時，GOx 的 吸附速率較快，且不會因pH 值不同而變化。推測其原因是 GOx 的 等電點約為4，在 pH 大於 5 的環境中，蛋白質表面多帶負電荷，故 可與TC 修飾膜相互吸引而吸附於其表面。有鑒於此，本實驗便以去 離子水(pH ≈ 5)作為載體，逐量將葡萄糖氧化脢(簡稱 GOx)送經 TC 修
飾膜表面，再分析TC 的螢光強度，所得實驗結果如圖 3-13 所示。由 於所降低的螢光強度不會回復至原有狀態，我們推測該現象應是由蛋 白質吸附所造成，而非因能量轉移所致。實驗也顯示：若改注入儲鐵 蛋白(Ferritin)或鮭魚精蛋白(Salmon testes)，螢光變化並不顯著(圖 3-14、3-15)。造成此一差異的原因，推測可能是蛋白質的等電點不盡 相同所致。根據文獻報導：類核黃素的等電點約為 4.4(25)，GOx 的等 電點約為4(26)，二者得以靜電引力吸引而結合。反觀儲鐵蛋白的等電 點約為5~8(27)，而鮭魚卵蛋白 DNA 約為 10(28)，相較之下，二者較難
以靜電引力吸引而吸附於TC 薄膜表面。
0 100 200 300 400 500 1.0
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
1.6 pH 8
pH 7 pH 6 pH 5 pH 4 pH 3
Time (sec)
Intensity (a.u.)
圖3-12 在不同 pH 值環境中，GOx 吸附量的變化
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec)
Intensity (a.u.)
Time (sec) (D)
圖3-13 逐量將 GOx 注入 TC 氧化聚合修飾電極時所測得的漫射式 螢光強度( λex：570 nm；λem：621 nm ) 與 GOx 濃度關係圖，其中：
(A) 400 mg/mL；(B) 600 mg/mL；(C) 800 mg/mL；(D) 1.0 g/mL。箭 頭所指為注射點，注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。
0 100 200 300 400 500 600
Intensity (a.u.)
Time (sec)
(A)
圖3-14 儲鐵蛋白注入 TC 氧化聚合薄膜修飾電極時所測得的漫射式 螢光強度( λex：570 nm；λem：621 nm )與儲鐵蛋白濃度之關係圖，其 中：(A) 4.25 mg/mL；(B) 8.5 mg/mL；(C)17 mg/mL；(D) 25.5mg /mL。
注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。
Intensity (a.u.)
Time (sec) mg/mL。注射體積：20 μL，流速：0.25 mL/min。
我們也以AFM (conductive mode) 對前述 GOx 吸附現象進行探 討。實驗結果如圖3-16，顯示經流體注射分析實驗後的電極若以導電 模式AFM 測量其 I-V 曲線，其與實驗前的 ITO|TC 電極以及空白 ITO 電極存在不同結果，其中僅有空白 ITO 電極的 I-V 曲線遵守歐姆定 律，而ITO|TC 與吸附有 GOx 的電極(簡稱 ITO|TC|GOx)則呈現非線 性變化。若進一步在± 0.5 V 處觀察三者電流差異，電流比約為 104： 102：1。有鑒於此，我們對各電極施加偏壓 0.5 V，再進行表面影像 分析，所得的結果如圖3-17 所示。我們發現 GOx 會吸附於 TC 微粒 上，與前述實驗結論頗為一致。我們也以AFM 觀察注入儲鐵蛋白與 鮭魚卵蛋白後之電極表面，我們發現它們也會吸附於ITO|TC 表面，
只是吸附量較低，結果如附錄6-4~6-5 所示。
1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -20
-10 0 10 20
ITO ITO|TC ITO|TC|GOx
I/ nA
Bias (V)
圖3-16 以鍍有白金的 AFM 導電探針對 ITO、ITO|TC 與 ITO|TC|GOx
圖3-16 以鍍有白金的 AFM 導電探針對 ITO、ITO|TC 與 ITO|TC|GOx