第一章 前言
3.9 BSE 化學成分分析與主成分抗癌活性檢測
利用氣相層析質譜儀分析 BSE 之主要成分，所得圖譜如圖 31 所示。藉 由 NIST MS 2.0 資料庫比對主要成分之質譜資料，結果如表 4 所示，BSE 主 要是以精油為主，其成分中以 Guaiene 含量最多(滯留時間為 25.21 min，其相 對含量 34.0%)；其次為 Guaiol (滯留時間為 23.69 min，相對含量 28.7%)及 β-Eudesmol (滯留時間 28.20 min，相對含量 6.4%)；另外 Trans-Caryophyllene 含量則較少(滯留時間 12.55 min，相對含量 1.4%)，上述四種主要成份已購買 市售標準品進行確認，其化學結構如圖 32 所示。
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圖 31、BSE 之 GC-MS 分析圖譜
表 4、以 GC-MS 分析所得 BSE 之主要成分 Peak No R.T.
(min) Area % Compound Name
1 12.55 188855 1.4 Trans-Caryophyllene 2 17.43 35887 0.3
3 22.59 22123 0.2
4 23.69 3761499 28.7 Guaiol 6 23.88 51218 0.4
7 24.42 76908 0.6 8 24.65 18105 0.1 9 24.8 154945 1.2 10 24.86 138386 1.1
11 24.98 376268 2.9 Aromadendrene oxide-(1) 12 25.08 106318 0.8
13 25.16 152855 1.2
14 25.21 4461604 34.0 δ-Guaiene 15 25.41 31985 0.2
16 25.74 60478 0.5 17 26.5 41664 0.3
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40 43.04 205028 1.6 (-)-Nortrachelogenin 41 45.03 149204 1.1
42 45.61 71840 0.5
43 45.72 166279 1.3 Phenol,
2-[1-methyl-2-butenyl]-4-methoxy
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(1) α-Guaiene (2) Guaiol
(3) Trans-Caryophyllene (4) β-Eudesmol
圖 32、BSE 主要成分之化學結構圖
為瞭解這四種化合物是否為抑制肺癌細胞生長之活性成分毒殺活性，因此
進一步進行對A549 與H661 細胞之毒殺活性試驗，其結果由圖 33 所示，當 單獨使用α-Guaiene 進行處理48 hr時，在添加劑量為 100 μg/ml 下，其細胞存 活率為 84.45%，但若提升至150 μg/ml 時，其細胞存活率為 47.58%，則IC50 值 為142.6 μg/ml。當單獨使用Guaiol 進行處理時，在添加劑量為 100 μg/ml 下，
其細胞存活率為 54.90%，但若提升至150 μg/ml時，其細胞存活率為 48.42%，
則IC50 值為137.2 μg/ml；在單獨使用Trans-Caryophyllene 進行處理時，劑量依 舊仍須達到150 μg/ml 下對細胞才具有半數之毒殺效果，其IC50 值為139.7 μg/ml；而在單獨使用β-Eudesmol 在劑量150 μg/ml處理下，其對細胞之毒殺作 用並無有顯著之效果，顯示其對 A549 細胞並無明顯毒殺之活性。
針對H661 細胞，如圖34 所示，當單獨使用α-Guaiene 進行處理48 hr時，
在添加劑量為25 μg/ml 下，其細胞存活率為 59.06%，但若提升至50 μg/ml 時，
其細胞存活率則僅存為 45.10%，則IC50 值為46.83 μg/ml；當單獨使用Guaiol 進
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行處理時，在添加劑量為 50 μg/ml 下，其細胞存活率為 81.05%，但若提升至 100 μg/ml時，則能降低其細胞之存活率為 39.99%，而IC50 值為89.3μg/ml；在 單獨使用Trans-Caryophyllene 進行處理時，在添加劑量為 50 μg/ml 下，其細 胞存活率為 80.33%，但若提升至100 μg/ml時，則能降低其細胞之存活率為 38.16%，而IC50 值為93.7 μg/ml；而在單獨使用β-Eudesmol 在劑量150 μg/ml處 理下，其對細胞之毒殺作用並無有顯著之效果，此結果與A549 細胞一致，顯 示其β-Eudesmol 化合物對 H661 細胞亦無明顯毒殺之活性。
在此四個化合物中，以α-Guaiene 處理的 IC50 值為 46.8 μg/ml，其數值 與 BSE 相近(44.6 μg/ml)，因此推估 α-Guaiene 可能是毒殺 H661 細胞之化合 物；而 Guaiol、Trans-Caryophyllene 化合物方面，雖然隨著劑量之提高，對細 胞之毒殺有顯示出其劑量性效應 (dose-dependent)，但整體而言上其毒殺活性 亦遠比萃取物還來的低，此結果與 A549 細胞一致，推估這些化合物可能不是 萃取物中的主要抑癌成份，或者是需要加入其他種化合物來相輔相成才能發揮 其最大功效，因此未來將再進一步針對各有效成分對 A549 及 H661 細胞之作 用機轉進行探討。
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圖 33、使用不同劑量之化合物 (A) -Guaiene, (B) Guaiol, (C)
Trans-Caryophyllene, 及(D) -Eudesmol 處理 A549 肺腺癌細胞株 48 hr 後之細 胞存活率
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圖 34、使用不同劑量之化合物 (A) α-Guaiene, (B) Guaiol, (C)
Trans-Caryophyllene, 及(D) β-Eudesmol 處理 H661 肺腺癌細胞株 48 hr 後之細 胞存活率
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第四章 討論
癌症已連續二十七年高居國人十大死亡原因的首位，其中肺癌是已開發與 開發中國家最常見的惡性腫瘤(Erridge et al., 2007; Gajra et al., 2003; McCracken et al., 2007)。報導指出，香茹草(Hsu et al., 2008)、燈籠果(Lan, 2009)、阿里山 十大功勞(Wong et al., 2009)、大黃(Li et al., 2009)、蛹蟲草(Park et al., 2009)、
烏藥(Yang et al., 2009)等天然植物萃取物皆具有抑制或毒殺 A549 肺腺癌細 胞之效用。其中，香茹草與烏藥萃取物對於人類肺胚胎細胞株MRC-5 或人類 血管內皮細胞株HUVEC 之毒殺程度相對較低，顯示其具有細胞毒殺之特異 性。
A549、H661、H1299 均屬於「非小細胞肺癌」(NSCLC)，患者早期一般 沒有特別明顯的臨床症狀，但當其經血道轉移或擴散至其它組織、器官，往往 已造成病患身心極大的創傷。過去的研究發現，有許多天然的食材或是中藥萃 取出的化學成分可用於預防癌症以及抑制胃癌、大腸癌、乳癌、食道癌、肺癌、
前列腺癌等癌症的生長(Boone et al., 1990)；(Kelloff et al., 1996; Zi et al., 1998;
Panaro et al., 1999; Zi and Agarwal, 1999)。本實驗結果顯示，BSE 能有效地抑 制 A549 (p53 gene normal）、H661 (p53 gene mutation) 及 H1299 (p53 gene missing) 等三株分別不同帶有 p53 基因之肺腺癌細胞的生長，於處理時間 48 hr 之 IC50 值分別為 43.7、44.6 及 53.3 μg/ml (表 2)；反之，對於正常細胞人類 肺胚胎細胞株 MRC-5 (IC50 值 = 89.7 μg/ml) 之毒性則較低，顯示 BSE 具有 細胞毒殺特異性。
由圖11 結果得知，BSE 對於A549、H661 及H1299 細胞之抑制作用具有 劑量依存性(dose-dependent)，且其抑制效果亦會隨著處理時間增長而增加，顯 示其為一長效型之抑制劑。由於長效型抑制劑在適當劑量與暴露時間下能保有 最佳且長效之抑制活性，且不容易受活體代謝而降低生物利用度，因此若與短
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效型之抑制劑相較下較具優越性。另外，若能與其它藥物配合使用，必有其開 發潛力與實用價值。文獻指出，以 octreotide 與 paclitaxel 作為共軛藥物 (conjugate medicine)證實能抑制誘導A549 肺癌細胞之裸鼠腫瘤生長(Shen et al., 2008)。本研究針對BSE 之作用機轉進行探討，藉由瞭解其毒理作用之特性，
以期能與已開發之藥物作為共軛藥物，以行輔助治療之用途。由表1~3 結果得 知，市售抗癌藥物Cisplatin 毒殺A549 與 H661 肺腺癌細胞雖比BSE 較佳，
但相對的亦會對人類肺胚胎細胞株MRC-5 細胞株造成較高之毒殺影響，反觀 BSE 對人類肺胚胎細胞株MRC-5 則有較低之毒殺性，因此，假設藉由使用 BSE 並降低Cisplatin 之劑量來作為共軛藥物，或許能降低藥物對患者所帶來 之副作用。
“細胞程序性壞死”為目前在癌症治療研究中相當受到重視的一個作用機 轉，亦為治療抗細胞凋亡及抗藥性癌症新藥開發的一個重要趨勢(Han et al., 2007)。在本研究中，首先由顯微鏡觀察經BSE 處理之A549、H661 細胞外型 之變化，由圖13 結果得知，於處理48 hr 下隨著投藥劑量增加，A549 細胞將 逐漸無法貼壁、細胞型態不完整、整個細胞分解、脹大和無細胞小泡形成愈趨 明顯，且細胞膜已破損使細胞間隔明顯並伴隨釋放出一些發炎物質。此外，由 圖14 結果得知，於處理48 hr下隨著投藥劑量增加，H661 細胞將整個細胞分 解、脹大及細胞胞器膨脹愈趨明顯，這些現象均是典型的Necroptosis 之特徵。
為了瞭解BSE 對A549、H661 細胞的生長週期影響，乃利用流式細胞儀進行 分析，由圖15 結果發現BSE 在處理48 hr後，隨著投藥劑量的增加，A549 細 胞的G2/M期比例顯著增加，不僅同時伴隨著G0/G1 phase 的減少亦增加Sub-G1 期的死亡細胞數；於處理48 hr後的H661 細胞週期亦有相同之結果(圖16)，顯 示BSE 確實會使A549、H661 細胞週期停滯期在G2/M期，使細胞生長停滯進 而走向死亡。Mollah et al. (2009b)指出玉檀木水萃物是透過此作用機轉抑制肺 癌細胞生長並促發其凋亡。
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過去文獻亦指出玉檀木具有抗發炎之功效，主要是對 RAW 264.7 cells 經 由 LPS 誘導產生發炎反應後具有其抗發炎之功效(Cheon et al., 2009)，及具有 抗氧化作用和抑制大腸癌 HT-29 細胞之效果(Jo et al., 2007)。但目前並無文獻 與證據提及出玉檀木萃取物用於動物治療上是否具有毒性(Park et al., 2008)。然 而在藉由超臨界方式萃取下所得之萃取物並沒有被詳細被研究，本研究主要探 討 BSE 對不同肺腺癌細胞之抗癌機制進行深入探討。
為 了 進 一 步 確 認 BSE 處 理 後 的 細 胞 死 亡 類 型 ， 因 此 本 研 究 再 以 Annexin-V/PI staining 分析細胞死亡型態。由圖17、18可發現，在24 hr及48 hr 這兩個不同時間點結果都可以明顯看出細胞群落皆由LL 區域移向UL 及UR 區域，另外於圖19、20 發現H661 亦有相同之結果，顯示隨著BSE 劑量的增 加，將誘導A549、H661 細胞走向程序性壞死並伴隨早、晚期凋亡，此結果發 現BSE 誘導細胞死亡之方式有別於過去玉檀木文獻中所提及是以誘導凋亡為 主，這可能是因萃取方式不一，所獲得之化合物不同而造成之機制亦不盡相 同。
為了瞭解BSE 對A549、H661 細胞內部訊息因子的變化，因此使用 Western blot進行試驗及定量，其中訊息因子 RIP-1、RIP-3 被認為是啟動程序 性壞死之相關蛋白。雖然Necroptosis 的基本機制資訊仍然知之甚少，大部分 都認為Necroptosis 均必須藉由其獨特的受體相互作用、蛋白激酶1和3（RIP1 和RIP3）的參與，並且相互作用的訊息路途徑，進而誘發Necroptosis 之形成(Wu et al., 2012; Jouan-Lanhouet et al., 2012)。此外亦有文獻指出，可以單獨誘導 RIP-1 活化進而促進Necroptosis 之生成(Ye et al., 2012; Nehs et al., 2011;
Saddoughi et al., 2013)。隨著BSE 投藥劑量增加，圖27、28 顯示促程序性細胞 壞死蛋白的RIP-1、RIP-3 與TNF-α 蛋白表現有顯著增加之趨勢；而抗程序性 細胞壞死蛋白activated Caspase-8 的表現則有明顯的減少，在先前研究顯示 Caspase-8 蛋白質的過度表現(overexpression)，將抵抗程序性壞死持續進行；
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反之，若抑制或阻斷 Caspase-8 蛋白的表現，則可加速程序性壞死之進展 (Vandenabeele et al., 2010b; Vandenabeele et al., 2010a)。
非小型細胞肺腺癌等轉移性癌症的癌細胞會藉由侵襲及轉移，從原本部 位擴散到其他處生長。於是本研究在發現BSE 會藉由停滯細胞週期在G2/M phase 來抑制A549、H661 肺腺癌細胞的生長後，更進一步的探討BSE 對於 A549、H661細胞移行及侵襲的抑制作用。為了避免A549、H661 細胞是因為 已在第一時間被毒殺所致而有移行與侵襲降低的現象，於是本研究使用不影響 癌細胞存活的劑量(IC20值以下)進行試驗，而目前許多關於抑制癌細胞侵襲及 轉移的研究也是使用不影響細胞生存的劑量 (Shih et al., 2009; Yang et al., 2010;
Chen et al., 2006)。本研究進行Wound healing assay 以及cell migration assay 這 兩個試驗，以探討BSE 對於A549、H661 肺腺癌細胞移行的抑制作用。圖21、
22之Wound healing assay 實驗結果顯示，相對於control 組在24 hr後溝痕即有 癒合現象，BSE 在不影響存活率的最高劑量(20 μg/ml)處理24 hr下，仍有未癒 合的溝橫，顯示BSE 有顯著抑制A549、H661 移行效果，並與樣品劑量增加 呈現劑量依存性。而在cell migration assay 試驗部份，由圖23、24 發現，以不 影響存活率萃取物之劑量下以及A549、H661 細胞加入Boyden chamber insert 培養24 hr後染色，發現隨著BSE 劑量的增加，移行穿越polycarbonate membrane 到Boyden chamber insert 下層的細胞明顯減少，其劑量於10 μg/ml 下即具有顯 著的抑制癌細胞移行效果。相較於同樣具抗發炎及清除ROS 自由基(Chyau et al., 2002)效果的欖仁樹 (Terminalia catappa L.)乙醇粗萃物100 μg/ml，對人類舌
22之Wound healing assay 實驗結果顯示，相對於control 組在24 hr後溝痕即有 癒合現象，BSE 在不影響存活率的最高劑量(20 μg/ml)處理24 hr下，仍有未癒 合的溝橫，顯示BSE 有顯著抑制A549、H661 移行效果，並與樣品劑量增加 呈現劑量依存性。而在cell migration assay 試驗部份，由圖23、24 發現，以不 影響存活率萃取物之劑量下以及A549、H661 細胞加入Boyden chamber insert 培養24 hr後染色，發現隨著BSE 劑量的增加，移行穿越polycarbonate membrane 到Boyden chamber insert 下層的細胞明顯減少，其劑量於10 μg/ml 下即具有顯 著的抑制癌細胞移行效果。相較於同樣具抗發炎及清除ROS 自由基(Chyau et al., 2002)效果的欖仁樹 (Terminalia catappa L.)乙醇粗萃物100 μg/ml，對人類舌