第一章 前言
3.5 BSE 對 A549、H661 細胞程序性壞死之影響
圖 17、以 BSE 不同濃度處理 24 hr 對 A549 細胞凋亡與壞死程度之影響。(A) 0 μg/ml (Control), (B) 22 μg/ml, (C) 44 μg/ml, (D) 88 μg/ml, (E) Cisplatin 100 μg/ml。左下角象限(LL, FITC/PI) 表示活細胞；左上角象限(UL, FITC/PI+)為 壞死細胞；右下角象限(LR, FITC+/PI)為早期凋亡細胞；右上角象限(UR, FITC+/PI+)為晚期凋亡細胞，即壞死期凋亡細胞。
由於Cell Cycle 分析僅用PI 染劑觀察，因此無法判定有多少Cell 是以早 期凋亡或晚期凋亡/壞死的方式死亡，當細胞壞死時，細胞膜會破裂，不像細 胞凋亡時維持細胞膜完整性，所以透過PI exclusion 測試，利用活細胞的細胞 膜對PI不具通透性，而細胞壞死時細胞膜破裂導致PI 進入細胞染色來分析細 胞 膜 完 整 性 。 細 胞 凋 亡 發 生 之 初 期 時 ， 位 於 細 胞 膜 上 的 phospholipid phosphatidylserine (PS)，會由膜內轉位至膜外暴露於細胞表面的環境中。而 Annexin-V 可與PS 具有高度親和力，為確認玉檀木超臨界萃取物處理後的細
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胞死亡類型，因此本研究進一步利用Annexin-V 偵測肺癌細胞經BSE 處理過 後是以何種方式死亡。
由圖17 之分析結果顯示，當A549 細胞未經BSE 處理時(Control組)，細 胞群落大部分聚集在LL 區域，其比例為95.11%。當BSE 劑量由22 μg/ml逐漸 增加至88 μg/ml時，其早期凋亡比率由0.45%上升至0.88%，晚期凋亡由0.45%
上 升 至 4.19% ， 壞 死 比 率 由 4.01% 大 幅 上 升 至 9.66% ， 且 呈 現 劑 量 依 賴 性 (dose-dependent)。由此結果顯示，A549 細胞經BSE 處理後主要是走向壞死(UL) 區域，一部分則走向凋亡(LR)區域；但對於Cisplatin 之效應分布則不易判斷。
當處理 BSE 時間增長至 48 hr 時，由圖 18 之分析結果顯示，Control 組 細胞群落依然聚集在 LL 區域，其比率為 95.55%，當 BSE 以劑量 22、44、88 及 Cisplatin (100 μg/ml)分別處理下，其早期凋亡比率分別為 0.75%、0.48%、
0.33%及 8.83%，晚期凋亡分別為 0.54%、0.77%、9.15%及 3.83%，壞死比率 則分別為 3.73%、7.81%、28.61%及 3.24%，由此結果得知，A549 細胞經 BSE 處理 48 hr 後其細胞壞死數目亦更為顯著，且與劑量及時間的增加呈現劑量與 時間依賴性(dose-dependent)。此結果亦發現，A549 細胞的早期凋亡/晚期凋亡 比例並沒有隨著 BSE 劑量增加而提高，依舊與作用 24 hr 者相同，證實誘導 A549 細胞走向死亡之方式是以 necroptosis 為主，並伴隨一部分早期/晚期凋 亡方式進行。相對的，在處理 Cisplatin (100 μg/ml) 48 hr 後，原本於左下角的 活細胞，有往右下象限移動之趨勢，其細胞走向晚期凋亡之數目亦愈明顯，證 明 Cisplatin 誘導 A549 細胞走向死亡之方式是以 apoptosis 為主。
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圖 18、以 BSE 不同劑量處理 48 hr 對 A549 細胞凋亡與壞死程度之影響。(A) 0 μg/ml (Control), (B) 22 μg/ml, (C) 44 μg/ml, (D) 88 μg/ml, (E) Cisplatin 100 μg/ml。左下角象限(LL, FITC/PI) 表示活細胞；左上角象限(UL, FITC/PI+)為 壞死細胞；右下角象限(LR, FITC+/PI)為早期凋亡細胞；右上角象限(UR, FITC+/PI+)為晚期凋亡細胞，即壞死期凋亡細胞。
在上述實驗中已證實玉檀木超臨界萃取物誘導 A549 細胞之死亡方式主要 是以 necroptosis 為主，因此，接著探討 H661 細胞之死亡方式是否亦走向相 同路徑。在處理時間為 24 hr 時，由圖 19 之分析結果顯示，當 BSE 劑量由 22 μg/ml 逐漸增加至 88 μg/ml 時，H661 細胞之早期凋亡比率由 0.24%上升至 0.84%，晚期凋亡由 0.10%上升至 4.27%，壞死比率由 2.64%大幅上升至 54.70%，
且呈現劑量依賴性(dose-dependent)。由此結果顯示，H661 細胞經 BSE 處理 後主要是走向壞死(UL)區域，一部分則走向凋亡(LR)區域，此現象與 A549 細 胞相同。
當處理時間延長為 48 hr 時，H661 細胞之壞死數目更為顯著，且與劑量及 時間的增加呈現劑量與時間依賴性(圖 20)。此外，與 A549 細胞相同，H661 細
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胞的早期凋亡/晚期凋亡比例並未隨著 BSE 劑量增加而提高，依舊與作用 24 hr 者相同，證實誘導 H661 細胞走向死亡之方式是以 necroptosis 為主，並伴隨 一部分早期/晚期凋亡方式進行。
圖 19、以 BSE 不同劑量處理 24 hr 對 H661 細胞凋亡與壞死程度之影響。(A) 0 μg/ml (Control), (B) 22 μg/ml, (C) 44 μg/ml, (D) 88 μg/ml, (E) Cisplatin 100 μg/ml。左下角象限(LL, FITC/PI) 表示活細胞；左上角象限(UL, FITC/PI+)為 壞死細胞；右下角象限(LR, FITC+/PI)為早期凋亡細胞；右上角象限(UR, FITC+/PI+)為晚期凋亡細胞，即壞死期凋亡細胞。
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圖 20、以 BSE 不同劑量處理 48 hr 對 H661 細胞凋亡與壞死程度之影響。(A) 0 μg/ml (Control), (B) 22 μg/ml, (C) 44 μg/ml, (D) 88 μg/ml, (E) Cisplatin 100 μg/ml。左下角象限(LL, FITC/PI) 表示活細胞；左上角象限(UL, FITC/PI+)為 壞死細胞；右下角象限(LR, FITC+/PI)為早期凋亡細胞；右上角象限(UR, FITC+/PI+)為晚期凋亡細胞，即壞死期凋亡細胞。