玉檀木超臨界萃取物對人類肺腺癌細胞生長、移行與侵襲之抑制效果

全文

(1)國立高雄大學生命科學系碩士班碩士論文. 玉檀木超臨界萃取物對人類肺腺癌細胞生長、移行與侵襲之抑制效果 Inhibitory effects of Bulnesia sarmientoi supercritical fluid extract on the proliferation, migration and invasion of human lung adenocarcinoma cells. 研究生：張榮哲撰指導教授：王恒隆博士洪哲穎博士. 中華民國一百零三年一月.

(2) 謝誌兩年半的艱苦跋涉倏地就這麼流逝了，終於到了要畫下句點的時候，轉眼間就要步上社會新鮮人的行列，邁向人生的另一個旅程，只是不知道獲得的是否真的比失去的還多，當輸入最後一個字符時，重新閱讀早已不陌生的文字，發現歷練的不僅僅是學識，更多的是在內心層面的體悟，筆墨難以形容我此刻的心情，不過十年寒窗確實是歷歷在目，若有任何小小的成就，該歸給這些年來一直為我默默付出的父母，只想對您們說，我至親至愛的父母，在這寧靜的深夜裡寫下這篇謝誌詞，眼淚為您們而流。另外，是曾經和我一起走過的師長、朋友。衷心感謝我的指導老師，王恆隆老師、洪哲穎老師、師母許夏芬博士以及義守大學方麗雯老師在這兩年多來的指導與照顧，並啟發我有更多的想像及思考空間且培育我獨立思考與解決問題的能力，方能讓我將研究順利完成。同時感謝兩位口試委員國立高雄大學楊文仁老師與財團法人義大醫院張基昌醫師百忙中願意撥出時間批閱研究論文及前來參與口試，給予我諸多寶貴之意見與不曾思考過的問題，使本論文更臻圓滿，銘感殊深，謹此誠摯誌謝。在這漫長的研究生活中，我並不感到孤單，因為有高雄大學 604-1 Lab 與義守大學食品化學 Lab 貼心且彼此了解的夥伴們給予的加油聲，讓我屢屢在失敗挫折中再度站起來迎接新挑戰，感謝當年啟蒙的學長國宏、學姊涵君、麗雯、妍帆、靜玫與文瓊，感謝您們的引路與傳承；同學曜誠、泓諺、源發；學弟妹宗鴻、漢章、勁逸、君奕、巧榕、慧穎、雪華、酩雅、善茹、淑如、佩斯、修如、若緣、昀芷與瑋庭等人，謝謝各位在研究上給予的幫忙與協助，方能讓我順利完成論文並取得碩士學位。另外，於高雄大學 604-1 Lab 的夥伴們，謝謝俊俏的俊賢、凱盟學長、有氣質的育菁、親切的靖佳、漂亮的貞儀與新助理媛婷學姊；還有我的同學煜升；政杰、德君學弟，您們總是體諒我不常待在實驗室，並經常為我雪中送炭與打.

(3) 氣，每當與大家一起出去遊玩、聚餐等活動，都是給予我最佳的實驗動力。亦感謝上天給予我如此完善的環境，實驗室曾相處過的學長姐與學弟妹們，希望他日腦海中浮現的仍是這一幕幕歡樂的場景。. 學生張榮哲謹誌中華民國一百零三年一月.

(4) 目. 錄. 目錄 .............................................................................................................................I 表目錄 ...................................................................................................................... IV 圖目錄 ....................................................................................................................... V 摘要 ............................................................................................................................ 1 Abstract ....................................................................................................................... 3 第一章前言 .............................................................................................................. 5 1.1 肺腺癌(Lung adenocarcinoma cancer) ........................................................ 5 1.1.1 肺腺癌之分類與治療 ........................................................................... 6 1.1.2 上皮生長因子接受器 ........................................................................... 9 1.2 天然藥物(Natural medicines) .................................................................... 10 1.3 細胞死亡之途徑 ........................................................................................ 13 1.3.1 細胞凋亡(Apoptosis) ................................................................................. 14 1.3.2 細胞壞死(Necrosis) ................................................................................... 17 1.3.3 細胞程序性壞死(Necroptosis)................................................................. 18 1.3.4 細胞自噬(Autophagy ; Type II cell death) ............................................. 25 1.4 癌細胞移行(migration)與侵襲(invasion)作用 ......................................... 27 1.5 超臨界萃取(Supercritical fluid extraction) ............................................... 31 1.6 玉檀木(Bulnesia sarmientoi) ..................................................................... 32 1.7 研究目的 .................................................................................................... 35 2.1 研究架構及實驗流程 ................................................................................ 37 2.2 玉檀木萃取物製備 .................................................................................... 38 2.3 細胞培養條件及方法 ................................................................................ 38 2.3.1 試劑 .............................................................................................................. 38 2.3.2 藥品配製 ..................................................................................................... 39 2.3.3 培養條件 ..................................................................................................... 39 2.3.4 細胞之解凍 ................................................................................................. 40 2.3.5 繼代培養 ..................................................................................................... 40 2.3.6 細胞冷凍保存............................................................................................. 40 2.3.7 細胞數目計數............................................................................................. 40 2.4 細胞存活率之測定－MTT assay.............................................................. 41 2.4.1 試劑 .............................................................................................................. 41 2.4.2 實驗原理 ..................................................................................................... 41 2.4.3 實驗步驟 ..................................................................................................... 42 2.5 細胞型態變化觀察 .................................................................................... 42 I.

(5) 2.6 細胞週期之研究 ........................................................................................ 42 2.6.1 試劑 .............................................................................................................. 42 2.6.2 實驗原理 ..................................................................................................... 43 2.6.3 實驗步驟 ..................................................................................................... 43 2.7 細胞凋亡之研究 ........................................................................................ 44 2.7.1 試劑 .............................................................................................................. 44 2.7.2 藥品配製 ..................................................................................................... 44 2.7.3 實驗原理 ..................................................................................................... 44 2.7.4 實驗步驟 ..................................................................................................... 45 2.8 細胞移行能力測定 Wound healing assay ............................................ 45 2.8.1 試劑 .............................................................................................................. 45 2.8.2 實驗原理 ..................................................................................................... 45 2.8.3 實驗步驟 ..................................................................................................... 46 2.9 細胞移行能力試驗 Cell migration assay .............................................. 46 2.9.1 試劑 .............................................................................................................. 46 2.9.2 藥品配製 ..................................................................................................... 46 2.9.3 實驗原理 ..................................................................................................... 47 2.9.4 實驗步驟 ..................................................................................................... 47 2.10 細胞侵襲能力試驗(Cell invasion assay) ................................................ 48 2.10.1 試劑 ............................................................................................................ 48 2.10.2 藥品配製 ................................................................................................... 48 2.10.3 實驗原理 ................................................................................................... 48 2.10.4 實驗步驟 ................................................................................................... 48 2.11 西方墨點法 .............................................................................................. 49 2.11.1 試劑 ............................................................................................................ 49 2.11.2 藥品配製 ................................................................................................... 51 2.11.3 實驗原理 ................................................................................................... 52 2.11.4 細胞溶解液(cell lysates)之製備 ............................................................ 52 2.11.5 蛋白質定量 ............................................................................................... 53 2.11.6 電泳 ............................................................................................................ 53 2.11.7 蛋白質電泳 semi-dry 轉漬(transfer)法 ................................................ 54 2.11.8 封阻(Blocking) ......................................................................................... 54 2.11.9 抗體(Antibody) ......................................................................................... 54 2.11.10 免疫染色法 ............................................................................................. 54 2.12 GC-MS 分析 ............................................................................................. 55 2.13 數據分析 .................................................................................................. 55 3.1 玉檀木超臨界萃取之萃取率 .................................................................... 56 3.2 BSE 對肺癌細胞之毒殺作用 .................................................................... 56 II.

(6) 3.3 BSE 對 A549、H661 細胞生長型態之影響............................................. 59 3.4 BSE 對 A549、H661 細胞生長週期之影響............................................. 61 3.5 BSE 對 A549、H661 細胞程序性壞死之影響 ........................................ 64 3.6 BSE 對 A549、H661 細胞移行與侵襲之抑制作用 ................................ 68 3.6.1 BSE 抑制 A549、H661 細胞遷移作用之分析(Wound healing assay) ................................................................................................................................. 69 3.6.2 BSE 抑制 A549、H661 細胞移行作用之分析(Migration assay) ...... 72 3.6.3 BSE 抑制 A549、H661 細胞侵襲作用之分析(Invasion assay) ......... 74. 3.7 BSE 對促使 A549、H661 細胞程序性壞死相關蛋白質表現之影響 .... 77 3.8 BSE 對 A549、H661 細胞轉移相關蛋白質表現之影響 ........................ 79 3.9 BSE 化學成分分析與主成分抗癌活性檢測 ............................................ 81 參考文獻 .................................................................................................................. 95. III.

(7) 表目錄. 表 1、BSE 及 Cisplatin 對不同細胞株處理 24 小時之毒殺效果 IC50 值 ........... 57 表 2、BSE 及 Cisplatin 對不同細胞株處理 48 小時之毒殺效果 IC50 值 ........... 57 表 3、BSE 及 Cisplatin 對不同細胞株處理 72 小時之毒殺效果 IC50 值 ........... 57 表 4、以 GC-MS 分析所得 BSE 之主要成分 ..................................................... 82. IV.

(8) 圖目錄. 圖 1、(A)正常細胞與(B)EGFR 突變之肺癌細胞的 EGFR 訊息傳遞路徑....... 10 圖 2、細胞死亡之型態變化: (a) Normal；(b) autophagic；(c) apoptotic；(d) and necrotic cells. .................................................................................................... 14 圖 3、細胞凋亡之基因訊息傳遞路徑 ................................................................... 17 圖 4、細胞壞死之基因訊息傳遞路徑 ................................................................... 21 圖 5、調控細胞走向壞死、凋亡之基因訊息表現傳遞路徑 ............................... 24 圖 6、細胞自噬之基因訊息傳遞路徑 ................................................................... 27 圖 7、玉檀木之整體外觀 ....................................................................................... 33 圖 8、本論文之研究架構 ....................................................................................... 37 圖 9、細胞計數盤 ................................................................................................... 41 圖 10、細胞凋亡標幟物分析 ................................................................................. 45 圖 11、BSE 於不同劑量、不同處理時間對 (A)A549、(B)H661、(C)H1299 肺癌細胞及(D)MRC-5 正常肺細胞存活率之影響 ........................................... 58 圖 12、Cisplatin 於不同劑量、不同處理時間對 (A)A549、(B)H661 肺癌細胞及 (C)MRC-5 正常細胞存活率之影響 ............................................................... 59 圖 13、A549 細胞經不同劑量 BSE 處理 12、24 及 48 hr 後之細胞型態改變情形 .......................................................................................................................... 60 圖 14、H661 細胞經不同劑量 BSE 處理 12、24 及 48 hr 後之細胞型態改變情形 .......................................................................................................................... 61 圖 15、A549 細胞經不同劑量 BSE 處理 48 hr 之生長週期分佈與細胞凋亡比例 ...................................................................................................................... 63 圖 16、H661 細胞經不同劑量 BSE 處理 48 hr 之生長週期分佈與細胞凋亡比例 ...................................................................................................................... 63 圖 17、以 BSE 不同濃度處理 24 hr 對 A549 細胞凋亡與壞死程度之影響(A) 0 μg/ml (Control), (B) 22 μg/ml, (C) 44 μg/ml, (D) 88 μg/ml, (E) Cisplatin 100 μg/ml ................................................................................................................. 64 圖 18、以 BSE 不同劑量處理 48 hr 對 A549 細胞凋亡與壞死程度之影響(A) 0 μg/ml (Control), (B) 22 μg/ml, (C) 44 μg/ml, (D) 88 μg/ml, (E) Cisplatin 100 μg/ml ................................................................................................................. 66 圖 19、以 BSE 不同劑量處理 24 hr 對 H661 細胞凋亡與壞死程度之影響(A) 0 μg/ml (Control), (B) 22 μg/ml, (C) 44 μg/ml, (D) 88 μg/ml, (E) Cisplatin 100 μg/ml ................................................................................................................. 67 圖 20、以 BSE 不同劑量處理 48 hr 對 H661 細胞凋亡與壞死程度之影響。(A) V.

(9) 0 μg/ml (Control), (B) 22 μg/ml, (C) 44 μg/ml, (D) 88 μg/ml, (E) Cisplatin 100 μg/ml ................................................................................................................. 68 圖 21、以不同劑量 BSE 於不同處理時間下對 A549 癌細胞遷移之抑制效應 .......................................................................................................................... 70 圖 22、以不同劑量 BSE 於不同處理時間下對 H661 癌細胞遷移之抑制效應 .......................................................................................................................... 71 圖 23、以不同劑量 BSE 處理 24 hr 對抑制 A549 細胞穿越 polycarbonate membrane 移行之效應 .................................................................................... 73 圖 24、以不同劑量 BSE 處理 24 hr 對抑制 H661 細胞穿越 polycarbonate membrane 移行之效應 .................................................................................... 74 圖 25、以不同劑量 BSE 處理 48 hr 對抑制 A549 細胞穿越 collagen 與 polycarbonate membrane 的侵襲效應 ............................................................ 75 圖 26、以不同劑量 BSE 處理 48 hr 對抑制 H661 細胞穿越 collagen 與 polycarbonate membrane 的侵襲效應 ............................................................ 76 圖 27、不同劑量 BSE 處理對 A549 肺腺癌細胞內壞死訊息因子表現之影響 .......................................................................................................................... 78 圖 28、不同劑量 BSE 處理對 H661 肺腺癌細胞內壞死訊息因子表現之影響 .......................................................................................................................... 79 圖 29、不同劑量 BSE 處理對 A549 肺腺癌細胞內移行與侵襲訊息因子表現之影響 .................................................................................................................. 80 圖 30、不同劑量 BSE 處理對 H661 肺腺癌細胞內移行與侵襲訊息因子表現之影響 .................................................................................................................. 81 圖 31、BSE 之 GC-MS 分析圖譜 ......................................................................... 82 圖 32、BSE 主要成分之化學結構圖 .................................................................... 84 圖 33、使用不同劑量之化合物 (A) -Guaiene, (B) Guaiol, (C) Trans-Caryophyllene, 及(D) -Eudesmol 處理 A549 肺腺癌細胞株 48 hr 後之細胞存活率 .................................................................................................. 86 圖 34、使用不同劑量之化合物 (A) α-Guaiene, (B) Guaiol, (C) Trans-Caryophyllene, 及(D) β-Eudesmol 處理 H661 肺腺癌細胞株 48 hr 後之細胞存活率 .................................................................................................. 87. VI.

(10) 玉檀木超臨界萃取物對人類肺腺癌細胞生長、移行與侵襲之抑制效果指導教授：王恒隆國立高雄大學生命科學系指導教授：洪哲穎義守大學營養學系學生：張榮哲國立高雄大學生命科學系碩士班. 摘要. 玉檀木是一種成長緩慢的硬木樹種，主要分佈於南美洲，其傳統療效為消風、熱、毒之功用，以及促使皮膚癒合、開胃、利脾、作為大腦興奮劑等，且有研究指出玉檀木具有抗發炎及抗癌等生理活性。本研究目的是利用體外細胞培養模式，研究以超臨界萃取之玉檀木萃取物 (BSE) 對人類肺腺癌細胞 A549、H661、H1299 與人類正常胚胎肺纖維細胞 MRC-5 的生長抑制作用及誘導細胞壞死之效應。實驗結果顯示，在處理時間為 48 hr 之條件下， BSE 對 A549、H661 和 H1299 細胞之毒殺 IC50 值分別為 43.7、44.6 和 53.3 μg/ml，且隨劑量增加，其抑制癌細胞生長的作用愈明顯；相對地，BSE 對 MRC-5 正常細胞的毒殺作用則較低，其 IC50 值為 89.7 μg/ml。再者，BSE 處理時間與癌細胞生長的抑制程度呈正相關，顯示其為一長效型抑癌劑。在細胞週期與細胞凋亡分析方面，BSE 會促使肺癌細胞停滯於 G2/M 生長期。進一步利用 Annexin-V-FITC/PI 進行細胞凋亡分析，實驗結果顯示 BSE 主要誘導細胞走向壞死。經西方墨點法進一步確認，BSE 會向上調節 TNF-α、RIP-1 與 RIP-3 等促程序性壞死蛋白的表現，並向下調節抗程序性壞死蛋白 caspase-8 的表現，證實 BSE 會誘導肺癌細胞走向程序性細胞壞死的路徑。此外，由細胞遷移、移行與侵襲試驗結果顯示，BSE 有抑制 A549、H661 細胞轉移之能力，並由西方墨點法進一步確認 BSE 的處理會抑制 MMP-2 及 MMP-9 促轉移蛋白的表現。綜合本研究的結果，由於 BSE 1.

(11) 對 A549、H661 細胞具有顯著的毒殺活性，且能有效抑制肺癌細胞的轉移，因此 BSE 具有作為抗肺腺癌藥物之潛力。. 關鍵詞：玉檀木、人類肺癌細胞、細胞壞死、移行與侵襲、化學成分分析. 2.

(12) Inhibitory effects of Bulnesia sarmientoi supercritical fluid extract on the proliferation, migration and invasion of human lung adenocarcinoma cells Advisor : Dr. Heng-Long Wang Department of Life Sciences National University of Kaohsiung Advisor : Dr. Jer-Yiing Houng Department of Nutrition, I-Shou University Student : Jung-Che Chang Institute of Life Sciences National University of Kaohsiung. Abstract. Bulnesia sarmientoi tree, which mainly distributed in South America, is a slow-growing hardwood species. The traditional use of B. sarmientoi can eliminate wind, heat, and anti-toxic function, as well as to promote skin healing, appetizers, spleen function, and brain doping. Previous studies indicate that B. sarmientoi has anti-inflammatory and anti-cancer activities. The goal of this study is to investigate the anti-proliferation effects of B. sarmientoi supercritical fluid extract (BSE) against A549, H661, H1299 human lung cancer cells and normal embryonic lung fibroblast cells MRC-5 in vitro, and its necroptotic property. The experimental results showed that the IC50 are 43.7, 44.6 and 53.3 μg/ml, repectively, for A549, H661 and H1299 cells under 48 hr treatment of BSE. In comparison, the IC50 is 89.7 μg/ml for MRC-5 normal cells. This implies that BSE has the cytototic specificity on the cancer cells. Additionally, a positive correlation existed between the treatment time and the inhibition of cell growth, indicating that BSE is a long-duration type of tumor suppressor agent. The flow cytometric analysis indicated that BSE could arrest cancer cells. in G2/M phase of the cell cycle. Furthermore,. the necroptotic effect of BSE on A549 and H661 cells was confirmed by annexin V-FITC/PI double staining. BSE induced lung cancer cells to the necroptosis pathway was further verified by Western blot analysis, since the pro-necroptotic TNF-α, RIP-1 and RIP-3 proteins were down-regulated and the anti- necroptotic caspase-8 was up-regulated.. 3.

(13) From the assays of wound healing, migration and invasion, BSE was proved to have a significant inhibitory activity on the migration of lung cancer cells. The results of Western blot analysis showed that the BSE treatment down-regulated the expression of MMP-2 and MMP-9. Taken together, since BSE possesses significant cytotoxicity on A549 and H661 cells and inhibitory activity on the metastasis of lung cancer cells, it may serve as a potential target for the treatment of lung cancer. Keywords: Bulnesia sarmientoi, human lung cancer cells, necroptosis, migration and invasion, chemical ingredient analysis. 4.

(14) 第一章前言. 1.1 肺腺癌 (Lung adenocarcinoma cancer) 由於科技的進步，人類享受了不少科技所帶來的便利性，不過在製造或使用高科技產物的同時，也產生了許多污染物質，直接或間接地對人類呼吸道、肺臟造成了傷害，例如工廠與汽機車所排放的廢氣塵埃及吸菸人口持續居高不下或是一些疾病引發(如肺炎、肺結核、慢性阻塞性肺病)等等因素(Alberg, 2003)，由於人類長期的暴露在這些污染物質之中，可能是導致肺癌(lung cancer)產生之原因。另外，除了上述這些環境因素之外，有肺癌家族史之親屬其肺癌發病率亦會較正常人高(Wu et al., 1996; Nitadori et al., 2006)。癌症是一種錯綜複雜的疾病，其主要特徵為細胞不斷的增生(不受控制的細胞一直分裂)、細胞轉型和跳脫正常的凋亡機制等因素，而這些因素亦造就了血管新生、細胞侵襲和轉移的發生。在過去二十年歐美國家罹患肺癌的人數有逐年增加之趨勢(Liu et al., 2005)，在台灣也是如此，根據行政院衛生署癌症登記相關資料統計，自西元 1982年起，癌症即躍居國人十大死因之首，迄今約三十餘年。由2012年行政院衛生署指出，肺腺癌則位居國人癌症十大死因之首(行政院衛生署, 2012)，其中肺癌在男性人口十大癌症死亡率佔居第二名，在女性人口死亡率的第一名 (Jemal et al., 2011)。而世界衛生組織(WHO)指出，人類罹患癌症的死亡率將增加19%，其中又以肺癌的死亡率增加最多，儘管近年來分子生物及醫療技術有相當大的邁進，但肺腺癌患者有高達85%以上之存活率無法超過五年(Erridge et al., 2007)。一旦發生轉移不僅是惡化的徵兆，也是一項治療棘手和患者死亡的主要原因。由於臨床之化學抗癌藥物及放射線療法對癌細胞治療一段時間後往往會產生抗藥性，是目前臨床治療上公認的最大困擾。因此，希望藉由分子生物學 5.

(15) 及天然藥物的發展與研究，讓我們對於非小細胞肺癌生長及細胞週期調控之機制更為清楚明朗，則有助於新的藥物及特異性治療方法之開發，並期許能降低或輔佐臨床治療藥物對正常細胞之傷害以避免副作用之產生。. 1.1.1 肺腺癌之分類與治療肺癌絕大多數源自於支氣管黏膜上皮，亦可源自於支氣管腺體或肺泡上皮。臨床上，肺癌在組織學與臨床表現上分為兩種不同的類型，可分為小細胞肺癌 (small-cell lung cancer, SCLC) 及非小細胞肺癌 (non-small-cell lung cancer, NSCLC)兩大類。目前的治療方式包括手術切除、放射線治療、化學治療、免疫療法 (主要是以輔助性治療，藉由刺激免疫系統活化以降低癌細胞的擴散) 及其他方式，例如服用止痛劑與鎮定劑來控制疼痛或支氣管擴張劑藉以舒緩呼吸困難之症狀等等。. (一) 非小型細胞肺癌通常比小型細胞肺癌常見，它的生長與擴散較緩慢，早期的肺癌可以施以開刀治療，且預後效果亦不錯，甚至完全康復之機會亦很高，即便是已進入中期，亦可以施用開刀或放射線治療，但是若到了第三期與第四期，則只能藉由化學治療。根據腫瘤細胞型態分為三種主要的類型，依據發生細胞種類而命名，有腺癌(adenocarcinomas, ADCs)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinomas, SQCCs)、及大細胞癌(large-cell carcinomas, LCCs)三種類型(Lau et al., 2000)。「腺癌」在男性肺癌中約佔 37%；而在女性肺癌中約佔 47%，至少可分為兩種類型，主要源自支氣管的一般腺癌和源自終末細支氣管或肺泡壁的「細支氣管肺泡癌」。一般腺癌較常出現於上肺葉，長在肋膜下而造成肋膜凹陷。與鱗狀細胞癌相較下，腺癌的病灶則位於周圍、較小且生長速度較為緩慢，但較早且較廣泛地進行轉移。在病理診斷上，腺癌可從明顯腺體成分之分化良好型，與乳頭狀病灶狀態，到偶而出現腺體之實心細胞團塊，而大約 80%腺癌之患者 6.

(16) 均含有黏蛋白（ mucoprotein ），且絕大多數為甲狀腺轉錄因子 -1 （ thyroid transcription factor-1; TTF-1）陽性。而細支氣管肺泡癌是腺癌的另一種特殊類型，約占所有肺癌的 1-9%。此腫瘤可發生在二十幾歲年輕人及老年人上，且男、女性分佈平均。於肉眼下可明顯觀察出，細支氣管肺泡癌為單一結節（single nodule）或多發性結節（multiple nodules），且幾乎都發生於肺臟的周圍部位，但有時病灶會互相併合，產生肺炎樣之情況。其特徵主要為高柱狀到立方上皮細胞，沿著肺泡中隔排列，並且形成乳頭狀結構而伸入肺泡腔。腫瘤細胞常常含有大量之黏蛋白性分泌物，大部分之腫瘤分化良好，通常可保持原有的肺泡結構。細支氣管肺泡癌包括分泌黏蛋白的細支氣管細胞、克拉拉氏細胞（Clara cell）、和第二型肺細胞（type II pneumocyte）(Yousem and Beasley, 2007)。另外，非黏液性之（nonmucinous）細支氣管肺泡癌較不具擴散能力，因此手術切除預後較佳。相反地，黏液性的（mucinous）細支氣管肺泡癌較易擴散及轉移，並形成衛星腫瘤（satellite tumor），甚至侵犯整個肝臟組織，外觀上看起來像大葉性肺炎（lobar pneumonia），因此較難以外科手術來達到根治之效果。鱗狀細胞癌的前身為原位癌（carcinoma in situ），而更早之前則為鱗狀化生（metaplasia）或異生（dysplasia）。在男性肺癌中約佔 32%；而在女性肺癌中約佔 25%，最常見於男性，且和吸煙史有密切相關性。鱗狀細胞癌通常發生於較大且較靠近中央的支氣管上，但約有三分之一的案例出現在肺部周圍。鱗狀細胞癌之特性則傾向於局部之蔓延，且轉移之速度與其他形態之肺癌相較下則較晚，但生長速度則比其他型態的肺癌來的快。在病理診斷上，分化良好（ well-differentiated ）之鱗狀細胞癌在顯微鏡下可觀察出「角質化（keratinization）」或「細胞間橋（intercellular bridge）」。角質化以鱗狀珍珠（squamous pearl）表現或細胞呈現明顯之嗜伊紅（eosinophilic）且緻密的細胞質。如果角質化不廣泛但很容易觀察出，就稱之為中等分化之（moderately 7.

(17) differentiated）鱗狀細胞癌。至於分化不良（poorly differentiated）之鱗狀細胞癌，則只有局部的角質化了。「大細胞癌」在男性肺癌中約佔 18%；而在女性肺癌中約佔 10%。大細胞癌可能是未分化而無法辨認之鱗狀細胞癌或腺癌，少部分是大細胞的神經內分泌癌（large cell neuroendocrine carcinoma）。在病理診斷上，「大細胞癌」有大的細胞核且具有明顯的核仁與中等體積的細胞質。而有些腫瘤亦含有細胞內黏蛋白，且會出現較多的多核細胞（巨細胞癌; giant cell carcinoma），有些有透明細胞（透明細胞癌; clear cell carcinoma），有些則具有明顯細長的組織學外觀（梭狀細胞癌; spindle cell carcinoma）。. (二) 小型細胞肺癌這類型肺癌較少見，其長得迅速且容易擴散轉移至其他器官，不易施以外科手術方式切除，主要多以化學療法合併放射線治療為主，不過遺憾的事是經治療緩解後，大多數病例會在兩年內會復發，而復發後對治療便會產生抗藥性。文獻指出，非小型細胞肺癌在肺癌中約佔了75-85％，大約有70%患者在被診斷出肺癌時大多都已屬晚期了(Greenlee et al., 2001; Shieh et al., 2010)，而且具有惡性的侵襲能力和轉移特性(Shivapurkar et al., 2003; Wang et al., 2009)，因此，診斷出肺腺癌之患者有高達85%以上，其存活率均無法超過五年(Erridge et al., 2007)。治療肺癌之化療藥物包括: Antimetabolites (gemcitabine)、Cisplatin、 Taxanes (paclitaxel、docetaxel)、Topoisomerase I inhibitors (irinotecan、topotecan)、 Vinca alkaloids (vinorelbine)等，而目前使用於治療非小型細胞癌患者之一線藥物主要為鉑類藥物，並結合紫杉醇類或細胞毒性劑(如:健擇注射劑或溫諾平注射劑)之輔助治療。Cisplatin與 Carboplatin 為目前最常使用的鉑類化學治療藥物，廣泛使用於治療各種癌症，包括肺癌。雖然Cisplatin 被廣泛地使用在許多癌症的治療上，但也具有嚴重的副作用，包括腎毒性、神經毒性、耳毒性、噁 8.

(18) 心與嘔吐，而結合鉑類與化學療法相互使用下，雖能提高肺癌患者之總體存活率與生活品質，不過一年之存活率仍然只有29%。主要是因為目前在使用鉑類這藥劑癌細胞往往會有抗藥性之產生(Rabik and Dolan, 2007)，因此，癌症患者在執行化學治療時常會衍發出抗藥性之問題而最終導致化療失效。. 1.1.2 上皮生長因子接受器「上皮生長因子接受器」(Epidermal growth factor receptors, EGFR)，其分子量約為170 kDa，是屬於人類EGFR 蛋白質家族的四個成員之一，在調節細胞增生、分化、發育與癌變發生上扮演其重要之角色(Zandi et al., 2007)。如圖1 所示，EGFR 受到上皮生長因子的刺激時，例如EGF 結合到EGFR，會活化 EGFR 並與EGFR 蛋白質家族的各種成員在細胞膜上形成不同的蛋白質雙聚體(dimer)，且會活化它位於細胞質內側的酪胺酸激酶活性，並引發一系列的訊息傳遞。在許多上皮細胞癌中，特別是非小型肺細胞癌，其EGFR 有過量表現之情形因而促使細胞生長不受控制(Klijn et al., 1992; Salomon et al., 1995)。然而，在EGFR 過度活化的肺癌細胞中經常會對化療藥物產生抗藥性，其中50%原因為EGFR 上產生第二個突變(T790M)(Kosaka et al., 2006)，使得癌細胞足以耐受抑制劑之治療。過去亦有研究指出，非小型肺癌細胞株具有多種抑癌基因及促進腫瘤成長蛋白之突變情形，例如：Epidermal growth factor receptor (EGFR)、 Kirsten-ras-2 (K-RAS)、Tumor suppressor protein 53 (p53)，造成非小型肺癌細胞生長週期失控，進而使細胞增生情形不受控制(Scagliotti et al., 2004; Malumbres and Barbacid, 2009)。根據國家衛生研究院的研究指出，台灣非小型細胞肺癌的病患中，EGFR 基因的變異幾乎都是集中發生於腺癌中，且比例遠高過於西方國家之病患。這也顯示上皮生長因子受接受器(EGFR)基因的突變不但可能與國人肺腺癌的發生有密切之關係，且本地發生肺腺癌的主要機制很可能與西方國家病患有所不同，是一種有本土特色的致癌機制。而由於目前的傳統治療方 9.

(19) 式有限，因此發展新式治療方法與更精確有效地治療早期肺癌診斷分子標記物，以減少非小細胞肺癌的發病率及病人的預後和有針對性的治療是當務之急。. 圖 1、(A)正常細胞與(B)EGFR 突變之肺癌細胞的 EGFR 訊息傳遞路徑 (曾嶔元, 2010). 1.2 天然藥物 (Natural medicines) 自古以來「福」、「祿」、「壽」、「喜」」便是人類孳孳不息所追求的人生目標，但前提是先保有健康的身體，才能作為一切事業成就的基礎。然而，邁入 21世紀之現代化社會，充滿著各種競爭與壓力，造成國人在生活上經常飲食失當、營養不均衡等等問題產生，而農工業之發展雖造福了人類，但所伴隨的環境污染和生態破壞，進而導致像是憂鬱症、肥胖、癌症、高血壓和心血管等等各種文明病的發生，其中癌症的罹患率始終居高不下。雖然世界各國衛生機構的研究人員及醫藥專家學者都不遺餘力地找出與癌症相關的預防、診斷、治療、及致癌因素等相關研究，但目前為止，尚未能找出一項理想的治療方法。而尋. 10.

(20) 找新的抗癌藥物是當前治療癌症的重大方向之一，然而要開發出一項新的抗癌藥物，更能有效的殺死癌細胞卻又不會傷害到正常細胞，實為一項艱鉅又困難的工作。在自然界中，天然產物包含植物、動物、海洋生物、微生物與礦物等，在現今各種人類文明病中，找尋其有效之藥物上提供了豐富的資源。自古以來，天然物是最好的藥物來源，比起合成藥有較低之副作用產生，合成藥主要是透過單一標的進而誘發體內代謝反應來產生藥效，因而亦伴隨產生不同之副作用，而天然藥物主要以多標的方式對身體產生綜合性之生理反應，不僅降低了副作用對身體亦較溫和，現代人崇尚健康自然，人們急於尋找回歸自然之天然藥物及療法，因此，從天然物中尋求新藥來防治及治療人類的疾病，已成為現今醫藥界之研究主流之一。過去美國國家癌症中心（National Cancer Institute, NCI）曾對世界各地的天然植物做過文獻的調查及由植物萃取物進行抗癌測試篩選，由其中分離、純化及化學結構鑑定其有效之主成分，活性化合物之合成與結構修飾，以及後續一系列之藥效評估、細胞毒性試驗、動物試驗及臨床試驗。目前從天然植物或民間草藥中已篩選出許多具有化學構造，且具備特異性作用機轉的抗癌藥物例如: 鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉醇(Taxol)、長春花生物鹼類藥物(Vinca alkaloids) 及喜樹鹼(Camptothecin) 等，分述如下: (一)鬼臼毒素(podophyllotoxin)主要是從八角蓮、桃兒七分離而得，是一種抗微管劑，亦有文獻指出其具有抗有絲分裂之活性(Gordaliza et al., 2004)，其主要作用於秋水仙鹼結合位置(Bohlin and Rosen 1996)，使得微管(microtubule) 之結構去穩定化，造成細胞生長受到抑制，並促使細胞週期停滯於M 期，最終導致細胞走向凋亡。但因為鬼臼毒素是劇毒，其本身不能作為抗癌藥物，但是一些半合成之衍生物，包括Etoposide (VP-16, 2)、Teniposide 和 Etopophos，在臨床上被使用於治療多種癌症，包括非小型細胞肺癌、睪丸癌、淋巴癌和卡波西氏肉瘤(Jordan et al., 1998; Budman, 1996; Greco and Hainsworth, 1996)。 11.

(21) (二)天然抗癌藥物紫杉醇(Taxol)是從紅豆杉之樹皮中所萃取出(Wani et al., 1971)，該化合物是全球首個花費數十億美元的抗癌藥，主要用來治療人體組織增生性之疾病。紫杉醇主要是以微管為目標的抗有絲分裂之藥物微管穩定試劑，能促使癌細胞有絲分裂停止並誘導其細胞走向凋亡(Samadi et al., 2011)。目前在化療上已被廣泛應用於作為肺癌、卵巢癌和乳癌的第一線藥物(Gao et al., 2012; Liu et al., 2011; Mauri et al., 2010)。 (三)長春花生物鹼類藥物(Vinca alkaloids)主要是從玉黍螺屬之植物長春花（玫瑰紅長春花、洛柯花或稱阿模楷靈碱花）中所萃取出來的一類藥物，包括: vinorelbine (VNR)、vincristine、vinblastine、vindesine、和 vinxaltine，其抗癌機轉主要是當細胞進行有絲分裂時，先抑制其微小管次體的聚合，進而抑制癌細胞有絲分裂時紡綞體的形成。其中， VNR 是半合成的去甲基長春花鹼系列中的第一個化合物，這種新的化學結構使得VNR 與其他之長春花鹼系藥物有所不同，並有其獨特的臨床特點。過去亦有文獻指出VNR 結合Cisplatin 可作為第一線治療晚期和轉移性之非小型細胞肺癌，其造成肺癌細胞凋亡之主要機制是透過增加Bax 和Bcl-xs 之蛋白表現，並減少Bcl-2 和Bcl-xL 蛋白之表現，且促使cytochrome C 之釋出進而活化caspase-9 和caspase-3(Sen et al., 2005)。在非小型細胞肺癌患者組織中亦能觀察到磷酸化之Bcl-2 蛋白及caspase-8、9 和3之活化表現(Kosuke, 2003)。 (四)喜樹(Camptotheca acuminate) 屬於紫樹科(Nyssaceae)，1957年被美國癌症中心(NCI)研究抗癌植物多年的科學家 Jonathan Hartwell 博士於1000 種乙醇的植物萃取物中進行抗癌活性化合物之篩選，其結果發現喜樹鹼 (Camptothecin, CPT)具有高度的活性。亦有文獻指出，喜樹鹼對多數種腫瘤細胞具有毒殺效果，在動物模式中亦有讓腫瘤變小之效果(Kehrer et al., 2001)，其作用機制主要是對於細胞中第一型 DNA 拓樸異構酶(DNA topoisomerase I) 具有抑制作用(Hertzberg et al., 1989; Muggia and Burris, 1994; Slichenmyer et al., 12.

(22) 1993)，並誘導其細胞週期停滯在S期且伴隨DNA 損傷之累積，進而讓細胞走向凋亡(Jones et al., 2000; Takahashi et al., 2011; Zhou et al., 2002)。根據過去研究指出，從天然物萃取出之中草藥期有效成份抗防癌的可能機制有以下幾點: (1)對於腫瘤具有直接毒殺作用(Martin, 2006) (2)具有清除致癌物質(如自由基)(Talalay and Fahey, 2001) (3)具有抗發炎之功效(Surh et al., 2001) (4)具有免疫調節之作用(Liou et al., 2004; Chan et al., 2007) (5)抑制腫瘤之血管新生(Lamy et al., 2002; Tosetti et al., 2002) (6)抑制癌細胞轉移(metastasis)或侵襲(invasion) (Rajapakse et al., 2007; Sina et al., 2009). 1.3 細胞死亡之途徑細胞死亡在生物的生理或病理上扮演重要之角色，一方面可調控胚胎發育、組織分化並維持器官的恆定等，另一方面，亦參與了一些病理過程，如神經退化性疾病、病毒感染、自身免疫性疾病及腫瘤等。依照細胞走向死亡之過程中是否會受到細胞內訊息之調控，即可分為程序性細胞死亡(Programmed cell death, PCD) 及非程序性細胞死亡(Non-programmed cell death, NPCD)。在過去，生物細胞死亡方式被以型態上分成三類：細胞凋亡(Apoptosis)、細胞壞死(Necrosis) 和細胞自噬(Autophagy)(圖2)(Edinger and Thompson, 2004)。直到近期， Degterev 等人(2005)通過高通量的篩選方法，找出了一種抑制由細胞死亡因素所引起的壞死化學小分子necrostatin-1 (Nec-1)。這種小分子能夠抑制Fas/TNFR 引起的壞死，以專一性地阻斷細胞壞死，但對細胞凋亡沒有抑制作用。如同caspases 抑制劑之於細胞凋亡，其研究中也找出抑制劑可以專一. 13.

(23) 性地抑制細胞壞死，代表細胞中確實有引發壞死的訊號蛋白存在，這證明細胞壞死也能藉由特定且精確之細胞訊息傳遞路徑來誘導。雖然目前尚未並未釐清 Nec-1 的作用目標，但此抑制劑的發現亦確認細胞壞死是具有程序性的死亡途徑，而這種死亡方式被他們命名為”細胞程序性壞死(Necroptosis)”。目前發現在細胞凋亡被抑制情況下（抑制 caspase 活性或 caspase-8 突變）會活化死亡受器途徑，使細胞走向非細胞凋亡(Degterev et al., 2005; Holler et al., 2000)。但不論是何種方式，每個細胞死亡之方式都具有一定之機制及其特定之蛋白表現，甚至會互相交互影響進而促使整個死亡路徑之流程。. 圖 2、細胞死亡之型態變化: (a) Normal；(b) autophagic；(c) apoptotic；(d) and necrotic cells. (Edinger and Thompson, 2004). 1.3.1 細胞凋亡 (Apoptosis) 細胞凋亡是指細胞藉由特定的訊息路徑並有計劃性地邁入死亡之方式 (programmed cell death)，亦就是必需經由一連串的基因與訊息的傳遞，以及凋亡相關蛋白質的活化(Hengartner, 2000; Vaux and Strasser, 1996)。細胞凋亡參與 14.

(24) 自然界中多細胞生物的生理調控機制，包含了在生物的發育(development)、細胞之衡定(home-ostasis) 、清除過老或異常的細胞及免疫反應等等上扮演其重要的角色(Steller, 1995; Jacobson et al., 1997; Wood et al., 2000)。而細胞凋亡一詞在希臘文中意指花瓣或樹葉從枝頭掉落或凋零之狀態。於1956年，由英國的病理學家在觀察組織切片的時，觀察出其某些死細胞具有以下之特徵，即細胞萎縮(cell shrinkage)、細胞膜皺縮(cell membrane blebbing)、核內染色質縐縮 (chromatin condensation) 後並聚縮在核膜邊緣、染色質在核中呈現邊緣化現象，同時細胞內的DNA 被核酸內切酶以180~200 bp 為單位切成小片段並可在 DNA 電泳膠上形成DNA 規則片段化的階梯狀(DNA ladder)(Brown et al., 1993; Samali et al., 1996)，於是細胞漸漸分裂成一個個形狀完整的小泡，裡面包含著分裂後的部份核仁、細胞質等，此即為“凋亡細胞小體” (Bodnarchuk, 2003)。而在正常組織中，這些凋亡細胞小體會被鄰近細胞或吞噬細胞吞噬而清除掉，因此可避免發炎反應及減少組織的損害(Otsuki et al., 2003)。此現象即被命名為細胞凋亡。細胞凋亡主要過程依時間可分為三個主要階段(Kroemer, 1997)：第一階段為初始階段(initiation phase)，在此時期之細胞由於受到外界環境刺激，經由細胞膜上或細胞內之不同接受器接收並且傳遞訊號給細胞，促使細胞啟動死亡訊號。第二階段為作用階段(effector phase)，此階段中包括許多蛋白質及核酸內切酶的活化(Packard and Komoriya, 2008)，其酵素與受質之間的相互作用進而造成細胞外觀上之變化及DNA 的裂解，此刻細胞會啟動正反兩方面與凋亡相關路徑的活化，整合後進而決定細胞最終是否進入細胞凋亡或其他路徑，其中 Bcl-2 家族蛋白的調節以及caspase 3、9是否活化扮演很重要之角色。第三階段為降解階段(degradation phase)，此為進入不可逆之時期，此時之細胞已因不同部位的受損而開始出現許多凋亡特有的特徵，進而被鄰近細胞經由吞噬作用而清除。在活體內，『細胞凋亡』扮演著細胞數目恆定(homeostasis)的重要角色。 15.

(25) 目前臨床使用之抗癌藥物，有許多是針對細胞凋亡路徑產生誘導作用而達到抗癌作用，因此已成為抗癌藥物重要的分子機轉(Tolcher, 2002; Ferreira et al., 2002; Schuchmann and Galle, 2004; Kundu et al., 2005)。如圖 3 所示，細胞可經由兩種路徑進行細胞凋亡，分別是內生性路徑與外在性路徑 (Yoon and Gores, 2002) 。『內生性路徑』又稱為『粒腺體路徑 (mitochondria pathway)』，當細胞內部受到損害時(例如氧化性傷害)，粒腺體中的 cytochrome c 會釋出至細胞質中與細胞質之分子 Apaf-1 結合，進而將 procaspase-9 活化為 caspase-9，進而活化下游之 caspases，包括 caspase-3、-6 及 -7，以引起細胞凋亡(Hengartner, 2000; Sun et al., 2004)。『外在性路徑』又稱為『死亡接受體路徑(death receptor pathway)』，是經由活化死亡接受體，例如 Fas(CD95Apo-1)及 TNF 接受體(DR3、DR4、TNFR1)的活化(Nagata and Suda, 1995; Kondo et al., 1997)，將訊息傳入細胞內而活化 caspase-8，再進一步活化 caspase-3，造成細胞凋亡(Enari et al., 1998)。另外，活化的 caspase-8 亦可以裁切 Bid 使之變成 tBid 使訊號傳向內在途徑促使粒線體釋放出 cytochrome C。 Bcl-2 family 是促進或抑制細胞凋亡的重要調控者， Bcl-2 家族中 Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, Nr13 和 A1 等，都是細胞凋亡的抑制蛋白。然而另一些基因，如 Bad, Bak, Bax, Bik, Bid 和 Bcl-XS 等，則會引起細胞凋亡。藉由細胞凋亡抑制蛋白與細胞凋亡促進蛋白彼此間的相互結合、作用與協調，作為是否進行細胞凋亡的重要關鍵(Coultas and Strasser, 2003)。另外，p53 在細胞凋亡過程中亦扮演十分重要的角色，其可經由調控促凋亡分子 bax 之表現，促使細胞走向粒線體凋亡路徑而死亡，因此調控 Bcl-2 家族及 p53 之活性表現，也是抗癌藥物的一項重要機轉(Yu and Zhang, 2003; Ghobrial et al., 2005)。. 16.

(26) 圖 3、細胞凋亡之基因訊息傳遞路徑擷取自（Cell Signaling Technology, http://www.cellsignal.com/）. 1.3.2 細胞壞死 (Necrosis) 細胞壞死一般被認為是因外在環境造成的創傷或生理上嚴重的改變所造成，如局部缺血(ischemia)、缺氧(hypoxia)、血糖過低(hypoglycemia)、補體攻擊、外來毒素(toxin response)或活性氧代謝物質(reactive oxygen metabolites)之暴露、劇烈溫度改變及營養缺乏等(Walker et al., 1988; Nicotera et al., 1999b)，所導致的被動性細胞死亡，另外在諸多有關神經退化(neurodegenerative)之疾病， 17.

(27) 例如阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、跳舞症(Huntington’s disease)、肌萎縮側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 及癲癇(epilepsy)，均與細胞壞死具有相關性(Price et al., 1998)。因此，細胞壞死對於人類健康的影響甚鉅，而此種機轉會釋放出一些發炎物質而引起局部發炎反應，進而傷害到鄰近的細胞或組織。細胞壞死過程中没有基因調控或參與，且不需蛋白質重新合成與能量耗費，也不需任何恆定機制的調控(Syntichaki and Tavernarakis, 2002)細胞常呈現灶狀、成群聚集，且細胞會呈現下列型態上之變化：細胞腫脹、細胞核膜破裂與皺縮、DNA 沒有規律地裂解成碎片、細胞粒線體腫脹、內質網產生水泡、高能磷酸代謝減緩使合成受阻或停止，並使得細胞膜或胞器膜上負責調控水份和電解質運輸的蛋白質無法運作，同時細胞也會因為水份聚積而細胞膜破裂而造成離子疏失(Kroemer et al., 2005)。最後整個細胞崩解、破碎，無凋亡小體形成而破裂的整個細胞所釋出的趨化性細胞內容物會去清除這些細胞碎片並殘害鄰近細胞，發炎反應就是因此所引起的，並且造成組織中多種細胞同時被殺死(Van Cruchten and Van Den Broeck, 2002)。另外，細胞壞死亦會同時發生在一群細胞，可分為早期與晚期兩個時期。在細胞壞死早期，細胞內之胞器會脹大，細胞膜也會破裂；到了晚期細胞膜也發生破裂(Searle et al., 1982; Matsuda et al., 1996; Nicotera et al., 1999a)。由於細胞發生破裂，因此會釋放出一些發炎物質而引起局部發炎反應，傷害到鄰近的細胞或組織。. 1.3.3 細胞程序性壞死 (Necroptosis) 細胞壞死在過去被認為是一種被動之過程(Evan and Littlewood, 1998)，通常被認為是意外發生或是因為細胞受到生理上嚴重改變，如局部缺氧、能量缺乏、ROS 生成或劇烈溫度變化等因素而造成的被動性細胞死亡(McConkey,. 18.

(28) 1998)，或者是一項不受訊息調控且無法修復的細胞死亡型態，屬於被動的細胞死亡，而不是細胞自殺(Alison and Sarraf, 1994; Hawkins et al., 1972)。而主動與被動的關鍵點，主要是取決於細胞消耗ATP 的程度(Desagher and Martinou, 2000; Nicotera et al., 1998)，當細胞缺乏足夠ATP 時，細胞凋亡相對於壞死的比率則有降低的現象。近期已有愈來愈多的研究證實，部分的細胞壞死是有受到胞內訊息調控的程序性細胞死亡(Degterev et al., 2005; Yang et al., 2007; Liu et al., 2008)，這樣的發現證實並非所有的細胞壞死都是屬於非程序性之細胞死亡。過去已有文獻指出，許多不同的細胞刺激也可以誘發細胞壞死的產生，例如: Tumor necrosis factor (TNF)刺激某些癌細胞、IFN-γ、dsRNA、ATP消耗、與營養缺乏，且透過某些已經確定的途徑導致細胞死亡(Vanden Berghe et al., 2007)。這些可以被誘發細胞壞死被認為是一種可以調控且具有程序性的細胞死亡(Festjens et al., 2006b)。細胞壞死可以再詳細區分成以下幾種不同的模式： (1) Oncosis (Majno and Joris, 1995)、(2) Pyroptosis (Cookson and Brennan, 2001)、(3) Necrapoptosis (Lemasters, 1999)及 (4) Necroptosis (Degterev et al., 2005)。Oncosis 被定義為細胞腫脹、胞內之胞器腫脹、胞膜有大水泡與細胞膜通透性增加 (Majno and Joris, 1995)。Oncosis 更可以因毒物干擾ATP 合成、或是細胞內能量被大量消耗，最終細胞膜的離子通道失去功能而引起一連串之反應(Majno and Joris, 1995)。 Pyroptosis 通常是細胞發生在細菌的感染如被沙門氏菌(Salmonella)與志賀氏菌(Shigella)感染進而引起之發炎反應(proinflammatory)，最終會導致細胞膜脹破並且釋放出一些促發炎 (inflammatory) 的細胞激素 (cytokine)(Fink and Cookson, 2005) 。過去文獻中也發現細胞中 caspase-1 對於感染沙門氏菌 (Salmonella)與志賀氏菌(Shigella) 造成巨噬細胞的細胞壞死有關(Thornberry et al., 1992; Kuida et al., 1995; Li et al., 1995)。而Pyroptosis 亦是唯一一種細胞死亡需要caspase-1 蛋白的參與之死亡方式(Brennan and Cookson, 2000; Chen et 19.

(29) al,. 1996; Hersh et al., 1999; Hilbi et al., 1997; Hilbi et al., 1998)。Necrapoptosis 則是假設細胞在開始走向死亡時是經由共同路徑，而最後會藉由其他因素來決定細胞是走向細胞凋亡或是細胞壞死，例如細胞內ATP 濃度偏低時，細胞會走向細胞壞死，若是ATP 濃度偏高或是維持在平衡狀態，細胞則會走向細胞凋亡(Lemasters, 1999)。細胞壞死是人體病變中的一種普遍特徵，但不像細胞凋亡現象被認為是細胞對外界傷害或是其他因素影響的一種被動反應，但當沒有足夠血液到達大腦時，也就是處在發生缺血性腦傷害時，細胞壞死將會發生。過去數十年來，許多科學家及一些相關研究人員發現並詳細了解細胞凋亡的過程與其重要之機制，但在過程中，亦有一些奇特之現象發生，例如非凋亡的程序性死亡-細胞壞死，在過去此現象被普遍認為是純屬突發性的，但近年來關於具有壞死特徵的非凋亡性細胞死亡的研究與理論逐漸增加而被到高度重視。 Necroptosis 被發現出是一種新形式的細胞程序性死亡，並且與細胞凋亡不同(Christofferson and Yuan, 2010)，是由 Degterev 等人(2005)所定義，意指細胞在被誘導產生細胞凋亡時，其細胞凋亡機制被阻斷後，細胞進而走向細胞壞死，例如當死亡受體(Fasl)與死亡受器(Fas)結合後，細胞凋亡的機制被凋亡蛋白酵素抑制劑阻斷(Khwaja and Tatton, 1999; Matsumura et al., 2000; Vercammen et al., 1998a; Vercammen et al., 1998b)，或是凋亡蛋白酵素-8 (Caspase-8)及 FAS-associated death-domain protein (FADD; 腫瘤壞死因子受體)發生突變 (Chan et al., 2003; Degterev et al., 2005; Holler et al., 2000; Kawahara et al., 1998)，因而導致細胞走向非細胞凋亡的細胞死亡。如圖 4 所示，因為 Necrapoptosis 是可以被引發的，被視為一種具有程序性的細胞壞死(Programmed necrosis)死亡途徑。此發現推翻了以往被認定是意外發生或者是一項不受訊息調控且無法修復的細胞死亡型態，證實並非所有的細胞壞死都是非程序性細胞死亡。在型態上 Necroptosis 有類似 Necrosis 的特徵，可見細胞腫脹、細胞胞器(尤其是粒線 20.

(30) 體)膨脹、急性的粒線體功能喪失、細胞膜通透性增加、壞死細胞內大量產生 ROS 和缺乏 DNA 斷裂(Festjens et al., 2006b; Wu et al., 2012; Zong and Thompson, 2006)。因此 Necroptosis 被歸類為程序性細胞壞死(programmed necrosis)，雖然 Necroptosis 在細胞形態學上與 necrosis 部分相同，但與 Necrosis 最大不同處在於細胞染色質的凝聚、細胞嚴重的空泡化、細胞膜初期失去完整性並伴隨許多 Autophagosomes(Han et al., 2009; Degterev et al., 2005; Hitomi et al., 2008; Han et al., 2007)，而細胞壞死會同時發生在一群細胞，也可分為早期與晚期兩個時期。在細胞壞死早期，細胞內之胞器會脹大，細胞膜也會破裂；到了晚期細胞膜也發生破裂(Searle et al., 1982; Matsuda et al., 1996; Nicotera et al., 1999a)。由於細胞發生破裂，因此會釋放出一些發炎物質而引起局部發炎反應，傷害到鄰近的細胞或組織。. 圖 4、細胞壞死之基因訊息傳遞路徑擷取自（Cell Signaling Technology, http://www.cellsignal.com/）. 21.

(31) 一般來說，TNF-α 與 TNFR-1 結合活化後會透過 FADD-caspase-8 促使細胞走向細胞凋亡，並藉由 RIP-TRADD (tumor necrosis factor receptor (TNFR) 1 – associated death domain)活化 NF-κB (如圖 5)。但當細胞內細胞凋亡之功能喪失時，其誘導細胞走向 Necroptosis 之機制，主要是在 TNF-α 的刺激下與 TNFR-1 相互結合且迅速形成一聚體，而 TNFR-1 會吸引細胞質的 RIP-1 直接結合，並可間接與 Fas 和 TRAIL 結合，中間需與 FADD 作為橋樑，而這幾項死亡接受器聚集在一起就形成了複合物 I (Complex I)，藉由活化 RIP-1 調控下游訊息傳遞路徑(Zheng et al., 2006)。此時在胞漿中的 RIP-3 蛋白會與 RIP-1 蛋白結合並形成複合物 II (Complex II)，而複合物 II (Complex II)中還有 Fas 相關死亡結構域蛋白(Fas associated protein with death domain，FADD)，而 FADD 可以召募 Caspase-8 蛋白之聚集而導致自我活化，亦活化了外源性凋亡之路徑，同時亦會將 RIP-1 與 RIP-3 降解，進而阻斷 Necroptosis 的發生，以確保凋亡路徑之進行。相反地，若將 Caspase-8 蛋白抑制，Necroptosis 便能持續地進行。 Necroptosis 需要 RIP-1 的活化，但不需要活化 NF-κB 及細胞凋亡訊息 (Holler et al., 2000)，活化的 RIP-1 會移接到粒線體中，進而破壞 ADP-ATP translocase (ANT) 與 cyclophilin D 之結合，造成 ANT 活性受到抑制，促使 ATP/ADP 比例下降並增加細胞內活性氧化物的生成(Reactive oxygen species , ROS)，且抑制細胞色素 c (cytochrome C)的釋放，因而促進細胞壞死(Kim et al., 2007; Temkin et al., 2006)。 RIP-1 也可經由活化 Rac1-NADPH oxidase complex 增加細胞內 ROS 的含量及活化 JNK (c-Jun N-terminal Knase)來執行 Necroptosis(Kim et al., 2007)。 Necroptosis 進行死亡之過程中亦會活化細胞自噬(Autophagy)，但細胞自噬只在特定細胞株中執行死亡的功能(Degterev et al., 2005)。在其他過去文獻中也指出， phospholipase A2 (PLA2), lipoxygenase (Festjens et al., 2006a) 和 acid sphingomyelinase (Thon et al., 2005) 的活化亦與 Necroptosis 進行死亡有相關 22.

(32) 性。最近亦發現細胞壞死會參與某些病理狀況，它不僅有助於大腦、心臟和腎臟的缺血性損傷(Degterev et al., 2005; Smith et al., 2007; Linkermann et al., 2012)，亦能促使癌細胞走向死亡並提高腫瘤細胞對抗癌治療的敏感性(Horita et al., 2008; Bonapace et al., 2010; Ouyang et al., 2012)。而癌細胞由於出現抗藥性直接或間接地提高癌症病人的死亡率，主要是目前缺乏能有效抑制抗藥性癌細胞的化療藥物，在傳統的抗癌藥物，不管他們的目標或機制為何，通常是誘導細胞走向凋亡為主，初期，癌細胞被誘導走向凋亡是極為敏感的，但最終由於細胞凋亡調節機制的失調、抗凋亡蛋白的大量表現和促凋亡訊號的缺陷，進而造成癌細胞產生抗藥性(Longley and Johnston, 2005; Pommier et al., 2004; Simstein et al., 2003)。因此，發展新藥和方法用來治療具有抗藥性之癌細胞來挽救癌症病患之生命可說是當務之急(Hu et al., 2007)。而目前有研究指出，引誘細胞走向 Necroptosis 或許可以成為治療抗細胞凋亡及抗藥性癌症的新方法 (Han et al., 2007)，細胞凋亡誘導劑在抗藥性癌細胞療法上被廣泛的討論，這確實是一項合理的假設，如果能透過一條非凋亡途徑的機制來殺死癌細胞，便有可能防止傳統治療上常遇到癌細胞產生抗藥性的可能性(Han et al., 2007)，而 Necroptosis 便是一種非細胞凋亡的重要例子，而癌細胞在細胞壞死上感受性高，對於癌細胞來說更是一項弱點。因此，細胞壞死活化劑在癌症化療上可能有潛在幫助，特別是對一些具有抗藥性之癌細胞(Hu et al., 2007)，促使細胞走向壞死尤其可抵抗癌細胞內因化療藥物導致抗藥性之相關蛋白如 P-glycoprotein、Bcl-2、和 Bcl-xL 蛋白之表現(Han et al., 2007)。目前細胞壞死已經使用在臨床治療上，其主要有兩種方式：(1)利用光動力學療法(photodynamic treatment, PDT)，促使癌細胞內部產生大量 ROS；(2)利用烷化劑(alkylating DNA damaging agents)傷害癌細胞 DNA，進而引起細胞壞死。第一種透過細胞壞死治療癌症的方法，光動力學治療法可以選擇對象，且可避 23.

(33) 免傷害到其他周邊之正常組織，其方法主要是外加 porphyrines、chorines、 phthalocyanines 等光感性分子到目標細胞上(Uehlinger et al., 2000)，利用雷射光激發這些光感物質，進而造成癌細胞內產生 ROS，導致細胞死亡(Golab et al., 2003; Miccoli et al., 1998)。如果光感物質位於細胞膜上，其細胞膜會整個失去完整性，誘導細胞死亡(Fabris et al., 2001; Hsieh et al., 2003)，一旦光感物質位於溶酶體膜上，產生的 ROS 就會引起溶酶體破裂，因而釋放出蛋白酶，導致細胞壞死(Reiners et al., 2002)。若光感性物質作用在粒腺體上，會引起粒腺體膜電位喪失，阻止 ATP 之產生，造成細胞壞死(Chiu and Oleinick, 2001)。第二種透過細胞壞死治療癌症的方法，即是利用烷化劑加上一個甲基或是乙基在 DNA 的氮鹼基，造成 DNA 複製出錯，DNA 一旦複製出現錯誤，就會造成 Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)蛋白的活化，進行 DNA 的修復作用，若過度活化 PARP，便會大量消耗細胞質內的 NAD+，並抑制細胞內 ATP 合成，因而引起細胞壞死 (Ha and Snyder, 1999)。. 圖 5、調控細胞走向壞死、凋亡之基因訊息表現傳遞路徑 (Lee et al., 2012) 24.

(34) 1.3.4 細胞自噬 (Autophagy ; Type II cell death) 細胞自噬(autophagy) 亦被稱為『第二型的細胞計畫性死亡』是真核細胞分解物質機制之一，又稱做「計畫性壞死」(Programmed necrosis)，主要是透過基因調節分解胞內蛋白質及受損胞器，或因應外來壓力如:飢餓、UV 等，以促進細胞存活並維持生合成平衡而非外力所造成(Amaravadi et al., 2011)。確保細胞的重要功能繼續運作，細胞會吞噬分解自身胞器及蛋白質以提供存活之能量，使其渡過惡劣環境，而過度的細胞自噬結果也會導致細胞走向凋亡(Ogawa et al., 2005)，其型態和細胞凋亡(Apotosis)與壞死(Necrosis)皆不相同(Edinger and Thompson, 2004)。細胞凋亡與自噬目前還未有明確的區分，其發生機制並不是完全獨立，毫不相關，因為帕金森氏病(Parkinson’s Disease; PD)中的多巴胺神經元細胞不僅可以藉由細胞凋亡，而且還可透過細胞自噬來發生降解。細胞自噬(autophagy)為細胞中蛋白質分解之機制，其在細胞死亡中所扮演的角色仍有許多爭議，在過去的研究結果顯示，細胞自噬與細胞凋亡是互相調控的，細胞凋亡機制若處在被抑制時，細胞就會走向自噬(Shimizu et al., 2004)，相反的，若細胞自噬機制被抑制時，則會走向凋亡(Boya et al., 2005)。目前臨床使用之抗癌藥物，有許多是針對細胞凋亡路徑產生誘導作用而達到抗癌作用，但總有些病患預後總是不符合期待，主要是癌細胞會產生抗藥性之問題，在先前研究亦有指出，細胞自噬在化療處理反應下可被誘導，且已被認為有促進細胞抗藥性的一項重要的機制(Amaravadi et al., 2011)。因此，細胞自噬機轉對癌細胞而言是抑制致癌性或是幫助癌細胞渡過不適環境的救援機制仍然需要深入探討。細胞自噬的過程中，細胞質中會先形成雙層膜的自噬小胞(Autophagosome)，包覆胞器或蛋白質後與溶酶體(Lysosome) 融合，產生單層膜的自噬溶小體(Autolysosome)，藉由溶酶體內(Lysosome)水解酵素分解胞器或蛋白質成小分子物質，其中某些小分子物質如胺基酸則可以 25.

(35) 回收利用成為材料，如此完成自噬作用(Yoshimori, 2004)。如圖6 所示，細胞可經由多種路徑進行細胞自噬，目前以Class I PI3K/AKT 活化mTOR 為研究調控細胞自噬最為廣泛之傳遞路逕，主要是當受體與細胞膜上的接受器結合時，會誘導Class I PI3K/AKT 活化，再由PI3K 去活化下游的AKT，於是AKT 就會去抑制TSC1/2 進而間接活化mTOR，便可抑制細胞走向自噬。另外，當細胞養分缺乏時也會活化class III PI3K 並透過p150 與細胞膜結合，亦會與beclin-1 結合後，去活化下游的ATG conjugation pathway。當細胞進行自噬時，形成包覆胞器與蛋白質的雙層模便會有beclin-1 的聚集，因此，細胞在早期的自噬 beclin-1 數量會往上升，藉此可判定細胞是否自噬的重要指標 (Juhasz and Neufeld, 2006) 。此外細胞自噬引發時需要兩種 ubiquitin-like conjugation systems 來誘發自噬小體形成。利用Atg7 及Atg10 的作用，將Atg12 接合到 Atg5，形成Atg-5-Atg12 複合蛋白，另一方面藉由Atg4 與Atg7，使LC3 與PE (phosphatidylethanolamine)連結，在此同時LC3 將會被切成小分子LC3II，使形成LC3-II-PE，由這兩套蛋白系統的幫助之下，將延伸雙層膜構造形成細胞自噬體(autophagosome)，當與溶小體融合前，Atg-5-Atg12 複合蛋白由細胞自噬體分離，留下LC3-II-PE 與溶小體進行最後的融合(Levine and Deretic, 2007; Maiuri et al., 2007)。其亦是目前研究細胞自噬對自噬小體產生之主要指標 (Tanida et al., 2005)。. 26.

(36) [. 圖 6、細胞自噬之基因訊息傳遞路徑擷取自（Cell Signaling Technology, http://www.cellsignal.com/）. 1.4 癌細胞移行(migration)與侵襲(invasion)作用癌細胞轉移(metastasis)一直是癌症研究之重要領域，當癌細胞在體內生長時，並不是單獨生長的，而是常會與周邊的正常組織交互作用，以調節一切行動所需，並且會增加本身的惡性程度，這些與腫瘤有關係的組織包括有:基質纖維組織母細胞(stromal fibroblasts)、具滲透性的免疫細胞(infiltrating immune cells)、血液及淋巴組織(blood and lymphatic vascular networks)、和細胞外基質 (extracellular matrix)，目前觀察到有許多癌細胞(尤其是肺腺癌)有遠端轉移，破壞肝、腦等維生器官，因而導致病患死亡的現象，癌細胞亦可以藉由改變周圍 27.

(37) 的正常細胞或者改變其型態來產生其所需的生長因子(growth factor) 、細胞激素(chemokines) 、或者基質水解酶(matrix-degrading enzyme)，以增加本身生長及侵犯能力，如 VEGF、PDGF、EGFR、NF-κB、TNF-α、及 MMPs 等(Joyce, 2005)。在癌細胞轉移過程是涉及許多生化反應與過程，包括細胞移行、細胞侵襲、表面附著特性(Woodhouse et al., 1997)和細胞外基質降解(extracellular matrix)等特性(Stetler-Stevenson et al., 1993)，最終產生遠端轉移(Arvelo and Cotte, 2006; Imanaka et al., 2008)。癌細胞的侵襲能力是藉由分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs) 、組織蛋白酶 (cathepsins) 和纖溶酶原激活物 (urokinase-type plasminogen activator, uPA)(Legrand et al., 2001)等具降解細胞外基質(ECM)及基底膜的蛋白酶，藉此通過細胞外基質的薄壁，進入血管或淋巴循環系統，造成遠端轉移(Duffy and Duggan, 2004; Itoh and Nagase, 2002)。其中又以 MMP 為最，MMP 是中性、與 Zn2+結合的蛋白質分解酶，剛開始是以 proenzyme 的形式被釋放至細胞外，當 N 端水解時才具有活性(Westermarck and Kahari, 1999; Yoon et al., 2003)。許多研究皆提到 MMPs 與體內許多生理和病理組織重新組成過程有關，尤其是 MMP-2 (72 kDa) 及 MMP-9 (92 kDa) 這兩種明膠酶(gelatinase)，活化後可降解含有明膠(gelatin)成份的基底膜，與傷口癒合、胚胎移植、腫瘤侵襲、轉移和血管新生的發生有密切關係(Woessner, 1991; Stetler-Stevenson, 1999; Ray and Stetler-Stevenson, 1994)。也有研究指出 MMP-2 與 MMP-9 與組織基質金屬蛋白酶(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs) 抑制因子間的不平衡與慢性牙周炎、牙齦發炎和口腔癌的產生有重要關聯 (Henning, 1993; Kato et al., 2005; Sinpitaksakul et al., 2008)。因此，當 MAPK 路徑被活化導致 MMP 大量產生之後，會使得細胞具有較強的能力來分解細胞外基質，產生局部侵襲及移行(Irina et al., 2003; Neil et al., 2007; Lin et al., 2007)。MMPs 間質分解酵素是一群含有鋅的 peptidase，其主要的功能為分解細胞外間質，進行間質組成份轉換（turnover），目前已被探討出的間質分解酵素已超過 26 種，根據其主要受質及型態的不同，可將間. 28.

(38) 質分解酵素分為五群： (一) Collagenases：此類的間質分解酵素之受質主要為helical collagen，包括 MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18。 (二) Gelatinases：此類的間質分解酵素之受質主要為gelatin、elastin，包括 gelatinase A（MMP-2）及 gelatinase B（MMP-9） (三) Stromelysins：此類的間質分解酵素主要為 aggrecan，包括 MMP-3、MMP-7、 MMP-10。 (四) Membrane-type MMPs：此類的間質分解酵素多具有hydrophobic domain，且結合於細胞之表面上，包括MMP-14、MMP-15、MMP-24。 (五) Others：包括MMP-12、MMP-19、MMP-20、MMP-23。所有的間質分解酵素均是以酶原的形式（未活化態）由細胞分泌出來，未活化的間質分解酵素包含三個主要的部份： (一) propeptide domain、(二) catalytic domain, 及(三) substrate-binding carboxy terminal domain。在活化過程中，先將propeptide domain 切除後，再由一個酵素，通常是藉由一個間質分解酵素，做進行最後的切割而形成活化態的間質分解酵素。間質分解酵素亦參與許多細胞的作用，包括正常生理作用如：胚胎發育、傷口癒合、神經的生長、細胞凋亡及一些病理的過程如關節炎、腫瘤細胞的侵襲、肝臟纖維化等。有許多文獻指出，在骨關節炎的病患其滑液膜組織及軟骨中具有較高含量的間質分解酵素，間質分解酵素-3（MMP-3），又稱為 stromelysin-1。之前的研究指出，骨關節炎病患之血液與滑液膜組織中，MMP-3 表現量有多於正常人之情形，且MMP-3 除了可以分解軟骨組織的主要成分外，還可以活化諸多其他的collagenase 如MMP-8、MMP-13。在大部分無論是人類或是動物的腫瘤細胞，MMP 的表達都有提高的現象(Coussens et al., 2002)。在臨床上，也有許多案例發現腫瘤惡化程度與一些MMP 家族成員的表達有關，如MMP-1、2、3、 7、9、11、14 等(Stetler-Stevenson, 1996)。在動物實驗中也發現，MMPs 的表 29.

(39) 達量是腫瘤轉移及侵犯能力的指標(McCawley and Matrisian, 2000)。因此，學術界正努力尋找可以抑制 MMPs 活性的藥物，以對抗發炎反應及抗癌細胞的移行與侵襲作用(Asmaa et al., 2009)。天然植物性化合物對於癌症預防和治療是頗具吸引力的研究性藥物。由中藥藥萃取物引起的生物反應，可能會修飾傳統化療藥物和影響多種訊號傳遞途徑，其功效包含了抗發炎、抗增殖、抗血管新生、促進癌細胞凋亡與抗癌細胞轉移等等(HemaIswarya and Doble, 2006; Sagar et al., 2006; Treasure, 2005)。同時，許多流行病學、生物學和臨床研究也發現，飲食與預防人類癌症具有強烈的相關性(Doll, 1992; Rogers et al., 1993; Surh, 2003)。因此，在過去 10 年，以植物萃取的化學物質作為癌症的化學預防已成為一個頗受矚目的研究項目(Manson, 2003; Surh and Ferguson, 2003; Gosslau and Chen, 2004; Wei et al., 2005)。許多研究報告也顯示，由食物或傳統中草藥萃取的天然化合物能預防和治療動脈粥樣硬化，其機轉可能是通過其抗氧化，抵抗癌細胞的增生，或抵抗癌細胞的轉移(Basu and Lucas, 2007; Giovannini et al., 2007)。最近研究發現，由雷公藤(Tripterygium wilfordii)萃取的有效成分 triptolide 已被證明能夠抑制細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡(Chang et al., 2001; Kiviharju et al., 2002; Phillips et al., 2007; Yang et al., 2003)。此外，triptolide 也被證實具有抑制小鼠移植瘤乳腺癌、胃癌、膀胱癌和胰腺癌的腫瘤生長和轉移 (Phillips et al., 2007; Yang et al., 2003) ；蕃茄 (Lycopersicon esculentum) 中的 α-tomatine 可藉由抑制 PI3K/Akt 與 ERK 訊號傳遞路徑，減少基質金屬蛋白酵素 MMP-2 與 MMP-9 的活性，進而阻止肺癌細胞 A549 的移行與侵襲(Shih et al., 2009)；薑黃(Curcuma longa)中的活性成分 curcumin 已被證實可抑制細胞增殖和發炎反應，誘導細胞凋亡，並使腫瘤細胞對癌症治療的敏感性增加(Karunagaran et al., 2005; Thangapazham et al., 2006; Srivastava et al., 2007)與抑制癌細胞的侵襲、血管增生和轉移(Menon et al., 30.

(40) 1999)；蓮花(Nelumbo nucifera GAERTN)葉萃取物可抑制血管平滑肌細胞的增生與轉移，進而減少動脈粥狀硬化的發生(Ho et al., 2009)；雲南重樓(Rhizoma Paridis)中的主要成分 Rhizoma Paridis saponins 可以誘導癌細胞凋亡，促進基質金屬蛋酵素抑制因子-2(Tissue inhibitors of metalloproteinase-2)的表現，同時減少 MMP-2 與 MMP-9 的活性進而抑制癌細胞的轉移(Man et al., 2009)；穿心蓮(Andrographis paniculata)的活性成分 andrographolide 已被證實在體外試驗中可抑制多種癌細胞的生長活性，並在動物試驗中對腫瘤細胞有明顯的抑制效果 (Srinivasa et al., 2006)。先前研究中也發現，andrographolide 可以降低基質金屬蛋白酵素 MMP-7 mRNA 的活性與 MMP-7 蛋白質的表現，進而抑制人類大腸癌 Lovo 細胞的移行與侵襲(Shi et al., 2009)。. 1.5 超臨界萃取 (Supercritical fluid extraction) 超臨界流體(supercritical fluid, SCF)是指物質在習知的固相、液相與氣相三態外的第四相。固相有一定的形狀和體積；液相雖有一定的體積，卻無固定的形狀；氣相則無固定形狀，也無一定體積。以二氧化碳與水為例，在常壓（1 大氣壓）下，可以使二氧化碳凝結成固態形成乾冰；也可使水氣化形成水蒸氣。每一種物質在某壓力與溫度下都能有類似的相變化，變化前後是具有不同特性的相。每一物質也都有一個特徵壓力及溫度，稱為臨界壓力與臨界溫度。當其溫度與壓力超越臨界溫度與臨界壓力時，便不會有相變化，其性質既近似氣相但非氣相、近似液相但也非液相。因已超越了臨界點，所以稱這區域為超臨界區，任何流體位處這區域中的都稱為超臨界流體。由於超臨界流體之密度與一般溶劑相似，黏度為一般溶劑的 1/100~1/1000，擴散性較一般溶劑快 100~1000 倍以上；就萃取率而言其與一般溶劑相似，但其滲入與萃出效果較一般溶劑快 1000 倍以上。以二氧化碳氣體經加壓、加溫至超臨界狀態而成為超臨界流體之萃取特性近似於中低極性的乙酸乙酯，此亦 31.