第三章 評估台灣紫芝多醣體之抗腫瘤活性
5. PS-F2 促進 T 細胞活化
從三種腫瘤模式腹腔注射 PS-F2 結果可知，PS-F2 能使脾臟細胞中的 T 細胞 比例顯著增加，其中的CD4 也是顯著增加，而 CD8 只有些微增加，推測 PS-F2
的抗腫瘤效果是透過T 細胞的活化，參與抗腫瘤的作用。為了確認 T 細胞是否
活化，以C26 腫瘤模式中進一步檢測 T 細胞活化標誌 CD44 和 CD62L 的表現情 形，另外也探討Treg 細胞是否有參與抗腫瘤的反應。
T 細胞的活化時，已知 T 細胞表面活化標誌 CD44 的表現會增加，CD62L 的表現會減少(Hanson et al., 2009)。naïve 組小鼠（n=2）是沒有接種 C26 腫瘤的 小鼠。在C26 移植小鼠發現，給予 PS-F2 之腫瘤小鼠的脾臟細胞，不同組（PBS 和PS-F2）的 CD4+CD44High及CD8+CD44High細胞比例沒有很大變化（圖3-25A）， 但是CD4+CD44High平均螢光強度（MFI，圖 3-25B）有顯著性增加，顯示 PS-F2 處理過的小鼠CD4 T 細胞已被活化。
另一個 T 細胞的活化標誌 CD62L，也可以發現腫瘤小鼠脾臟細胞的 CD62L
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Day12 Day24
S eru m Ig M (µg /m l)
PBS PS-F2 Naive
**
圖3-24. PS-F2 對接種 C26 小鼠血清 IgM 濃度之影響
Figure 3-24. Effect of PS-F2 on serum IgM level in C26 tumor-bearing mice.
Data are the means ± SE (n = 10). **P<0.01 compared to the PBS group.
0 50 100 150 200 250 300 350 400
CD4 CD8
CD44+ MFI
Naive PBS PS-F2
*
(A)(B)
圖3-25. 接種 C26 小鼠 T 細胞 CD44 的表現情形
Figure 3-25. Effect of PS-F2 on CD44High expression in C26 tumor-bearing mice.
Expression profiles of CD44 activation marker (A) and MFI of CD44High (B) in C26 tumor-bearing mice.
0 50 100 150 200 250 300 350 400
CD4 CD8
CD62L+ MFI
Naive PBS PS-F2
*
(A)(B)
圖3-26. 接種 C26 小鼠 T 細胞 CD62L 的表現情形
Figure 3-26. Effect of PS-F2 on CD62LHigh expression in C26 tumor-bearing mice.
Expression profiles of CD62L activation marker (A) and MFI of CD62LHigh (B) in C26 tumor-bearing mice.
Data are the means ± SE (n = 10). *P<0.05 compared to the PBS group.
3-26B）有顯著性增加，再次確認 CD4 細胞有被活化。在 CD8 細胞部份，雖然 PS-F2 處理的小鼠 CD44 和 CD62L 也都有活化的情形，但是都沒有達到顯著性 差異，推測PS-F2 對 CD4 T 細胞的刺激活化效果比 CD8 T 細胞好。
Treg 細胞是一群會抑制免疫反應的 T 細胞亞群，從圖 3-27 顯示 naïve 或腫
瘤移植小鼠的所佔比例沒有變化，推測PS-F2 的抗腫瘤活性與抑制免疫反應的
Treg 細胞沒有相關。
為了進一步確認 PS-F2 透過活化小鼠免疫系統抑制腫瘤生長，分別以 CD4、
CD8、CD49b 及小鼠血清進行 adoptive transfer 確認是哪些免疫細胞扮演重要的 角色。先將接種腫瘤的小鼠腹腔注射PS-F2，假設 PS-F2 能提升免疫細胞對腫瘤 抗原的呈現，將PS-F2 處理 6 天和 12 天的免疫細胞靜脈注射到小鼠，觀察 adoptive transfer 不同免疫細胞對腫瘤生長的影響。在第 0 天 adoptive transfer 免疫細胞，
每兩天量測腫瘤大小持續三週。圖 3-28 是 B16 腫瘤細胞的生長情形，PS-F2 處 理 6 天的免疫細胞與未注射任何免疫細胞的控制組比較（圖 3-28A），靜脈注射 CD4 和 CD8 在實驗前期（5-9 天）有顯著的抑制效果；到了後期，注射 CD8 小
鼠上的腫瘤漸漸沒有受到抑制而與控制組接近，而注射 CD4 小鼠持續有抑制腫
瘤生長的效果（P=0.016），另外在注射血清的小鼠也發現具有抑制腫瘤效果
（P=0.031），顯示CD4 和血清中的抗體對小鼠抑制腫瘤生長扮演很重要的角色。
PS-F2 處理 12 天的免疫細胞與未注射任何免疫細胞的控制組比較時（圖 3-28B），靜脈注射CD4 細胞、NK 細胞和血清的小鼠也發現抑制腫瘤效果，顯示 CD4 和血清中的抗體對小鼠抑制腫瘤生長扮演很重要的角色，與處理 6 天的免 疫結果（圖3-28A）相符。此外，長時間 PS-F2 的免疫對小鼠也許有不同的效果，
NK 細胞的注射也發現具有抗腫瘤效果（圖 3-28B）。
0 1 2 3 4 5 6
Treg
P er cen ta ge ( % )
Naive PBS PS-F2
(A)
(B)
圖3-27. PS-F2 對接種 C26 小鼠 Treg 細胞比例之影響
Figure 3-27. Effect of PS-F2 on Treg subset in C26 tumor-bearing mice.
Expression profiles of Treg (CD4+/Foxp3+) subset (A) and Treg levels on T cells (B) in C26 tumor-bearing mice.
Data are the means ± SE (n = 10). *P<0.05 compared to the PBS group.
0
Days after tumor implantation
Tu mo r s iz e (mm
3) Untreated CD4 CD8 NK Serum
*****
Days after tumor implantation Tumor size (mm3 )
Untreated CD4 CD8 NK Serum
**
(B)
圖3-28. Adoptive transfer 免疫細胞對 B16 腫瘤生長之影響
Figure 3-28. Effect on B16 tumor growth with adoptive transfer immune cells from PS-F2-treated mice.
Mice were injected i.p. with 50 mg/kg PS-F2 once every two days and sacrified on day 6 (A) and 12 (B). On day 0, B16 cells (1×106) were injected s.c. onto the right flank of naive C57BL/6 mice. One day later, mice received CD4, CD8, CD49b cells and serum from spleen. Mice that received tumor challenge but without any cell transfer served as control group. Tumor growth pattern in mice with or without adoptive transfer is shown. Data are the means ± SE (n = 3-5). *P<0.05, **P<0.01
觀察 adoptive transfer 免疫細胞對接種腫瘤小鼠存活率的影響時，CD8 細胞 和NK 細胞組與控制組的存活率差不多，而 adoptive transfer CD4 和血
清的處理都有延長小鼠存活的效果（圖3-29）。
6. SCID mice 之抗腫瘤模式
為了確認 T 細胞在 PS-F2 抗腫瘤活性所扮演的功能，以嚴重缺乏 T 和 B 淋 巴細胞的自發性免疫缺陷SCID mice 模式進行探討，接種 B16 腫瘤細胞的免疫 缺陷SCID mice 在給予 PS-F2 時，PS-F2 的抗腫瘤效果是否有受到影響。
皮下注射 B16 腫瘤細胞的 SCID mice，每兩天腹腔注射 PS-F2 一次，同時紀 錄腫瘤變化（圖3-30）。結果顯示PS-F2 在缺乏 T 和 B 淋巴細胞的自發性免疫缺 陷 SCID mice 便失去了抗腫瘤的活性，也同時確認 PS-F2 抗腫瘤的活性需要 T 和B 淋巴細胞的作用。
Days after tumor implantation
0 5 10 15 20 25 30 35
Survival (%)
0 20 40 60 80 100
Control CD4 T CD8 T CD49b NK Serum
圖3-29. Adoptive transfer 免疫細胞對小鼠存活率之影響
Figure 3-29. Effect on mice survival rate with adoptive transfer immune cells from PS-F2-treated mice.
Mice were injected i.p. with 50 mg/kg PS-F2 once every two days and sacrified on day 6. On day 0, B16 cells (1×106) were injected s.c. onto the right flank of naive C57BL/6 mice. One day later, mice received CD4, CD8, CD49b cells from spleen and serum antibodies by i.v. Mice that received tumor challenge but without any cell transfer served as control group.
0 2000 4000 6000 8000 10000
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19
Days after tumor implantation Tu m or s iz e (m m
3)
PBS PS-F2圖3-30. PS-F2 在 SCID 小鼠抗腫瘤之效果
Figure 3-30. Antitumor effect of PS-F2 in B16 tumor xenografted SCID mice.
B16 (5×105 cells) was subcutaneously implanted into SCID mice. PS-F2 (50mg/kg) was i.p. administered to mice for 3 weeks starting from 24 h before inoculation.
Control mice were treated with equal amounts of PBS alone on the same schedule.
Data are the means ± SE (n=5). P= 0.322 compared to the PBS group.
四、討論
癌症一直是台灣近年來國人死亡原因的第一名，也是世界各國死亡的主要原 因，儘管各項新穎治療方式與特殊藥物的發展，治療與診斷新方法的開發也抵擋 不住癌症的高罹患率及死亡率，對於罹癌後期患者，大多治療的效果僅止於延長 生命，最終還是死於癌細胞的轉移惡化及相關併發症。然而，人類在與癌症對抗 的過程中，同時也累積了相當豐碩的研究成果與臨床經驗，只要是早期發現，約 有九成患者可以治癒。目前研究的重點除了後期的治療外，發現罹癌後的處理、
手術後預防癌細胞的復發或轉移及提升患者的免疫功能都是重要的研究課題，而 更多研究人員致力於癌症早期診斷新方法的研究。
由於使用抗癌藥物及治療過程往往對免疫系統也會造成相當程度的損害，而 生物反應修飾劑的運用可提高患者的免疫力，增強治療腫瘤的效果，因此本研究 主要探討台灣紫芝多醣體 PS-F2 的抗腫瘤活性，並解析 PS-F2 抗腫瘤的作用機
制，期許台灣紫芝多醣體PS-F2 在腫瘤治療上能有效應用。本研究主要採用移植
性腫瘤動物模式，此模式同時接種等量的腫瘤細胞於小鼠上，生長速率一致，個 體差異影響小，易於客觀判斷效果，在腫瘤研究上是常應用的模式。實驗採用一 種同種異體動物腫瘤模式（S180 腫瘤移植於 BALB/c 小鼠）及兩種同種動物腫 瘤模式（B16 腫瘤移植於 C57BL/6 小鼠和 C26 腫瘤移植於 BALB/c 小鼠）中，
給予PS-F2 都發現可以有效抑制移植腫瘤的生長。
在移植腫瘤的小鼠體重變化上，三種腫瘤模式腹腔注射 PS-F2 處理的小鼠體
並不會對小鼠造成不良的副作用。另以管餵方式給予S180 腫瘤小鼠 PS-F2 也發 現一樣有抑制S180 腫瘤生長之效果（圖 3-7C），抑制率分別為 38.9 %（n=4）和 81.1 %（n=6），顯示管餵或腹腔注射給予的方式，PS-F2 均能有效抑制腫瘤細胞
之生長。但是以未純化的cEPS 管餵腫瘤小鼠卻發現沒有抑制腫瘤生長的效果（圖
3-7C），顯示 cEPS 中仍存在影響活性多醣體的抗腫瘤活性。而 PS-F2 處理的小 鼠發現其脾臟變大，脾臟T 細胞的比例增加，血清中 IgM 抗體增加，而 NK 細
胞的比例和細胞毒殺活性有些微增加。從以上結果推測PS-F2 的抗腫瘤活性是透
過活化宿主免疫反應，增強細胞免疫介導反應和體液免疫反應，使移植腫瘤細胞 生長受到抑制。
在三種移植腫瘤的動物模式中，PS-F2 處理的小鼠脾臟細胞 T 細胞比例均有 明顯的增加，特別是CD4 細胞有顯著的增加，而 CD8 細胞雖有增加但是未達顯 著差異。過去對靈芝多醣體的研究發現：小鼠經放射線照射後，小鼠的淋巴細胞 會有顯著減少，但靈芝處理具有緩和放射線照射所造成傷害的效果，甚至比雲芝 素（krestin）的效果還好(Chen et al., 1995)。以醱酵培養生產的靈芝多醣體餵食 小鼠也確認對淋巴球的增生及活化都有顯著的效用(賀, 2003)；餵食小鼠赤芝子
實體 RR 在短時間可以活化脾臟巨噬細胞，長時間服用更可活化 T 細胞
(Kohguchi et al., 2004)；馬餵食靈芝也發現能增加 PBLs 中 CD5、CD4 和 CD8 細 胞的比例，增加特異性抗體的產生(Lai et al., 2004)。此外， PS-G 多醣體在體外 試驗發現能活化巨噬細胞、CD4 細胞、NK 細胞和其他免疫細胞(Wang et al., 1997)；以 PS-F2 刺激脾臟細胞，發現 T 細胞的體積會變大，顯示 PS-F2 會刺激 活化某些 T 細胞(Zhuang, 2009)。在其他菇類來源的多醣體也發現脾臟的重量
(Zheng et al., 2005)，活化 T 細胞(Chen et al., 2008; Vetvicka et al., 2008; Masuda et al., 2009)。過去研究都顯示多醣體可以活化免疫細胞，而本研究中的體內模式無 論是管餵PS-F2 可以增加小鼠脾臟細胞的 T 細胞比例（圖 3-2A），在移植腫瘤小 鼠體內也會活化 T 細胞，使 T 細胞增加（圖 3-10A、3-16A 和 3-22A），與體外 的細胞模式結果一致 (Zhuang, 2009)。
以往對於腫瘤免疫比較注意的是 CD8 毒殺型 T 細胞反應，但是愈來愈多證 據顯示 CD4 細胞在抗腫瘤免疫反應扮演相同重要的地位(Huang et al., 1994;
Pardoll and Topalian, 1998)。CD4 細胞在很多自體免疫疾病的發病過程扮演重要 的角色，以免疫療法抗癌，有時候類似刻意去引發自體免疫疾病，導致某一器官 或組織的破壞(Shiku, 2003; Muranski and Restifo, 2009)。有報告也已經指出 CD4
細胞對接種腫瘤的實驗動物，在沒有 CD8 細胞的參與就具有保護小鼠抑制腫瘤
生長的效果(Muranski and Restifo, 2009)，而在沒有外加細胞激素及接種疫苗下，
CD4 細胞比 CD8 細胞能更有效的抑制腫瘤(Perez-Diez et al., 2007)。這在 adoptive transfer 的實驗也發現 CD4 細胞得確就能具有抗腫瘤效果（圖 3-28）。很多腫瘤 細胞暴露在IFN-γ 能促進 MHC II 的表現(Dutta et al., 2003; Zhao et al., 2007)。有
些腫瘤不會表現MHC II，但是經由抗原呈現細胞直接辨識腫瘤相關抗原也能被
CD4 細胞辨認或殺滅腫瘤細胞，接著再引發各種先天性免疫及後天性免疫反應
CD4 細胞辨認或殺滅腫瘤細胞，接著再引發各種先天性免疫及後天性免疫反應