TLR4 受體在 PS-F2 誘導產生 TNF-α 上扮演的角色

除了探討 C-type lectin 相關的受體外，有報告也指出多醣體刺激免疫細胞也 會經由TLRs 受體(Slack et al., 2007; Chan et al., 2009)，因此也探討 TLR4 受體是 否也參與了PS-F2 刺激巨噬細胞。

C3H/HeJ（TLR4^-/-）是TLR4 基因缺陷小鼠，誘導缺陷小鼠骨髓細胞分化為

圖2-16. piceatannol 對 PS-F2 誘導 MAPKs 磷酸化及 I-κB 降解之影響

Figure 2-16. Effect of piceatannol on PS-F2 induced phosphorylation of MAPKs and degradation of I-κB.

The RAW 264.7 cells were pre-incubated with or without piceatannol (25 μM) for 1 h and cell lysates were prepared at 30 min after PS-F2 (8 μg/ml) stimulation at 37 °C.

Total lysates were separated on SDS-PAGE and immunoblotted with specific antibodies, as described above.

圖2-17. anti-CR3 中和抗體對 PS-F2 誘導 RAW 264.7 細胞產生 TNF-α 之影響 Figure 2-17. The blocking antibody of CR3 inhibition the TNF-α production in PS-F2 stimulated RAW 264.7 cells.

The RAW 264.7 cells were pre-treated with isotype control (IgG2a, eBioscience, 16-4321-81) and neutralization mAb of anti-CR3. (eBioscience, 16-0112-81) for 1 h and further stimulated with PS-F2 (10 µg/mL) for 20 h in the presence of antibody.

The TNF-α levels in the supernatants were assayed by ELISA (n = 3). Data shown are representative of three independent experiments. *p<0.05 compared to control.

探討TLR4 受體在 PS-F2 活化 BMDM 上扮演的角色。另以 C3H/HeN 正常小鼠 BMDM 為控制組，Poly I:C 為透過 TLR3 受體的負控制組。

當以 PS-F2 刺激 BMDM（5×10⁴ cells/well） 24 h 後，取培養上層液分析 BMDM 產生 TNF-α 的變化情形。結果如圖 2-18 所示，已知經由 TLR3 受體刺激 的Poly I:C 如預期不受抑制，與 C3H/HeN 正常小鼠 BMDM 比較時，TNF-α 的產 生不因BMDM 的 TLR4 基因缺陷而被抑制，顯示這個 C3H/HeJ 小鼠 BMDM 模 式可以正常運作。

當以 15 及 30 µg/ml PS-F2 刺激 C3H/HeN 正常小鼠 BMDM 時，結果顯示隨 著PS-F2 刺激劑量增加，TNF-α 的產量也增加，具有劑量關係；而刺激 C3H/HeJ 缺陷小鼠BMDM 產生的 TNF-α 雖也隨著 PS-F2 刺激劑量增加，TNF-α 的產生也 增加，具有劑量關係。但在PS-F2 相同劑量刺激下，TLR4 缺陷小鼠 BMDM 與 正常小鼠BMDM 比較時，缺陷小鼠 BMDM 產生的 TNF-α 有顯著性受到抑制，

顯示TLR4 缺陷的 BMDM 會影響 PS-F2 的刺激效果，推測 PS-F2 也會經 TLR4 受體刺激巨噬細胞產生TNF-α。

另外添加 Dectin-1 受體抑制劑於高劑量 PS-F2（30 µg/ml）的刺激細胞時，

正常小鼠 BMDM 與 piceatannol 對 RAW 264.7 細胞（圖 2-15C）一樣有顯著性的 抑制效果，而處理TLR4 缺陷 BMDM 時，則發現可將原本已受抑制的活性降至 與背景值相當。推測PS-F2 至少同時透過 Dectin-1 及 TLR4 等受體活化巨噬細胞 產生TNF-α。

0 100 200 300 400 500

TNF-α (pg/mL)

C3H/HeN C3H/HeJ

** **

圖2-18. TLR 4 和 Dectin-1 參與 PS-F2 活化骨髓分化巨噬細胞產生 TNF-α

Figure 2-18. TLR4 and Dectin-1 receptors participate in the PS-F2-mediated TNF-α production.

BMDM (5×10⁴ cells/ml) from C3H/HeN (WT) and C3H/HeJ (TLR4^-/-) mice were pretreated with the laminarin (0.3 mg/ml) and piceatannol (25 µM/ml) for 1 h and then stimulated with PS-F2 (15, 30 µg/ml) or Poly (I:C) (10 µg/ml). After 24 h, the culture supernatants were then collected and TNF-α levels were measured using ELISA (n = 3). Data are presented as mean ± SD. **, p<0.01 compared with control.

四、討論

很多研究已經證實具有生物活性多醣體普遍存在於高等擔子菌類，菌類所產 生的多醣體會因菌種不同及培養環境差異而有不同的性質，不同來源的多醣體在 結構上便有顯著的變異，這樣的差異也直接影響多醣體表現的生物活性 (Volman et al., 2008)。對於靈芝類而言，早在中國古代藥典即記載依外觀顏色的不同而有 不同的生理功效，其子實體水煎萃取物，主要是水溶性多醣體，已廣泛用於身體 保健、延年益壽、提升免疫功能…等醫療或老年保健用途。近年來從科學的角度 驗證才對靈芝多醣體具有免疫調節及抗腫瘤等功效、多醣體結構與生物活性的關 係 (Miyazaki and Nishijima, 1981; Ukai et al., 1983; Bao et al., 2002a; Bao et al., 2002b)或是刺激免疫細胞活化產生各種細胞激素 (Wang et al., 1997) 的作用有更 深的認識。有鑑於此，本研究對於分離自桃園山區的台灣原生種靈芝：台灣紫芝 所具有的生物活性成分、免疫調節功能、抗腫瘤效果及其相關作用機制具有高度 的興趣與期待。

本研究採用具經濟效益之深層液態培養於五公升醱酵槽快速大量生產台灣 紫芝胞外多醣體，藉由各項實驗證實生產的胞外多醣體也具有免疫調節功能。多 醣體生物活性功能的探討常因為其巨大的分子結構、水溶性及複雜性而有相當的 難度，本研究之台灣紫芝胞外多醣體以膠體過濾層析分離得到三個主要的分劃

（圖2-1），依據分子量大小純化分離胞外粗多醣體，其中PS-F2 為回收 33-44 分 化的多醣體，其分子量介在6 到 52 KDa，佔了胞外粗多醣體 50 %以上，因此探

討台灣紫芝多醣體的功能性就選擇以PS-F2 為研究對象。純化的三個分劃多醣體

其單糖組成均以mannose、galactose 和 glucose 為主要單糖（表 2-1），其中mannose 就佔了3-5 成，屬於 heteropolysaccharide，與最常被研究的赤芝多醣體是 glucose

（58.1 %）為主的組成完全不同 (Wang et al., 2002)，相較於其他已被研究發表的

靈芝多醣體也不同（表2-3），顯示純化分離的台灣紫芝胞外多醣體為一新穎的多

醣體。此外，台灣紫芝在唯一已發表的文獻顯示，台灣紫芝比其他靈芝品種具有 更佳的自由基清除能力及最高的保肝活性 (Lin et al., 1995)，本研究室之前的研 究也顯示其醱酵槽培養液萃取物小分子對人類腫瘤細胞的生長有抑制的效果 (陳，2006)，讓我們更期待探知這新穎多醣體的生物活性及其作用機制。有關台 灣紫芝多醣體的免疫調節活性及其刺激產生相關細胞激素的訊息傳導途徑都尚 未被研究過，本研究將是第一次探討有關台灣紫芝多醣體的免疫調節活性。

巨噬細胞是免疫系統對抗細菌或各種病源感染最前線的免疫細胞，藉由吞噬

作用保護宿主，誘發產生許多發炎的細胞激素，同時將抗原呈現給T 淋巴細胞，

對 於 後 天 性 免 疫 反 應 的 起 始 扮 演 相 當 重 要 的 角 色 (Aderem and Underhill, 1999)。為了確定台灣紫芝多醣體是否能夠活化巨噬細胞，以台灣紫芝多醣體處 理小鼠巨噬細胞RAW 264.7 細胞，探討台灣紫芝多醣體是否會使 RAW 264.7 細

胞產生 TNF-α 來判斷其免疫調節活性之功效，這個細胞模式已常被用於篩選評

估免疫調節功能，像是舞菇純化之多醣體grifolan (GRN)能刺激 RAW 264.7 細胞 產生IL-6、IL-1 和 TNF-α (Adachi et al., 1994; Okazaki et al., 1995)，而酵母細胞 壁的主要成分zymosan 刺激 RAW 264.7 細胞產生 TNF-α (Young et al., 2001; Sato, 2003; Nonaka et al., 2006)。利用本實驗室之前建立之生產台灣紫芝多醣體方法

表2-3. 不同靈芝來源多醣體之單糖組成

Table 2-3. The monosaccharides compositions of various polysaccharides from Ganoderma.

Mannose ^Galactose Glucose Fucose ^Rhamnose Arabinose Fructose Xylose MW(KDa) Reference PS-F1 50.13 13.1 17.47 2.71 9.21 6.94 0.45 ─ >2000

PS-F2 44.91 38.64 8.26 8.02 N.D. 0.08 0.09 ─ 14

PS-F3 33.35 30.84 20.52 4.44 1.33 8.78 0.74 ─ 2-4

This study

F3 15.1 13.5 58.1 7.1 0.7 ─ ─ 3.1 >788

(Wang et al., 2002; Lai et al.,

2010)

PL-1 ─ 21 73 ─ 6 ─ ─ ― ―

PL-3 ─ ─ 100 ─ ─ ─ ─ ― ―

PL-4 7 ─ 93 ─ ─ ─ ─ ― ―

(Bao et al., 2002a)

Gl-PS 2.9 1.3 60.2 ─ 6.0 ─ 22.3 7.3 584.9

(Cao and Lin, 2002; Shao et al., 2004; Chan

et al., 2007)

GLPP ─ 3.8 46.6 ─ 3.7 ─ 21.4 24.5 512.5 (Cao and Lin,

2004; Ho, 2007) GLPC

W-II ─ 66.2 16.2 17.6 ─ ─ ─ trace 12 (Ye, 2008)

表2-3.（續） 各種從靈芝純化之多醣體單糖組成

Mannose Galactose Glucose Fucose Rhamnose Arabinose Fructose Xylose MW(KDa) Reference GL-F

11.1 2.5 36.0 ─ 2.4 41.8 ─ 2.4 461.8, 1.7 (Yue et al., 2008)

EXP 48.4 3.9 40.9 trace ─ 3.0 ─ 1.7 ─ (Jeong et al.,

2008)

GLPL1 5.2

GLPL2 3.1 5.7 91.2 ─ ─ ─ ─ ─ 15.4 (Liu et al., 2010)

GLP ─ ─ 12.8 ─ ─ ─ 14.4 0.4 ─ (Yang et al.,

2010)

(陳，2006)，經由膠體過濾純化分離之 PS-F1、PS-F2 和 PS-F3 多醣體分劃發現 都能夠刺激RAW 264.7 細胞產生 TNF-α（圖 2-6B）。為了排除刺激活性來自多醣 體上的蛋白部份，進一步以蛋白水解酵素處理去除多醣體上的蛋白質部份，確認 刺激巨噬細胞的活性的確是來自於多醣體部份（圖2-6A、2-6B）。來自赤芝之多

醣體去除蛋白質部份後一樣會刺激Con A 處理過之脾臟細胞，使脾臟細胞有增生

的活性 (Wang et al., 2002)，顯示免疫調節活性都是多醣體的效果。

Wang 等人發現醣蛋白中的 fucose 是赤芝多醣體生物活性之關鍵成分，以 α-1,2-fucosidase 水解結構外端的 fucose 時，F3 的免疫調節活性會受到抑制 (Wang et al., 2002)，台灣紫芝多醣體的三種分劃 PS-F1、PS-F2 和 PS-F3 都發現有 fucose 單糖組成（表 2-1），由鍵結分析也顯示台灣紫芝多醣體的 fucose 也是結構外端 的鍵結單糖（表 2-2），推測 fucose 的存在對台灣紫芝多醣體免疫調節活性也應 該有所影響。分析台灣紫芝多醣體的結構組成（表2-1、表 2-2），推測 PS-F2 應 為以mannan 為主幹的多醣體結構，與赤芝多醣體的結構（圖 2-19）也有顯著的 差異，在酵母細胞壁純化的 mannan 也顯示會刺激人類單核細胞產生 TNF-α (Bajtay et al., 2000; Mizuno et al., 2000; Cutler, 2001; Tada et al., 2002)，具有免疫調 節功能。為探討 PS-F2 的生物活性與結構鍵結的關係，實驗中假設 β-1,3-glucan 鍵結會影響活性，曾以水解β-1,3-glucan 鍵結的專一性酵素 laminarinase（Sigma, L-5272）水解 PS-F2，惟 laminarinase 本身就會強烈刺激 RAW 264.7 細胞產生大 量TNF-α，無法確認 PS-F2 的免疫調節活性是否因水解酵素處理後而減低，證實 β-1,3-glucan 鍵結結構所扮演的角色，未來如在經費允許下，應可購買其他純度 較高具專一性的水解酵素，如α-1,2-fucosidase 或 α-1,3/4-fucosidase (Wang et al.,

圖2-19. 赤芝多醣體的骨架

Figure 2-19. The backbones of Reishi polysaccharides (Wang et al., 2002).

2002)來探討多醣體結構之鍵結與免疫調節活性之關係。

樹突細胞是抗原呈現細胞（antigen-presenting cells），可以啟動先天性反應及 抗原專一性的後天性免疫。未成熟的樹突細胞分布於非淋巴組織（nonlymphoid tissues）進行抗原的捕獲及加工，當未成熟的樹突細胞被活化後，樹突細胞會移

動到有T 細胞的淋巴器官，在此會失去抗原呈現的活性，同時成熟為具有免疫刺

激能力的細胞 (Cella et al., 1997)。不同來源的多醣體已證實在人類樹突細胞具有 不同的免疫調節功效，樹突細胞可作為篩選不同來源材料治療效果的篩選平台 (Chan et al., 2007)。以 PS-F2 處理從小鼠骨髓細胞分化而來的未成熟樹突細胞，

發現未成熟樹突細胞上的成熟標記CD40、CD80、CD86 和 MHC class II 表現量 因此而增加（圖 2-10），同時也發現 PS-F2 能增進成熟樹突細胞分泌 TNF-α、

IL-10、IL-12 p40 和 IL-6 等細胞激素 (Pi, 2009)，顯示台灣紫芝多醣體 PS-F2 具 有刺激樹突細胞之免疫調節活性。由於樹突細胞抗原呈現的活性可應用於癌症治 療上新穎的疫苗佐劑（vaccine adjuvant），在藥學領域的研究上也可深入的探討，

而有關PS-F2 作為免疫佐劑的用途探討也已由實驗室其他成員同時進行確認，探

討PS-F2 作為免疫佐劑的可行性。另外推測台灣紫芝多醣體 PS-F2 能活化樹突細

胞應也可以活化 T 細胞，進而具有抑制腫瘤生長能力等免疫功能，有關 PS-F2

的抗腫瘤活性評估將於下一章探討。

發炎反應是生體在受傷、感染或是刺激（irritation）時所產生的生理反應，

也是受傷組織表現的宿主反應。發炎的過程會使受傷或微生物入侵的部位發生小 動脈和微血管擴張，增加微血管管壁的通透性，使體液和細胞由充血的血管進入

(Aggarwal et al., 2006)。前面的結果已經證實 PS-F2 能刺激活化巨噬細胞，為了

探討體內的刺激是否也會誘發發炎反應，活化巨噬細胞，實驗以PS-F2 腹腔注射

刺激小鼠，16 小時後發現腹腔沖洗液內的嗜中性球及單核球比以 PBS 刺激的控

刺激小鼠，16 小時後發現腹腔沖洗液內的嗜中性球及單核球比以 PBS 刺激的控