第三章 評估台灣紫芝多醣體之抗腫瘤活性
12. SCID mice 之抗腫瘤模式
SCID（severe combined immune deficiency）mice 是嚴重缺乏 T 和 B 淋巴細 胞的自發性免疫缺陷小鼠。小鼠購買自台大醫學院實驗動物中心，八週大公鼠，
飼養於台大生命科學院SPF（specific pathogen free）動物房。
將 B16 腫瘤細胞（1×106 cells/mice）皮下注射於 SCID mice，24h 之後開始 腹腔注射PS-F2（50 mg/kg），每兩天腹腔注射PS-F2 一次，實驗期間紀錄腫瘤大 小。
13. 統計分析
所有實驗至少都重複三次，每次處理均三重複，實驗結果以平均值±標準偏 差（SD）表示；而在動物實驗的數據則均以平均值±標準誤差（SE）表示，資料 統計採用Student's t test 檢定各實驗組間的差異，若組間 p < 0.05 視為顯著差異。
三、結果
1. 台灣紫芝多醣體於動物體內引起之非特異性免疫反應
由第二章結果已顯示台灣紫芝多醣體 PS-F2 具有免疫調節的活性，為了進一
步評估 PS-F2 於動物體內之免疫調節功能及對免疫調節活性之影響，本試驗以
PS-F2 餵食 C57BL/6 和 BALB/c 小鼠進行探討是否引起之非特異性免疫反應。實 驗小鼠每兩天管餵給予50 mg/kg PS-F2，持續一個月後犧牲小鼠，實驗期間紀錄 體重變化，分析各項免疫反應指標。
以 PS-F2 餵食 C57BL/6 和 BALB/c 小鼠期間，所有小鼠的體重均在正常速度 下增加，兩種品系小鼠均不會因為餵食 PS-F2 而有體重減少或增加的影響 (圖 3-1)，各組間並無明顯差異，確定餵食 PS-F2 對小鼠的生長沒有不良影響或明顯 急性毒性。
分析 C57BL/6 小鼠脾臟細胞之細胞族群比例變化，管餵 PS-F2 之小鼠較管 餵PBS 控制組之脾臟中 T 細胞（CD3）族群比例由 31.91 ± 0.93 %增加到 34.58 ± 1.13 % (圖 3-2A)；其中 CD4 細胞比例由 17.61 ± 1.10 %增加到 20.90 ± 1.31 %，
CD8 細胞比例由 8.20 ± 0.57 %增加到 9.10 ± 0.64 %，細胞比例皆有增加 (圖 3-2B)。NK 細胞（CD49b）之比例亦由 7.96 ± 0.72 %增加到 9.70 ± 1.04 % (圖 3-3A)，且細胞毒殺活性也有增加(圖 3-3B)，但與控制組相較均未達顯著差異。
雖然管餵PS-F2 之小鼠脾臟中 B 細胞（CD19）族群比例 51.01 ± 0.82 %下降至 48.62 ± 1.25 % (圖 3-2A)，但在血清中 IgM 及 IgG 抗體濃度發現均有顯著增加之 情形 (圖 3-6)，推測 PS-F2 會活化 B 細胞產生抗體，結果顯示管餵 PS-F2 會引起 C57BL/6 小鼠非特異性之免疫反應，對 BALB/c 小鼠則不會。
0
Figure 3-1. Effect of oral administration of PS-F2 on the body weight in C57BL/6 (n=5) (A) and BALB/c (n=7) (B) mice.
The data are the means ± SE for each group (n=5-7).
(A)
P er cen ta ge o f p os iti ve cel ls
PBS PS-F2(B)
Pe rc en ta ge o f p os itiv e c ell s
PBS PS-F2
圖3-2. 以 PS-F2 管餵 C57BL/6 小鼠對脾臟中細胞比例之影響
Figure 3-2. Effect of oral administration of PS-F2 on the T cells and B cells (A) and CD4 and CD8 T cells (B) populations in C57BL/6 spleens.
The date are the means ± SE for each group (n = 5).
(A)
P er cen ta ge o f p os iti ve cel ls
PBS PS-F2(B)
NK cell activity (%)
PBS PS-F2
圖3-3. 以 PS-F2 管餵 C57BL/6 小鼠對脾臟中 NK 細胞之影響
Figure 3-3. Effect of oral administration of PS-F2 on the CD49b population (A) and NK cell activities (B) in C57BL/6 mice.
NK cell activities were assessed by measuring the killed of the target YAC-1 cells mediated by splenocytes. The data are the means ± SE for each group (n = 5).
(A)
0 10 20 30 40 50 60
CD3 CD19
P er cen ta ge o f p os iti ve cel ls
PBS PS-F2(B)
0 10 20 30 40
CD4 CD8
Pe rc en ta ge o f p os itiv e c ell s
PBS PS-F2
圖3-4. 以 PS-F2 管餵 BALB/c 小鼠對脾臟中細胞比例之影響
Figure 3-4. Effect of oral administration of PS-F2 on the T cells and B cells (A) and CD4 and CD8 T cells (B) populations in BALB/c spleens.
The data were expressed as mean ± SE (n=7).
(A)
P er cen ta ge o f p os iti ve cel ls
PBS PS-F2(B)
NK cell activity (%)
PBS PS-F2
圖3-5. 以 PS-F2 管餵 BALB/c 小鼠對脾臟中 NK 細胞之影響
Figure 3-5. Effect of oral administration of PS-F2 on the CD49b population (A) and NK cell activities (B) in BALB/c mice.
NK cell activities were assessed by measuring the killed of the target YAC-1 cells mediated by splenocytes. The data are the means ± SE for each group (n=7).
0
Figure 3-6. Effect of oral administration of PS-F2 on the serum antibody levels in C57BL/6 (n=5)(A) and BALB/c (n=7) mice(B).
The data are the means ± SE for each group (n=5-7). *P<0.05 compared to the control group.
而分析管餵 PS-F2 的 BALB/c 小鼠脾臟細胞，T 細胞和 B 細胞在族群比例上 沒有改變(圖 3-4A)，T 細胞中的 CD4 細胞與 CD8 細胞比例也不受影響 (圖 3-4B)。NK 細胞比例(圖 3-5A)、細胞毒殺活性(圖 3-5B)及血清中 IgM 濃度(圖 3-6B) 也未受管餵PS-F2 而增減。
綜合上述結果發現，餵食 PS-F2 在 C57BL/6 小鼠有較強的非特異性免疫反 應，而對BALB/c 小鼠沒有明顯之非特異性免疫反應。
2. 台灣紫芝多醣體抗 S180 腫瘤之活性
為了確立台灣紫芝多醣體之免疫調節活性是否具有抗腫瘤之效果，首先採用 常被用於評估抗腫瘤之動物模式：在BALB/c 小鼠皮下接種 S180 腫瘤細胞，評 估PS-F2 對腫瘤生長之影響，此腫瘤動物模式屬於同類異體系統 (Nonaka et al., 2006)。
在 BALB/c 小鼠皮下接種 S180 腫瘤細胞 24 小時後，開始第一次腹腔注射 PS-F2 (50 mg/kg)，每兩天腹腔注射 PS-F2 一次，持續三週，實驗期間紀錄體重
變化及測量腫瘤生長情形。於試驗3 週後犧牲動物，採血分析血清抗體含量，取
脾臟及腫瘤組織秤重，並分析脾臟其 T 細胞及 B 細胞族群比例之變化。結果顯
示給予 PS-F2 對於小鼠體重變化與控制組給予 PBS 的生長相近，對小鼠生長無 顯著影響 (圖 3-7A)；但在接種 S180 腫瘤細胞後第十三天，腹腔注射 PS-F2 已有 顯著抑制腫瘤生長之效果 (圖 3-7B)，在第十九天犧牲小鼠時，以腫瘤重量計算，
相對於給予小鼠PBS 組，給予小鼠 PS-F2 顯著抑制 S180 之生長（p=0.006），其 抑制率達67.5 % (圖 3-8)。在另外兩次獨立的抗 S180 腫瘤試驗中，給予小鼠 PS-F2
0
Time after inoculation (day) Tumor size (mm3 ) PBS PS-F2
*
Days after tumor implantation
Body weight (g)
Days after tumor implantation
Body weight (g)
Tumor size (mm3 ) PBS PS-F2 cEPS40 cEPS80
*
圖3-7. PS-F2 對 S180 之抗腫瘤效果
Figure 3-7. Antitumor effect of PS-F2 in S180 tumor-bearing mice. The body weight (A) and tumor size (B and C) were monitored after inoculation.
S180 (2×106 cells) was subcutaneously implanted into BALB/c mice. PS-F2 (50mg/kg) was i.p. administered to mice (n=10) for 3 weeks starting from 24 h before inoculation (A and B). PS-F2 (50mg/kg), cEPS40 (40 mg/kg) and cEPS80 (80 mg/kg) were oral administered to mice (n=4) for 3 weeks starting from 24 h before inoculation (C).Control mice were treated with equal amounts of PBS alone on the same schedule. Data are the means ± SE. *P<0.05 compared to the control group.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Tumor
W ei ght ( g)
PBS PS-F2
**
(A)
(B)
圖3-8. PS-F2 對 S180 腫瘤生長之影響
Figure 3-8. Anti-tumor effects of PS-F2 in S180 tumor-bearing mice. The change of tumor weights (A) were determined after scarified. (B) is tumor picture after cut off.
S180 (2×106 cells) was subcutaneously implanted into BALB/c mice. PS-F2 (50mg/kg) was i.p. administered to mice for 3 weeks starting from 24 h before inoculation. Control mice were treated with equal amounts of PBS alone on the same
PBS
PS-F2
S180 腫瘤增殖有極佳的抑制效果。如以管餵方式給予 cEPS 和 PS-F2 (圖 3-7C)
來測試台灣紫芝的口服抗腫瘤效果時，高、低劑量的cEPS 都沒有抑制腫瘤生長
之效果，而PS-F2 的抑制率仍有 38.9 %。
檢測犧牲小鼠後取出的脾臟，給予 PS-F2 小鼠的脾臟重量沒有增減（圖 3-9）。分析脾臟細胞族群比例之變化時，CD3 的細胞比例由 39.76 ± 2.02%增加至 43.73 ± 1.64%，給予 PS-F2 小鼠的 T 細胞族群比例顯著提高 (圖 3-10A)，而且其 中CD4 與 CD8 之 T 細胞比例也分別由 15.44 ± 1.39%增加至 20.73 ± 2.25%以及 6.12 ± 0.45%增加至 7.78 ± 0.64%，均有增加之情形 (圖 3-10B)。而 NK 細胞比例
（5.91 ± 0.4%增加至 6.04 ± 0.4%）及細胞毒殺活性也有增加，但是沒有達到顯著 差異(圖 3-11)。在給予 PS-F2 之小鼠血清中，發現 IgM 抗體濃度也有顯著增加(圖 3-12)。
以上結果顯示 PS-F2 對 S180 之抗腫瘤活性推測是透過活化對腫瘤抗原具專 一性之CD4 與 CD8 T 細胞，藉由 CD8 細胞達到毒殺腫瘤細胞之效果，而 CD4
細胞也可能進一歩刺激B 細胞活化產生針對腫瘤抗原之抗體。
3. 台灣紫芝多醣體抗 B16 melanoma 腫瘤之活性
除了以 S180 腫瘤細胞之動物模式評估 PS-F2 抗腫瘤活性外，本研究另採用 以C57BL/6 小鼠皮下接種 B16 黑色素瘤細胞之同種腫瘤移植動物模式，評估台 灣紫芝多醣體PS-F2 之抗腫瘤活性。
C57BL/6 小鼠接種 B16 腫瘤細胞 24 小時後，開始第一次腹腔注射 PS-F2 (50 mg/kg)，每兩天進行腹腔注射 PS-F2 一次，試驗期間紀錄體重變化及測量腫瘤生
長情形。於試驗3 週後犧牲動物，採血分析血清抗體含量，取脾臟及腫瘤組織秤
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Spleen
W ei ght ( g)
PBS PS-F2
圖3-9. PS-F2 對接種 S180 小鼠脾臟重量之影響
Figure 3-9. Effect of PS-F2 on spleen weights in S180 tumor-bearing mice.
The spleen weights were determined after scarified. Data are the means ± SE (n=10).
0
Figure 3-10. Effect of PS-F2 on the populations of T and B cells (A) and CD4 and CD8 T cells (B) in splenocytes of S180-bearing mice.
The date are the means ± SE for each group (n = 10).
0
NK cell activity (%)
PBS PS-F2
圖3-11. PS-F2 對接種 S180 小鼠脾臟中 NK 細胞之影響
Figure 3-11. Effect of PS-F2 on the CD49b population (A) and NK cells activities (B) in S180 tumor-bearing mice.
Cytotoxicity of NK cells were assessed by measuring the lysis of the target YAC-1cells mediated by splenocytes from tumor implanted mice. Data are the means
± SE (n=10).
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
IgM IgG
A nt ibody ( µ g/ m l)
PBS PS-F2
**
圖3-12. PS-F2 對接種 S180 小鼠血清抗體濃度之影響
Figure 3-12. Effect of PS-F2 on serum IgM and IgG in S180 tumor-bearing mice.
The antibody levels were determined by ELISA. Data are the means ± SE (n=10).
**P<0.01compared to the PBS group.
重，並分析脾臟其 T 細胞及 B 細胞族群比例之變化。在小鼠體重方面，腹腔注 射PS-F2 小鼠體重雖比控制組輕，但扣除腫瘤重量時，腹腔注射 PS-F2 對於小鼠 體重變化無顯著影響 (圖 3-13A)；在接種 B16 腫瘤細胞後第十一天，腹腔注射 PS-F2 對 B16 腫瘤已有顯著抑制生長之效果 (圖 3-13B)，而於第二十一天犧牲小 鼠時，以腫瘤重量計算，腹腔注射PS-F2 可抑制 B16 腫瘤生長達 23.5 % ( p = 0.035) (圖 3-14A)。在另外兩次個別的 B16 腫瘤試驗中，給予小鼠 PS-F2 抑制 B16 腫瘤 生長分別是43.1 % (P = 0.039)和 23.7 % (P = 0.024)，PS-F2 對 B16 黑色素腫瘤細 胞亦有良好之抑制效果。
觀察犧牲後小鼠脾臟，給予小鼠 PS-F2 的脾臟重量顯著變大（圖 3-15）。分 析脾臟細胞族群比例之變化，CD3 的細胞比例由 53.34 ± 2.28%增加至 57.24 ± 2.87%，腹腔注射 PS-F2 使 T 細胞族群比例增加，但 B 細胞反而減少(圖 3-16A)。
T 細胞中的 CD4 比例也從 15.15 ± 0.77%增加到 17.12 ± 1.28% (圖 3-16B)。在 NK 細胞比例及細胞毒殺活性有些微增加，但是沒有達到具顯著差異(圖 3-17)。在給 予PS-F2 之小鼠血清中，發現 IgM 抗體濃度顯著比控制組 PBS 增加(圖 3-18)。
綜合以上結果顯示 PS-F2 之抗 B16 黑色素瘤活性推測也是透過活化對腫瘤 抗原具專一性之T 細胞，藉由 CD4 T 細胞活化進一歩刺激 B 細胞產生針對腫瘤 抗原之抗體，達到抑制腫瘤生長之效果。
4. 台灣紫芝多醣體抗 C26 腫瘤之活性
前面結果顯示 PS-F2 對 S180 及 B16 腫瘤細胞均有顯著性的抑制效果，為了 評估PS-F2 對各種腫瘤細胞生長抑制之廣度，另外以 BALB/c 小鼠皮下接種 C26
腫瘤細胞之同種腫瘤移植動物模式，評估台灣紫芝多醣體PS-F2 之抗腫瘤活性。
0
Days after tumor implantation
Body weight (g)
Time after inoculation (day)
Tumor size (mm3 ) PBS PS-F2
*
Figure 3-13. Antitumor effect of PS-F2 in B16 tumor-bearing mice. The body weight (A) and tumor size(B) were monitored.
B16 (1×106 cells) was subcutaneously implanted into C57BL/6 mice. PS-F2 (50mg/kg) was i.p. administered to mice for 3 weeks starting from 24 h before inoculation. Control mice were treated with equal amounts of PBS alone on the same schedule. Data are the means ± SE (n=10). *P<0.05; **P<0.01 compared to the PBS group.
(A)
0 2 4 6 8 10 12 14
Tumor
W ei ght ( g)
PBS PS-F2
*
(B)
圖3-14. PS-F2 對 B16 腫瘤生長之影響
Figure 3-14. Anti-tumor effects of PS-F2 in B16 tumor-bearing mice. The change of tumor weight(A) was determined on day 21. (B) is tumor picture after cut off.
B16 (1×106 cells) was subcutaneously implanted into C57BL/6 mice. PS-F2 (50mg/kg) was i.p. administered to mice for 3 weeks starting from 24 h before inoculation. Control mice were treated with equal amounts of PBS alone on the same
PBS
PS-F2
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Spleen
W ei ght ( g)
PBS PS-F2
**
圖3-15. PS-F2 對接種 B16 小鼠脾臟重量之影響
Figure 3-15. Effect of PS-F2 on spleen weights in B16 tumor-bearing mice.
Data are the means ± SE (n=10).
(A)
Pe rc en ta ge o f p os itiv e c ell s
PBS PS-F2*
P er cen ta ge o f p os iti ve cel ls
PBS PS-F2圖3-16. PS-F2 對接種 B16 小鼠脾臟細胞族群比例之影響
Figure 3-16. Effect of PS-F2 on the populations of T and B cells (A) and CD4 and CD8 T cells (B) in splenocytes of B16 melanoma-bearing mice.
The date are the means ± SE for each group (n = 10). *P<0.05 compared to the PBS group.
(A)
P er cen ta ge o f p os iti ve cel ls
PBS PS-F2(B)
NK cell activity (%)
PBS PS-F2
圖3-17. PS-F2 對接種 B16 小鼠脾臟 NK 細胞之影響
Figure 3-17. Effect of PS-F2 on the CD49b population (A) and NK cells activities (B) in B16 tumor-bearing mice.
Cytotoxicity of NK cells were assessed by measuring the lysis of the target YAC-1cells mediated by splenocytes from tumor implanted mice. Data are the means
± SE (n=10).
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
IgM IgG
A nt ibody ( µ g/ m l)
PBS PS-F2
**
圖3-18. PS-F2 對接種 B16 小鼠血清抗體濃度之影響
Figure 3-18. Effect of PS-F2 on serum IgM and IgG in B16 tumor-bearing mice.
The antibody levels were determined by ELISA. Data are the means ± SE (n=10).
**P<0.01 compared to the PBS group.
BALB/c 小鼠接種 C26 腫瘤細胞 24 小時後，進行第一次腹腔注射 PS-F2 (50 mg/kg)，每兩天進行腹腔注射 PS-F2 一次，試驗期間紀錄體重變化及測量腫瘤生
BALB/c 小鼠接種 C26 腫瘤細胞 24 小時後，進行第一次腹腔注射 PS-F2 (50 mg/kg)，每兩天進行腹腔注射 PS-F2 一次，試驗期間紀錄體重變化及測量腫瘤生