Real-time 分析

4.3.4.1 Internal Inhibitor Control (IIC) 樣本測試

環境樣本中的 DNA 萃取物中可能含有 PCR 放大抑制物，會造成 qPCR 分析 時未能有效放大 DNA 而被儀器偵測，使得 DNA 濃度定量上有低估的情形，當 樣本進行適當稀釋後，PCR 抑制物也會同步被稀釋，因此可藉由稀釋方式使抑 制物達到去除或不影響 DNA 放大的效果 (C.A Heid, J Stevens, K.J Livak, et al, 1996)，本研究將雨刷水 DNA 樣本則進行 5 倍及 10 倍的 DNA 稀釋，自來水樣 本則是進行 5 倍的 DNA 稀釋。

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用 LightCycler^® 480 System (Roche Diagnostics GmbH, Basel, Switzerland) 進 行各樣本中 IIC 分析，其 IIC 為 neomycin phosphotransferase gene (GenBank Accession No. V00618)的片段 (bp 472-603)中截取之 DNA (Chen et al., 2010)，故 研究中可同步進行分析 Legionella spp. 及 IIC 測試。

每個待測樣本中加入 1l internal inhibitor control (IIC, Biotech)及 300 nM 的 IIC probe (5'-Red610-TGCAATGCGGCGGC-3')於 Legionella spp. PCR 混合試劑中，

並加入 5l 環境 DNA 樣本同步進行 IIC 樣本抑制及 Legionella. spp.濃度測試，

每批次分析中皆含有 IIC control，以 PCR 無菌水 (Roche Diagnostics)取代 5l Legionella DNA 樣本於添加有 IIC 的 PCR 混合試劑中，藉此確認每批次 IIC 測 試皆有正常範圍的放大效率。

試劑 體積 / 樣本 (l) 最終濃度

2× probe master mix (Roche) 10 1×

Leg_forward primer (10M) 0.6 300nM Leg_reverse primer (10M) 0.6 300nM

Leg probe (10M) 0.6 300nM

IIC probe (10M) 0.6 300nM

IIC 1 25fg/PCR

Sterile water 1.6 -

利用在樣本中添加已知 DNA 濃度範圍的 IIC，確認最佳稀釋濃度樣本未受 到抑制物影響，選取 IIC 已知濃度標準為其 Ct 平均值+SD 作為濃度範圍標準值，

若環境樣本之 IIC Ct 值低於此標準值，則視為通過 IIC 測試，而當環境樣本之 IIC Ct 值高於此標準值，視為樣本中的 PCR 抑制物尚未完全去除，則 IIC 濃度 會同步抑制而無正常放大，必須再次進行更多倍數稀釋，並於稀釋後重複進行 Legionella spp.濃度及 IIC 測試，直至 IIC 測試符合標準，並以 IIC 測試符合標

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準時所得樣本稀釋倍數及濃度視為該樣本的 Legionella. spp.濃度。

4.3.4.2 Legionella. spp.real-time PCR 分析

Real-time PCR 之分析方法用 LightCycler^® 480 System (Roche Diagnostics GmbH, Basel, Switzerland)進行各樣本中 Legionella. spp.濃度分析，並利用 LegF (5'-CGAGCGCAACCCTTATTGTTAGT)及 LegR (5'-GTCACCGGCAGTCTCATTA GAG)兩種 primer 來辨識及定量 16S rRNA 中的 67-bp 區域之基因，並將其基因 片段進行放大後，搭配 Legionella-specific TaqMan MGB probe (5'-FAM-TCCCC GCCATTACATG -MGBNFQ-3')來進行偵測 (Chen and Chang. 2010)。

定量 Legionella. spp.的混合試劑 (20 l)中含有 10l 之 LightCycler® 480 Probes Master Mix (Roche Diagnostics)，300 nM 之 primers (Mission Biotech Co., Taipei, Taiwan)，300 nM 的 TaqMan MGB probe (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)，及 5l 環境 DNA 樣本或是 Legionella spp. DNA 標準品，因 Legionella spp.樣本與 Internal Inhibitor Control 樣本進行同步分析，於 Legionella spp.混合 試劑中另外亦會加入 IIC control。

用以 L. pneumophila 分析之 PCR 反應設定如下，先進行 10 分鐘於 95℃下之 活化作用後，進行 50 次的放大步驟 (95℃下 10 秒及 60℃下 1 分鐘)，最後在 40

℃下冷卻 10 秒鐘完成 real-time PCR 之結果分析與定量。

Legionella spp.標準品利用 DNA 萃取生長於 BCYEα agar 上之 L.pneumophila SG1 (ATCC33152)，並以吸光值 A260nm 定量其濃度，再利用 TE buffer 進行標

Program Cycle Temperature Time

Pre-incubation 1 cycle 95℃ , 10 mins Amplification 50 cycles 95℃ 10 secs

60℃ 1 min

Cooling 1cycle 40℃ 10 secs

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準品稀釋後，配置 Legionella spp.標準品檢量線濃度範圍在 2.33~2.33×10⁵ cells/μl，

其範圍含蓋本研究中環境樣本之濃度分布。

4.3.4.3 L. pneumophila real-time PCR 分析

選擇有最高的 Legionella spp.濃度以及通過 IIC 測試的稀釋倍數，進行 L.

pneumophila real-time PCR 分析，其分析同樣使用 LightCycler^® 480 System (Roche Diagnostics GmbH, Basel, Switzerland)進行，並利用 mip-LpF (5'-ACAC TGGTCGTCTGAT) 及 mip-LpR (5'-CCAATAGGTCCGCCAA)來辨識及定量 L.

pneumophila 中的 193-bp 區域之基因，並將其進行放大後，搭配 mip-specific TaqMan MGB probe (5'-FAM-CCATAAGCAAGACCTGC-MGBNFQ-3') 來進行偵 測 (Chen and Chang. 2010)。

PCR 偵測定量 L. pneumophila 之混合試劑 (20 l)中含有 12.5 l 之 LightCycler® 480 Probes Master Mix (Roche Diagnostics)，375 nM 之 primers (Mission Biotech Co., Taipei, Taiwan)，及 375 nM 的 TaqMan MGB probe (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)，最後加入 5l 萃取之環境 DNA 樣本或是 L.

pneumophila DNA 標準品，每批次分析樣本會有一組加入 PCR 無菌水 (Roche Diagnostics) 作為陰性樣本。

標準品為利用 Mission Biotech 公司合成之 L. pneumophila，並偵測其基因表

試劑 體積 / 樣本 (l) 最終濃度

2× probe master mix (Roche) 12.5 1x Lp_forward primer (10M) 0.75 375 nM

Lp_reverse primer (10M) 0.75 375 nM

Lp probe (10M) 0.75 375 nM

Sterile water 0.25 1x

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現量 (copies/ng) 為 3.1×10⁸ copies/ng，本研究利用 TE buffer 進行標準品稀釋後，

配置 L. pneumophila 標準品檢量線濃度範圍在 3.1×10^-1 ~ 3.1×10⁵ copies/μl 此範圍 含蓋本研究中環境樣本分析結果之濃度分布情形。

用以 L. pneumophila 分析之 PCR 反應設定如下，先進行 10 分鐘於 95℃下之 活化作用後，進行 50 次的放大步驟 (95℃下 10 秒及 60℃下 1 分鐘)，最後在 40

℃下冷卻 10 秒鐘完成 real-time PCR 之結果分析與定量。

每批次標準品於 real-time PCR 分析完後，利用各濃度 L. pneumophila DNA 標準品所得之 Ct 值與已知的相對應 log DNA copy numbers 製作 L. pneumophila 標準檢量線，每批次 real-time PCR 反應的放大效率及檢量線迴歸係數之 R²將經 由 real-time PCR 反應後確認結果是否正常，而每批次所得的檢量線將用以定量 環境樣本中 L. pneumophila 濃度。

4.3.5 培養法分析