行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
內皮細胞化之左心室輔助導管材料對葉克膜體外維生系統
病患血小板及其聚集之探討
計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC91-2320-B-002-143- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學醫學院外科 計畫主持人： 王水深 計畫參與人員： 王水深 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 12 月 8 日
台大一號心室輔助器長期動物實驗及生物控制器的研發-內皮細胞化
之左心室輔助導管材料對葉克膜體外維生系統病患血小板及其聚集
之探討
緣由與目的
本研究原來擬將 PU 或其它材料 如:幾丁聚醣膜，改質後，再進行細胞 培養，將含有細胞於表面的材料，進 行病患的血液接觸並測試血液接觸 後，材料表面血液貼附的情形。本研 究首先進行 一、PU 薄膜表面內皮細胞化的建立。 二、以 MTT 法確定細胞活性。 三、病患使用 ECMO 後之血液進行材 料接觸分析。作為 ECMO 病患血 液中血小板對材料內皮細胞化之 效應。 本研究順利完成一及二項。另外，對 幾丁聚醣材料經不同固化劑固化後， 對血液相容性進行測試。然而對第三 項，病患血液之相容性之測定，因為 本年度三月初到六月中旬，SARS 疫情 在國內發生，為了學生及研究者的安 全因素及醫院管理上限制而未進行。 以下的報告，將完成的成果，列於下。實驗步驟
(1)PU，PU-PEG，PU-PEG-GRGD， chitosan 薄膜製備。 以分子量 2000 的 PEG 接枝於 PU 材料表 面，形成 PU-PEG[1，2]，再以光化學反 應的方式使 GRGD 接枝於 PU-PEG 材料 表面形成 PU- PEG- GRGD[2，3]。(2)Chitosan 以酒精、sodium citrate
及 TPP 固化。 (3)PU 系統－細胞培養，MTT 細胞活 性測試。 PU-PEG、PU-PEG-GRGD 等材料進 行細胞培養，以螢光顯微鏡觀察細 胞生長的情況並做 MTT 細胞活性測 試。 (4)Chitosan－血小板黏著測試。
結果與討論
圖 1 與圖 2 為 PU-PEG、PU- PEG-GRGD 材料表面經原子力顯微鏡 測量之表面型態[4]。內皮細胞放置於 材料表面貼附生長 24 小時，製備完成 的 PU-PEG、PU-PEG-GRGD 薄膜表面 上皆有內皮細胞黏著貼附，如圖 3、圖 4 所示，PU-PEG-GRGD 的細胞貼附密 度比 PU-PEG 高 40%; Arg-Gly-Asp （RGD）peptide 為可供細胞辨識並與 之黏著的最小序列蛋白質結構；所 以，接枝上 GRGD peptides 的材料表 面，細胞生長情形較好。PU-PEG 與 PU-PEG-GRGD 做 MTT 細胞活性測試 來比較其細胞生長情形;由圖 5 可知， PU-PEG- GRGD 的生長速率亦較佳於 PU-PEG，得知 PU- PEG-GRGD 材料 表面細胞貼附生長的效果較好。圖 6、圖 7 為內皮細胞在材料上 24 小時之生長情形。由圖所示， chitosan 接枝上 GRGD 的材料，其內皮 細胞貼附生長密度比未接枝的
chitosan 材料高。
Chitosan 材料經由 Sodium citrate 固化，在細胞培養中，經由培養液處 理後，血小板之吸附量為酒精法處理 之吸附量的 1/100 左右(如圖 8、圖 9); 同時對細胞培養沒有影響，故可確認 Sodium citrate 處理的 chitosan 膜具有最 佳組織工程化之材料條件。
未來建議
tirofiban 是抑制血小板 GP IIb/IIIa 的活化，來達到抑制血小板凝集的作 用，用於患有冠狀動脈缺血症狀而須 接受冠狀動脈血管成形術，氣球擴張 術，避免血栓阻塞冠狀動脈。如圖 10 所示，本實驗室以藥物釋放的方式包 覆 tirofiban 能有效的防止血小板活 化所導致凝血現象，所以未來本系統 可加入 tirofiban 以提升抑制凝血的 功效。謝誌
感謝國科會計畫獎助 NSC 91- 2320– B- 002- 143- 使本論文得已完成。參考文獻
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圖 2.PU-PEG-GRGD 材料表面 圖 3.PU-PEG 材料表面細胞螢光圖(100x) 圖 4.PU-PEG-GRGD 材料表面 細胞螢光圖(100x) 圖 6. chitosan 材料表面細胞螢光圖(100x) 圖 7.chitosan-GRGD 材料表面 細胞螢光圖(100x) 0 1 2 3 4 R e la ti v e c e ll gr ow th r a te ( % ) 0 20 40 60 80 100 120 結果: PS > PU-PEG2000-GRGD > PU-PEG2000 圖 5.MTT 細胞活性測試 1.PS; 2.PU-PEG2000; 3.PU-PEG2000-GRGD
圖 8.以檸檬酸鈉固化後之 Chitosn 對 血小板貼附 SEM 圖 圖 9.以酒精固化後之 Chitosn 對 血小板貼附 SEM 圖 (a) (b) (a)已活化的血小板 (b)Tirofiban 釋放後之血小板 圖 10.
