砷與移行細胞癌之毒理基因體研究─（子計畫三）人類移形上皮癌之基因表現檔案－尋找與砷有關之致癌機轉及調整化學治療處方（3/3）

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

（子計畫三）人類移形上皮癌之基因表現檔案－尋找與砷有

關之致癌機轉及調整化學治療處方（3/3）

計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC93-3112-B-002-008- 執行期間： 93 年 05 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學醫學院泌尿科 計畫主持人： 蒲永孝 計畫參與人員： 李德章、侯自銓、林家齊、王壯維、官靜儀、王榮蓮 報告類型： 完整報告 報告附件： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 11 月 1 日

摘要

先前二年研究當中，我們計畫以cDNA基因列陣，找出具不同化學敏感度腫 瘤之特殊基因表現模式，但是由cDNA基因列陣結果挑出標的基因後，進一步以 real-time PCR, Western blotting和免疫組織染色法確認，發現大部分與DNA基 因 列 陣 結 果 不 相 符 合 ， 因 此 我 們 決 定 直 接 探 討 蛋 白 質 層 次 ， 以 蛋 白 質 學 (Proteomics)技術，探討在不同抗藥性之膀胱癌細胞株中，有那些分子受到影響 而有表現量的變化，藉以尋找膀胱癌之抗藥機轉。進而討膀胱癌細胞株其抗藥性 之分子機制。我們利用先前已建立具抗藥性之五株膀胱癌細胞株，分別對臨床上 常用的五種抗癌藥物：doxorubicin 、cisplatin、gemcitabine、paclitaxel (taxol) 與arsenic trioxide具抗藥性。利用蛋白質體學(Proteomics)技術，探討在不同抗 藥性之膀胱癌細胞株中，有那些分子受到影響而有表現量的變化，藉以尋找膀胱 癌之抗藥機轉。我們找出24個有表現差異的蛋白質點，其中我們先以Rac1蛋白 質做一系列研究，以Western blotting發現具paclitaxel與cisplatin抗性之細胞株其 Rac1蛋白之表現量有明顯增加，其它細胞株則有被抑制現象。不過Rho家族的 成員之一,RhoA和Cdc42在這些抗藥性細胞內表現量並無差異。利用lovastatin 抑制細胞膜上Rac1表現實驗中發現，以Lovastatin (10 µM)加入具cisplatin抗性 之細胞株，經過六小時、十二小時、二十四小時及四十八小時之後，以Western blotting分析發現在十二小時Rac1有被抑制下來，但在二十四小時及四十八小時 之後，Rac1似乎有回復的現象。同時以流式細胞儀觀察lovastatin抑制細胞膜上 Rac1表現時細胞週期之改變，結果發現在8小時細胞有18.8 %產生Sub-G1，另 外在6、8、12小時細胞有停留在S期的現象。另外我們也發現paclitaxe(太平洋 紫杉醇)處理細胞，會增加超氧化物(superoxide)、過氧化氫 、硝酸氧化物(NO), 氧化態的DNA adducts、G2-M期滯留, 和產生核碎片。這些結果建議, 活性氧及 活性氮物質會牽涉到paclitaxel的細胞毒性(cytotoxicity).所以paclitaxel的化學治 療敏感性可以從細胞樣本測得的總抗氧化容量來預報得知.故本研究找到這些分 子表現差異的蛋白質，對解開膀胱癌抗藥性機轉有所助益，但是否能成為具抗藥 性之膀胱癌診斷的分子標記則須再進一步的研究。 2

緒論

泌尿上皮細胞癌(urothelial cell carcinoma, UCC) 是泌尿系統最常見的惡性 腫瘤。治療轉移性 UCC 是以化學治療為主(1,2)，尤其是以 cisplatin 為主的各 種處方。 一般治療反應率可達 45 至 70%，但毒性不小，且必需有良好的腎 功能，台灣地區約 3 成的 UCC 病人因為腎功能不全，因此必需減低化學治療 劑量，使治療效果打折扣，也使病人對化學治療之忍受度降低。為了改善化學治 療的成績，過去幾年來許多人作了一些努力，包括在實驗室探究UCC 化學抗藥 性的機轉，及其反制之道；將化學治療調控制應用在臨床試驗上(3)；設計低毒 性化學治療處方，以符合台灣地區某些病人的特性；根據既有之經驗，開發一系 列化學治療新處方，以提昇臨床療效。 自從二十世紀初化學藥物被證實可以治療惡性腫瘤那一刻起，科學家便積極

參與新藥的研發。到了1970 年代，由於 5-FU、Cisplatin 及其他 Alkylating agent

陸陸續續開發製造(4-8)，使得化學治療進入新的紀元，這些藥物不僅具有抗癌 能力，而且對人體毒性也降低不少，因此不管單一或綜合使用皆有不錯的療效，

成為近代抗癌治療之主流。自從八○年代 Sternberg 醫師發展出合併使用

methotrexate 、 viblastine、 doxorubicine 以及 cisplatin 等化療藥物(MVAC)， 發現它對轉移性膀胱癌具有相當優異的療效以來(總反應率高達 50%以上)， MVAC 一直為美國醫師廣泛使用於轉移性泌尿道移形上皮癌之治療，且其療效已 有前瞻性隨機分配臨床試驗證實較單獨使用Cisplatin 來得優異(3)。單用化療不 易將癌細胞完全消滅。有些化療藥物開始使用時療效很好，但幾個療程以後，癌 細胞即產生抗藥性，使化療失效。移行上皮癌之化學治療反應率約50%至 70% 左右，但是絕大多數之病人最後仍因腫瘤出現抗藥性再發而死亡，因此如何降低 毒性及提昇療效，一直是臨床腫瘤學重要之課題。 近來，抑制細胞程序性死亡被認為是重要的致癌機轉。當細胞的程序性死亡 過程被抑制時，細胞有較高的機會累積各種基因的突變；同時細胞有較強的抗化 學治療藥劑的能力，而不被化療藥劑毒殺。 抗藥性可分為三方面來討論： 1. 細胞抗藥性動力學：主要的原因是因為大部分腫瘤的 Growth fraction 低。 2. 化學藥物抗藥性之影響(Biochemical causes of resistance)：

特別值得一提的是，Multidrug resistance (MDR)已成為腫瘤化療中一個影 響治療效果的關鍵性因素。MDR 得名的原因是腫瘤細胞在抗腫瘤藥作用一段時 間後，不僅對該藥物會產生抗藥性，而且對其它許多結構差異極大的抗癌藥也會

產生抗藥性。已經發現MDR 主要與體內一大類稱作 ATP-binding Cassette (ABC)

Transporters 的 蛋 白 有 關 ， 這 是 一 類 廣 泛 存 在 於 原 核 和 真 核 細 胞 中 的 Energy-Dependant Efflux Pumps，其中對 P-glycoprotein (P-gp)的研究最為深 入。從稍早的研究知道，雖然僅有 20% 的 UCC 細胞株會表現 mdr-1，但 mdr-1 在次發抗藥性 (包括 doxorubicin 及 cisplatin) 之細胞株很易被誘發出來(5)。 目前已有多種抑制 P-gp 作用的小分子被發現，甚至研發成對抗 MDR 的有效藥

物。也有一些小分子可以作為某種抗癌藥如Taxol 與 P-gp 的競爭性結合劑，從

而使Taxol 不能與 P-gp 結合並被排出細胞外(5)。Combination therapy 特別是

合併如Calcium channel blockers、Antiarrhythmics 或 Cyclosporin A 等可以克

服此種MDR 之影響。

3. 藥理抗藥性(Pharmacologic causes of resistance)：藥理抗藥性的產生主要是 由於化學藥物無法有效的運送到組織細胞間。 研究目的 移行上皮癌之化學治療反應率約50%至70%左右，但是絕大多數之病人最 後仍因腫瘤出現抗藥性再發而死亡，因此如何降低毒性及提昇療效，一直是臨床 腫瘤學重要之課題。本研究中，原本我們計畫以cDNA基因列陣，找出具不同化 學敏感度腫瘤之特殊基因表現模式，建立一個以個別病人基因表現為基礎的藥物 選擇機制 (drug-selecting algorithm)，以提昇治療效果。方法是，先建立一群UC 細胞株 (包括敏感及抗藥株)對各種藥物之敏感度資料，再將各細胞，進行數千 組基因之cDNA基因列陣之研究，找出對每種藥物敏感度有關之特殊表現基因 組，再製作另一個cDNA基因列陣。此第二級基因列陣，可能包含數百個藥物敏 感度相關基因，其表現可以預測對每一種藥物之敏感度或抗藥性程度。因此可以 建構一個藥物選擇機制。後來因為cDNA基因列陣結果挑出標的基因後，進一步 以real-time PCR, Western blotting和免疫組織染色法確認，發現大部分與DNA 基因列陣結果不相符合，因此我們決定直接探討蛋白質層次，以蛋白質學 (Proteomics)技術，探討在不同抗藥性之膀胱癌細胞株中，有那些分子受到影響 而有表現量的變化，藉以尋找膀胱癌之抗藥機轉。

材料與方法

材料

(一) 細胞株: ● 烏腳病地區之膀胱癌細胞株 BFTCC909 ● 非烏腳病地區之膀胱癌細胞株與所衍生的抗藥株 T24 T24 / D T24/Doxorubicin (0.4 µM) resistant NTUB1

NTUB1/G NTUB1/Gemcitabine (0.3 µM) resistant

NTUB1/T NTUB1/Paclitaxel (0.005 µM) resistant

NTUB1/P NTUB1/Cisplatin (14 µM) resistant

NTUB1/As NTUB1/Arsenic trioxide (0.5 µM) resistant 得自台大醫院泌尿科蒲永孝醫師核心實驗室(Fig 1.)。 (二) 培養基 : RPMI-1640 medium： 取一包RPMI-1640 培養基粉末，加入 4.4 g的NaHCO3，溶於1000ml 之去離子水中，調pH至 7.2，過濾以確保無菌，存放於 4 ℃冰箱中。 (二) 抗癌藥物(Chemotherapeutic agents) :

(1) Paclitaxel (Taxol): Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ08543, USA (2) Gemcitabine: Lilly France,S.A.S., F-67640 Fegersheim, France

(3) Doxorubicin: Pharmacia&Upjohn S.p.A., Viadel Murillo Km, 2800 Sermoneta, Italy

(4) Arsenic trioxide: Sigma chemical Co.P.O. Box, USA

(5) Cisplatin: Bristol-Myers Squibb S.p.A., Viadel Murillo Km, 2800 Sermoneta, Italy

實驗方法

(一) 細胞培養:

人類膀胱癌細胞株T24、T24/Doxorubicin (0.4 µM)、BFTCC909、NTUB1、

NTUB1/Gemcitabine (0.3 µM)、NTUB1/Paclitaxel (0.005 µM)、NTUB1/Cisplatin

(14 µM)、NTUB1/Arsenic trioxide (0.5 µM)(得自台大醫院泌尿科蒲永孝醫師核

心實驗室)，分別培養於 10 %胎牛血清(Fetal bovine serum)的 RPMI-1640 的培

養 基( 內 含 100 unit/ml Penicillin-G ， 100 µg/ml streptomycin 和 2 mM L-glutamine) ，上述細胞株皆培養 37℃，溼度 9.8 % 含 5 %二氧化碳之培養箱 中培養。

(二) 繼代培養(Cell Culture) :

細胞長滿後，以1X PBS 緩衝液清洗二次，加入 0.5 ml 1X Trypsin-EDTA 溶液，於37 ℃細胞培養箱作用 2 ~ 5 分鐘，待細胞剝落後，立即加入細胞培養 液，並將之吸至無菌離心管，以1000 rpm 離心 5 分鐘，移除上層液，接著加入 10 mL 培養液，並均勻打散細胞，再取 1/4 的細胞數移至新的培養皿生長。

(三) 西方點墨法(Western blotting) :

1. 細胞溶解物之(cell lysate)之製備： 將培養皿內培養液吸走，以冰冷1XPBS 沖洗細胞二次，再將培養皿內殘餘 液吸淨，接著加入含蛋白酵素抑制劑(Protease inhibitor)的細胞溶解緩衝液(RIPA lysis buffer)約 50 µL 至培養皿中，隨即用刮勺將細胞刮下，取 Cell lysates 到 Eppendorf 中，放置冰上 30 分鐘之後，在 4 ℃下高速離心 12000 rpm，15 分鐘， 吸取上清液(注意勿觸及沉澱物)到新的 eppendorf，儲存在-20 ℃冰箱中，待用。

2. 蛋白質定量(protein normalization)：

以PIERCE 的 BCA Protein Assay Reagent Kit 來定量，拿牛血清白蛋白

(Bovine serum albumin, BSA) 作標準品，波長 562 nm，於紫外光可見光光譜 儀(BECKMAN)畫出標準曲線(校正係數需在 0.998 以上)，測出檢體的蛋白質吸

光度，並利用內插法算出樣品的濃度。製備定量成濃度為50 µg 的蛋白質檢體，

再進行蛋白質電泳。

3. 凝膠電泳分離(SDS-PAGE)分析：

以 Sodium dodecyl sulfate-polacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

來分離不同分子量大小的蛋白。配製12 %分離膠(Resolving gel)、4 %的焦集膠

(Stacking gel)及 1XSDS 電泳緩衝液(Running buffer)，並將 1XSDS 電泳緩衝液

倒至整個壓克力槽中，蓋過所需的最低高度，取每管含總濃度50 µg 的蛋白質樣

品，加入適量之2XSDS / Protein loading buffer，在 100 ℃沸水中煮沸三分鐘，

以利蛋白質樣本的展開(Denature)，之後立即放入冰中冷卻，再注入 12 % SDS-PAGE 的 well 中，然後以 120 V 進行電泳分離，待指示染劑，跑至適當位 置時(約距膠體底部一公分處)，停止電泳取出膠體，直接進行免疫轉漬分析 (Immunoblot transfer analysis)。

4. 轉漬(Transfer)：

蛋白質檢體在跑完 SDS-PAGE 之後，我們接著進行轉漬，也就是將跑完電 泳 的 gel 的 蛋 白 質 透 過 電 轉 印 緩 衝 液 (Electrotransfer buffer) 和 電 轉 印 槽

(Electrotransfer tank)轉漬到 PVDF 薄膜(PVDF membrane)上。首先裁剪二張 3MM filter paper 及預先準備適當大小之 PVDF 薄膜，以甲醇(Methanol)浸潤一

分鐘，使其活化，之後將活化後的PVDF 薄膜及 3MM filter paper 浸於電轉印緩

衝液中，去掉Stacking gel，小心拿起 Resolving gel，先以轉漬緩衝液浸濕，依

序以3MM filter paper、gel、PVDF membrane、3MM filter paper 的鋪疊方式，

再以二張海綿網夾住置於電轉印槽，在安培數400 毫安培的電流自負極到正極，

約1 個小時的條件下，將電泳凝膠上的蛋白質由膠體轉漬到 PVDF 薄膜上。

5. 覆蓋膜之非特異性的結合位置(Blocking)：

配製 10 mL 含 1 % BSA 的 Blocking buffer，將完成轉漬作用的 PVDF 薄膜 浸泡於其中，置於雙向震盪器(ORBITAL SHAKER)上緩慢震盪，於 4 ℃隔夜反 應，目的是將薄膜上的空隙填滿。

6. 抗原、抗體結合反應(Hybridization)：

第二天將 Blocking buffer 倒掉，以 0.1% PBST buffer 清洗三次，每次 5 分 鐘，然後配一次抗體(Primary antibody)，以 TBST buffer 稀釋之(稀釋倍數依不 同的一次抗體所需要的條件也會不同)。接著將 PVDF 薄膜放到含一次抗體的 TBST buffer 中，置於雙向震盪器(ORBITAL SHAKER)上緩慢震盪，室溫一小

時，目的是讓PVDF 薄膜吸附表面的抗原蛋白。之後將含一次抗體的 TBST buffer

倒掉，以0.1% PBST buffer 清洗三次，每次 5 分鐘，再放入含二次抗體(Second

antibody)的 TBST buffer，於室溫緩慢震盪一個小時，最後以 0.1% PBST buffer

清洗三次，每次5 分鐘。 7. 呈色、壓片： 實驗於暗房中避光進行，取 1 mL 的呈色劑 A 和呈色劑 B 混合均勻，將 PVDF 薄膜放入，反應 1 分鐘，之後使 PVDF 薄膜正面朝上，固定於感光夾內的透明 投影片，再將 X 光感底片(X-film)覆蓋其上，夾住後控制時間進行壓片，時間到 將X 光感底片拿出，洗片於沖片機。

(四) 二維凝膠電泳(

Two-dimensional electrophoresis)

壹、樣品處理： 當細胞達到八~九成滿時 (注意：同一批實驗所用的細胞需培養時間需相 同，且至少需48 小時培養) ，移除舊的 Medium，以 1XPBS 緩衝液清洗二次，

加Trypsin Incubation 數分鐘並輕拍 Dish，加新的 Medium 中和，離心 1000-1500 rpm，5 min。用 1 × PBS Wash 一次，離心 1000-1500 rpm，5 min，移除上清

液，加入200 µL Lysis Buffer 並 Vortex，15000 rpm，15 min，4 ℃，收上清

液(注意不要吸到黏稠物)，置於冰上。(細胞處理的空檔，可先將 Strip 泡在 Rehydration buffer，6 hrs 以上最多不超過 24 hrs (Strip pH = 3-10，Rehydration buffer 必須也是 pH = 3-10)。（Rehydrate Immobiline DryStrip gels using Immobiline DryStrip Reswelling Tray，2-3 ml/well Rehydration Buffer，storage

in -20 ℃) Strip 與 Rehydration buffer 之間不能有氣泡)。 貳、蛋白質定量：

利用 Amersham 的 2-D Quant Kit 來定量蛋白質，測定方法依照廠商所附之

Protocol。

參、First dimensional electrophoresis：

先取 Sample 與 Sample buffer (等體積 1 : 1)混合均勻之後，超音波震盪 (Sonication) (室溫，10 min)，再移置 37 ℃水浴(30 min)，最候離心(15000 rpm， 10 min)，收上清液，將 Sample 注入 Cup 裡，跑等電位點聚焦(Iso-electric focusing, IEF)。 IEF 之條件: (1) 500 V, 3 hrs (2) 1000 V, 3 hrs (3) 2000 V, 10 hrs (4) 2000 V, 6 hrs

肆、Secondary dimensional electrophoresis：

取出Strip，將膠面朝上(有 Sample 那面)在擦手紙上把 Cover oil 吸淨，將

Strip 置於 Box 上，倒入 Balance buffer(一個 Box 10 mL) (Shaker, 40 rpm, 15 min)，取出 Strip 在擦手紙上把 Balance buffer 吸淨並放入 Strip，放 Sample APPL PIECE 於正極處，並接觸 Separating gel，開始電泳分析。

Separating 之條件: (1) 200 V (2) 40 mA (一片 gel 20 mA) (3) 最高可跑 250 V，一片 gel 25 mA (4) 藍色的 Dye 跑到跳海為止 伍、銀染(Silver stain)： (1) 配 Fixation solution： Ethanol 100 mL

Acetic acid glacial 25 mL Add ddH2O to 250 mL

取下Gel 在右上角切一角作記號，倒入 Fixation solution，Shaker 40 rpm (可

Overnight 或 30 min 繼續下一個步驟)。 (2) 配 Sensitizer solution： Ethanol 75 mL Glutardialdehyde (25%) 1.25 mL Sodium thiosulphate (5%) 10 mL Sodium acetate 17g Add ddH2O to 250 mL

吸淨Fixation solution，倒入Sensitizer solution (Shaking 40 rpm)，30 min。以

ddH2O Wash 3 次，每次五分鐘(Shaker, 40 rpm)。 (3) 配 Silver reaction：

Silver nitrate solution (2.5%) 25 mL Formaldehyde (37%) 0.1 mL (要用再加) Add ddH2O to 250 mL

倒入Silver reaction (Shaking 40 rpm)，20 min。以ddH2O Wash 2 次，每次一

分鐘(Shaker, 40 rpm)。

(4) 配 Developing solution：

Sodium carbonate 6.25 g

Formaldehyde (37%) 0.05 mL (要用再加) Add ddH2O to 250 mL

倒入Developing solution 並以手搖晃，當 2 片 Gel 所呈現出的 Spots 約相當時，

即可停止。

(5) 配 Stopping solution：

EDTA – Na2‧2H2O 3.65 g

Add ddH2O to 250 mL

吸淨Developing solution，倒入Stopping solution (Shaking 40 rpm)，10 min。

以ddH2O Wash3 次，每次五分鐘(Shaker, 40 rpm)。將gel夾在二片投影片中，

進行掃描。

陸、In-gel Digestion：

前置作業：

(1) 將 650 µL Microtubes (Siliconized)與 Tips (Siliconized)，先用甲醇浸泡過， 再用去離子水洗掉甲醇並烘乾。

(2) 將 200 µL Tips 尖端剪成直徑約 1 mm ~ 2 mm 的大小。 方法：

在無菌操作台(Laminar flow)裡將 Spots 挖下，放入 650 µL Microtubes (Siliconized)中，把水去除留下 Gel。

(1) 退染：加入 100 µL Destain solution (30 mM Potassium ferricyanide 與 100 mM Sodium thiosulfate，以 1 : 1 體積混合均勻)。用手彈至棕色不見(Gel 呈淡黃色)，去離子水 Wash 2~3 次，使 Gel 呈現透明無色。

(2) Reduction / Akylation：加入 100 µL (50 mM DTT / 25 mM Ammonium bicarbonate, pH = 8.5)，37 ℃反應一小時。去掉 50 mM DTT / 25 mM Ammonium bicarbonate, pH = 8.5 溶液，加入 100 µL (100 mM IAA / 25 mM Ammonium bicarbonate, pH = 8.5)避光反應一小時。去掉 100 mM IAA / 25 mM Ammonium bicarbonate, pH = 8.5 溶液。加入 100 µL (50 % Acetonitrile / 25 mM Ammonium bicarbonate, pH = 8.5) Wash gel 二次(將 DTT 與 IAA 去除)。加 100% Acetonitrile 使 Gel 脫水(Gel 會變成米白色的)。去掉上清液， 低溫真空離心抽氣乾燥(1900 rpm, 10 ℃, 10 min)。

(3) Digestion：加入 1.5 ~ 2µL Trypsin。用 Microtube pestles 對 Gel 直接旋轉

使Gel 碎裂。離心(10000 rpm, 4 ℃, 2 ~ 3 min)。若溶液無超過 Gel，則再

加25 mM Ammonium bicarbonate, pH = 8.5 溶液淹過 Gel 即可。37 ℃反應 至少十六小時以上。

(4) Extraction：加入(50 % Acetonitrile + 5 % Formic acid)萃取蛋白質片段， 超音波震盪(Sonication) (4 ℃，10 min)，收集上清液並重複一次。將二次所 收集之上清液以低溫真空離心抽氣乾燥之。

柒、質譜儀鑑定：

做完 In-gel digestion 之樣品於本校 LC/MSMS 分析。

(五) 細胞週期分析(

Cell cycle assay):

將數盤 10 cm 細胞培養皿各種 3 x 105顆細胞，每盤處理藥物於一定時間 後，將培養皿的細胞培養液移至離心管，以 1XPBS清洗培養皿二次，再以 1XTrypsine-EDTA處理後，待細胞剝落，立即加入細胞培養液，收取所有細胞至 離心管，以 2000 rpm離心 5 分鐘後，移除上層液，再以 1XPBS清洗二次，以 2000 rpm離心 5 分鐘後，去除上清液，加入 250 µL之 1XPBS，將細胞打散後， 加750 µL 99.9%的冰乙醇，置於-20 ℃將細胞固定 30 分鐘。之後以 2000 rpm， 4 ℃下離心 5 分鐘，去除上清液，並以 1XPBS清洗一次，加入 20µL RNase A (100 µg/mL)，在 37 ℃下作用 30 分鐘，後加入 1 mL 50µg/ml Propidium Iodide，最 後用流式細胞測定儀(Flow cytometer)分析，並利用WinMDI 2.8 軟體分析

Sub-G1 與Cell cycle的Peak與含量(Contents)。

結果

cDNA microarray 結果：

以 cDNA 基因列陣找出具不同化學敏感度腫瘤之特殊基因表現模式

(TableI-III)，接著嘗試挑選幾組基因進一步以 real-time PCR, Western blotting

和免疫組織染色法確認 cDNA microarray 結果，在 NTUB1/Arsenic trioxide

NTUB1/Cisplatin 和 NTUB1/Gemcitabine 分別選出 HO-1,SUI1 和 TRAP-1，分

別進行分析，結果發現HO-1 與 NTUB1/Arsenic trioxide 對抗性是有關係，不管

real-time PCR 與 Western blotting 結果是和 cDNA microarray 結果一致 (Fig.1-2)，不過以免疫組織染色分析 arsenic-related 與 arsenic-unreleated UC HO-1 表現量現並無明顯差異(Fig. 3)。SUI1 和 TRAP-1 real-time PCR 結果與 cDNA microarray 結果有點出入(Fig. 4,5)。因此我們決定直接探討蛋白質層次， 以蛋白質學(Proteomics)技術，探討在不同抗藥性之膀胱癌細胞株中，有那些分 子受到影響而有表現量的變化，藉以尋找膀胱癌之抗藥機轉。 利用蛋白質體學(Proteomics) 分析方法篩選人類泌尿上皮細胞癌中具抗藥性 之蛋白質： 本篇論文主要探討利用蛋白質體學(Proteomics)與西方點墨法(Western blotting)分析方法篩選人類泌尿上皮細胞癌中具抗藥性之蛋白質。我們得到初步 研究的結果如下: 利用蛋白質體學分析 NTUB1、NTUB1/Cisplatin (14 µM)及 NTUB1/Arsenic trioxide (0.5 µM)： 由蛋白質體學分析中我們比對 NTUB1、NTUB1/Cisplatin (14 µM)與 NTUB1/Arsenic trioxide (0.5 µM)，發現共有 24 個我們所感興趣之 Spot，並經

過LC/MSMS 及 MASCOT MS/MS Ions Search 分析比對之後，將其蛋白質身分

鑑定出來，並依據蛋白質up-regulation、down-regulation 身分、分子量、pI 值

與生化功能製作成表格(Table IV.)。由表格中選出我們所感興趣之 Spot 12： GTP-binding nuclear protein，做進一步確認，因為我們所使用之 Proteomics

技術有它之偵測極限，所以必須利用Western blotting 或 real-time PCR 的方法

來確認。

(b) 鑑定 Spot 12：GTP-binding nuclear protein：

由本篇論文之緒論中可知，GTP-binding nuclear protein 是隸屬於 Rho 蛋白

家族成員之ㄧ，而Rho 蛋白家族成員主要有三個蛋白：Rac 1、Rho A 和 Cdc42，

所以我們先確認這三個蛋白質或基因之表現量。利用Western blotting 之方法我

們發現Rho A 蛋白的表現量，在人類泌尿上皮細胞癌細胞株與抗藥株並無明顯

差異，但Rac 1 蛋白之表現量就有明顯差異，其中 BFTCC909、N/T 及 N/P 有

被up-regulation 之現象，其它細胞株則是 down-regulation 之現象(Fig. 6,7)。另

外，我們先跑RT-PCR 確認我們所合成的引子(Primer)，有無 heterodimer 的現

象，因為若有heterodimer，則會影響 real-time PCR 的定量結果(Fig. 8A)。再

運用 Real-time PCR 的技術分析 cdc42 之基因表現量，發現 N/P 有較明顯的

down-regulation，而其它細胞株則是落在誤差範圍內，並無明顯差異(Fig. 8B)。 (c) 以 Lovastatin 抑制 Rac1 之表現：

過去文獻曾指出，Lovastatin 能抑制細胞膜上之膜蛋白，又 Fig 4.發現 Rac1

在N/P 有大量表現，所以我們以 Lovastatin = 10 µM 加入 N/P，經過六小時、十

二小時、二十四小時及四十八小時之後，萃取蛋白質進行Western blotting 分析，

結果在十二小時Rac1 有被抑制下來，但在二十四小時及四十八小時之後，Rac1

似乎有回復的現象(Fig. 9)。

(d) Flow Cytometry 分析 NTUB1/P 經 Lovastatin 處理後之 Sub-G1 及 Cell cycle arrest 的現象：

我們將 NTUB1/P 處理 Lovastatin = 10 µM，經過 6、8、12、24 小時之後，

分別再加入14 µM 的 Cisplatin，經過 48 小時之後，利用 Flow cytometry 分析

細胞的Sub-G1 及 Cell cycle arrest 的現象。發現在 8 小時細胞有 18.8 %產生

Sub-G1 (Fig. 10)，另外在 Cell cycle arrest 的部份，在 6、8、12 小時細胞有停

留在S 期的現象(Fig. 11)。

(三) 以 Western blotting 之方法篩選人類泌尿上皮細胞癌細胞株與抗藥株之

蛋白質表現差異：

(a) Kinase and Phosphatase 在人類泌尿上皮細胞癌之表現量：

以相同條件下培養人類泌尿上皮細胞癌，24 小時後，以 Western blotting 分析其蛋白表現量，結果發現人類泌尿上皮細胞癌中：Serine/threonine kinase (Akt1/2)、Protein kinase C-ζ (PKC-ζ)與 Extracellular signaling-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2)的蛋白質表現量並無明顯差異；而 Jun N-terminal kinase (JNK) 與Phospho-extracellular signaling-regulated kinase 1 and 2 (p-ERK1/2)有些許 差異，(Fig. 12,13)。

(b) Tumor Suppressors / Apoptosis 在人類泌尿上皮細胞癌之表現量：

以相同條件下培養人類泌尿上皮細胞癌，24 小時後，Western blotting 分析 其蛋白表現量，結果發現人類泌尿上皮細胞癌中：Bcl-xL、Bcl-2 與 Bad 的蛋白 質表現量並無明顯差異；而p53 在 N/T 與 N/P 有被抑制下來；在 BFTCC909 並 無p21 蛋白質的表現量；另外，N/P 的 Caspase-3 則有被抑制下來的現象(Fig. 14,15)。 (c) Transcrition Regulators 在人類泌尿上皮細胞癌之表現量： 以相同條件下培養人類泌尿上皮細胞癌，24 小時後，以Western blotting分 析其蛋白表現量，結果發現人類泌尿上皮細胞癌中：Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)、IκB、NF-κB p65與Nuclear respiratory factors (Nrf-2)的蛋白質表現量並無顯著差異；而CCAAT-enhancer binding protein (C/EBPβ)在N/P與N/As有顯著差異(Fig. 16,17)。

(d) Signaling Intermediates 在人類泌尿上皮細胞癌之表現量：

以相同條件下培養人類泌尿上皮細胞癌，24 小時後，以 Western blotting 分析其蛋白表現量，結果發現人類泌尿上皮細胞癌中：Cyclooxygenase 2 (COX-2)在 N/T 及 N/P 有較高之表現；Suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS-3)在 BFTCC909 及 N/T 有較高之表現；在 N/G 和 N/T 的 Heat shock protein 70 (Hsp70)有被抑制下來；Heme oxygenase 1 (HO-1)在 N/As 有較高之

表現；superoxide dismutase (SOD)在 N/P 和 N/As 有較高之表現；另外

transforming growth factor receptor associated binding protein (TRAP-1)並無 顯著差異(Fig. 18)。

(e) Growth Factor and Hormones 在人類泌尿上皮細胞癌之表現量：

以相同條件下培養人類泌尿上皮細胞癌，24 小時後，以 Western blotting 分析Breast and kidney-expressed chemokine (BRAK)與 Interleukin-6 (IL-6) 的 表現量，結果發現人類泌尿上皮細胞癌中：BRAK 的表現量並無顯著差異；在 N/As 抗藥株中 IL-6 的蛋白質表現量有 up-regulation 的現象(Fig. 19)。

(f) Cell cycle proteins 在人類泌尿上皮細胞癌之表現量：

以相同條件下培養人類泌尿上皮細胞癌，24 小時後，以 Western blotting 分析其蛋白表現量，結果發現人類泌尿上皮細胞癌中：cyclin D1 在 N/G、N/P 和N/As 有 up-regulation 的現象；另外，cyclin E 在 N/P 與 N/As 亦有 up-regulation 的現象(Fig. 20)。

(g) Membrane Receptors 在人類泌尿上皮細胞癌之表現量：

以相同條件下培養人類泌尿上皮細胞癌，24 小時後，以 Western blotting

分析epidermal growth factor receptor (EGFR)的表現量，結果發現人類泌尿上

皮細胞癌中：EGFR 的蛋白質表現量在 N/As 抗藥株中有 up-regulation 的現象 (Fig. 21)。

(四) Paclitaxe(太平洋紫杉醇)在細胞毒性機制之研究

(I) Paclitaxe 誘發 T24 細胞 reactive oxygen species 形成

Paclitaxel使T24 細胞產生ROS. 將 T24 細胞以paclitaxel 處理後顯著地 使Amplex 紅色螢光強度增加. 這個作用會因抗氧劑antioxidents、superoxide dismutase (SOD), catalase、丙酮酸鹽pyruvate, 和硒(Fig. 22A)而減少. 這些結

果指出, paclitaxel 處理後會增加細胞內H2O2 水平. Paclitaxel 處理後也會增加

一測量O2 -探針L-012(Fig. 22B)的chemiluminescent 強度. O2- 的生產會因 SOD的存在而減少. 以標準的彗星分析法(standard comet assay)分析發現使用 paclitaxel處理T24 細胞並不會導致任何DNA鏈斷裂. 但是, 很多DNA鏈斷裂是 因paclitaxel 處 理 過 的 T24 細 胞 與 endonuclease III 或 formamidopyrimidine DNA glycosylase一起培養而產生, 這是因為endonuclease III 移除被氧化的嘧 啶且formamidopyrimidine-DNA glycosylase 移除被氧化的嘌呤的緣故. 這些 結果暗示著paclitaxel 導致氧化DNA 損傷(Fig. 22C)

(II) Paclitaxe 誘發細胞凋亡

同樣地, 在抗氧劑pyruvate或者硒存在下特殊DNA鏈斷裂造成氧化鹼基的 程度顯著地減少 (Fig. 23A) . Paclitaxel 導致G2-M 停滯、核破碎, 及細胞生長

被抑制. Paclitaxel 處理細胞明顯地導致細胞停聚在G2-M階段(Fig. 23B), 產生

核碎裂的比例增加(Fig. 23C), 和抑制細胞生長(Fig. 23D). 所有這些由paclitaxel 產生的細胞毒素作用可由pyruvate或者硒部份地壓制著.

(III) Paclitaxel 誘發 T24 細胞 nitric oxide 形成

在 T24 細胞方面, Paclitaxel 導致硝酸氧化物產生. 以 Paclitaxel 處理 T24

細胞並藉由培養基亞硝酸鹽水平的增加證明一氧化氮(NO)增加(Fig. 24A). NO 的產生會被(NO synthase inhibitor)一氧化氮合成酶抑制劑 NN-nitro-L-arginine

methyl ester (NAME), NO scavenger manganese (III) 及

2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5- tetramethylimidazoline-1-oxyl- 3-oxide (c-PTIO) 所抑制.依照彗星分析法((Fig. 23B), 這些 NO 調控者也顯示部份地搶救了 paclitaxel 引發的 DNA 氧化損傷. (IV) 抗氧化劑與 NO 調控劑可以抑制 Paclitaxel 細胞毒性 抗氧化劑與NO調節物可在不同細胞株中抑制paclitaxel的毒性。到目前為止 研究結果指出H2O2, O2-以及NO可能都和T24 細胞中經由paclitaxel所誘導的細 胞毒性有關。為了研究此一現象是否具有細胞專一特性，我們在此針對抗氧化劑 (pyruvate加上selenium)以及NO調節物(NAME or c-PTIO)的影響作進一步的研 究，在這個實驗之中，我們利用DNA flow cytometry來檢測除了T24 cell以外的 一些細胞株之中由paclitaxel所誘導的sub-G1 fraction累積情形。我們檢測了兩株 人 類 的 urothelial carcinoma cell lines (BFTC905 and NTUB1), 以 及 SV40-transformed 的 人 類 urothelial cell line (SV-HUC-1), 還 有 人 類 lung epidermoid carcinoma cell line (H1355)和breast cancer cell line (MCF-7; Fig. 25)。研究結果指出pyruvate plus selenium、NAME,以及c-PTIO可以減少上述那 些細胞株中paclitaxel-induced sub-G1 fraction的累積(Fig.25A and B)。此外，利 用 buthionine sulfoximine(BSO) 阻 止 glutathione 的 合 成 作 用 或 是 以 2-methoxyestradiol (2-ME)抑制SOD的活性，都增強了paclitaxel的細胞毒性，此 一現象可由sub-G1 fractions累積的增加情形得到證實(Fig. 25C and D)。這些實

驗結果指出在大部分的細胞株中，ROS以及NO兩者都與paclitaxel所誘導的細胞 毒性有關。 (V) 總體抗氧化能力與 paclitaxel 的抗性有關聯。 因為H2O2, O2-以及NO被發現與被paclitaxel所誘導的細胞毒性有關，我們因 而假設那些具有較高抗氧化能力的腫瘤細胞會比其他那些抗氧化能力較低的腫 瘤細胞更能夠抵抗paclitaxel。為了證實這個假設，我們分別量測 16 株不同細胞 株的整體抗氧化能力(Fig. 26A)以及對paclitaxel的IC50(Fig. 26B)。經由MTT實驗 分析所得到的結果，可以得知整體抗氧化能力與paclitaxel的IC50 呈現正相關 (Pearson’s correlation coefficient r = 0.90, P < 0.0001; Fig. 26D)。我們更進一

步的進行colony formation assay來確認這些結果(Fig. 26D)。我們挑選了MCF-7 (對paclitaxel高度敏感的細胞株), T24 (對paclitaxel敏感的細胞株), T24/A (具 doxorubicin抗性的T24 subline), and NTUB1/P and NTUB1/T (具有cisplatin and paclitaxel抗性的NTUB1 sublines)。由colony formation assay所得到的實驗 數據確認了我們先前實驗的結果，證實總體抗氧化能力的確與paclitaxel的 IC50 有關(Pearson’s correlation coefficient r = 0.93, P = 0.024; Fig. 26D)。

(VI) 不同細胞株對 paclitaxel 的抗性與細胞總抗氧化能力的正相關性

以上結果暗示腫瘤細胞的paclitaxel IC50越高，其抗氧化能力越高。我們以實驗

來檢視是否可以降低paclitaxel 抗性的試劑也可以降低細胞總抗氧化能力。結果 顯示在MCF-7(最敏感的細胞株)、NTUB1/T(最具抗性細胞株)、PD98059(一種有 絲 分 裂 活 化 蛋 白 及MEK/ERK 抑 制 劑 ) 、 U0126( 一 種 MEK/ERK 抑 制 劑 ) 、

LY294002(一種PI3K/Akt抑制劑)、BSO、2-ME以及As2O3(一種ROS生成劑)這

些實驗組別中其細胞存活率都有顯著降低(Fig. 27A,B)，而其細胞總抗氧化能力 也有降低(Fig. 27C,D)。類似的結果也在其他細胞株被觀察到，包含T24、T24/A， 還有NTUB1/P細胞株(資料沒有列出)

討論

膀胱癌在臨床上多採用外科手術切除，之後再併用化學藥物或放射性治 療；但是許多研究發現，其中大約有三分之一的病人會對化學藥物治療產生抗藥 性 (drug resistance)，造成治療與預後上相當程度的瓶頸。於是，我們決定針對 膀胱癌細胞株，對其抗藥性做分析。 首先，我們先利用Proteomics 的技術對人類泌尿上皮細胞癌細胞株與抗藥

株做分析，將NTUB1 當控制組；NTUB1/P 及 NTUB1/As 當實驗組，將所得之

實驗組的圖譜與控制組作比對，找出差異性的 Spots。目前我們得到具差異的

24 個 Spots，整理出 Table 4.的結果。從中我們先對 Spot 12：GTP-binding nuclear protein 這個點做進一步確認，我們利用 Western blotting 與 real-time PCR 做鑑定，發現 Rac1 在人類泌尿上皮細胞癌細胞株與抗藥株有極大之差異 性(Fig. 6)；而 Rho A 和 Cdc42 則無差異性(Fig. 7,8)。在 Fig. 6 中我們發現 NTUB1/P 與 NTUB1 比較之後，NTUB1/P 的 Rac1 有很高的表現，故我們先把

焦點放在cisplatin 所產生之抗藥性作用機制做一探討。

從前人文獻指出，Rac 1、Rho A 和 Cdc42 它們是膜蛋白，且已有證據證實 它們會分別啟動各種不同的訊息傳遞路徑(16)，所以我們持續探討下游訊息傳遞 路徑。先前研究已發現Platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)會促進 Phosphatidylinositol 3’-Kinase (PI3K)的活化，而 PI3K 會調控 Rac 1 之活化，

進一步開啟各種不同之訊息傳遞路徑。在1999 年有人發現，Rac 1 會啟動 cyclin

D1 的表現(17)，而 cyclin D1 又是調控 cell cycle 的調控子(regulator)，促進細胞

不斷分裂，在 Fig. 20 也是相同情況，所以我們進一步推測 cyclin D1 會調控

Retinoblastoma (Rb) 蛋白(47, 48)，而 Rb 是一種腫瘤抑制蛋白，它的功能應是

抑制腫瘤細胞。又從Fig. 17 中我們發現 NTUB1/P 的 p53 是 down regulation 的

現象，根據文獻指出，p53 會與 Mdm2 形成 complex，使 p53 經由 Ubiquitin pathway，將 p53 失去活性(49, 50)，而 Mdm2 是一個致癌蛋白，它會抑制 Rb

的活性，使得 Rb 無法發揮它抑制腫瘤的功能(51, 52)，所以說這可能是具

Cisplatin 抗藥性之癌細胞的一種生存能力。另外，Lovastatin 可經由抑制 Isoprenylation 而降低細胞膜上 Rho 蛋白之活性及含量，所以我們加入 10 µM 的Lovastatin，經過 Time-course 之後，發現 Lovastatin 有抑制 Rac1 的能力(Fig. 9)，但是 Lovastatin 似乎沒有專一性的抑制效果，從結果中在十二小時 Rac1 有 被抑制下來，不過四十八小時之後，Rac1 好似有被回復過來。另外在 Flow cytometry 分析方面，我們證明 Lovastatin 有使細胞停留在 S 期的能力，促使細 胞產生 Sub-G1 的現象，這也與我們 Western 的結果相符合，不過在十二小時 之後都有被回復的情況。所以我們推斷Lovastatin 可能有它一定的時效及濃度； 又有一可能是Lovastatin 雖然能抑制膜蛋白，但癌細胞可能有多重機制來合成所 需之膜蛋白，當主要之合成路徑被抑制住，它可能會衍生出其他合成路徑，故我 16

們可能要再尋找新的具專一性小分子化學抑制劑，完全針對Rac1 做專一性的抑 制，看能否增加cisplatin 的毒殺效果。 在C/EBPβ這個Transcription factor上，我們發現NTUB1/P有較高之表現(Fig. 17)，C/EBPβ會調控p21的表現(18)，而我們知道p53的下游是p21，在Fig. 14中 NTUB1/P有p21的表現，但是NTUB1/P並無p53的表現，所以我們推斷C/EBPβ 會調控p21的表現。另一方面，從前人研究指出，在細胞進行分化(Differentiation) 時，會大量產生C/EBPβ，有證據顯示C/EBPβ會受到MAPK pathway所調控 (53)，又在血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cells)研究指出(54)，當細 胞受到一些inflammatory cytokines刺激時而啟動PI3K pathway，會活化C/EBPβ 進而增加c-fos的Promoter之活性(55)，而c-fos它含有 serum-response element (SRE)會開啟很多成長因子(growth factors)的活化。在Fig. 14中，我們發現一些 腫瘤抑制之相關蛋白質：Bad、Bcl-2與Bcl-xL並無明顯差異，但是caspase-3這 個細胞凋亡蛋白質，在NTUB1/P有被抑制下來(Fig. 15)，而caspase-3它在整個 細胞凋亡(apoptosis)的訊息傳遞路徑中，為一個重要的關鍵點，故我們推論 cisplatin抗藥性之癌細胞不會使癌細胞走向細胞凋亡(apoptosis)，caspase-3被 抑制可能是扮演一個重要之角色。

根據前人研究指出，Rac 會刺激 JNK/p38 MAP kinase 路徑(19-21)，在 Fig.

12,13 中，我們發現 JNK 與 p-ERK 在 NTUB1/P 有較高之表現，在這個 JNK/p38 MAP kinase 路徑中，mitogen-activated protein kinase (MAPK)會被 MEK 的雙 重特異性 (dual specificity ; tyrosine threonine)的磷酸化作用而活化。MAPK 有 兩種異構型 (isoform) : extra cellular regulated kinase (ERKs) 1 和 2。它們能

位移至核內並且能被磷酸化及調控DNA 合成和細胞分裂的重要轉錄因子。使得

細 胞 走 向 生 存(survival) 、 分 化 (differentiation) 、 增 生 (proliferation) 及 轉 移 (metastasis)，所以說我們推斷，cisplatin 抗藥性之癌細胞會經由 JNK/p38 MAP kinase 路徑，使細胞不會產生毒殺效果。

綜合以上結論，在cisplatin 抗藥性之癌細胞它會經由多重之訊息傳遞路徑，

以達到不被毒殺之效果，但是它是如何產生抗藥性的呢？有可能是，透過 PI3K

活 化 multidrug resistance 1(mdr1) 基 因 或 multidrug resistance protein-1 (MRP-1)，以啟動細胞排毒之能力(22, 23)。

許多研究早已發現，在巨噬細胞中，「內毒素」所誘導「前發炎物質」，如： 腫瘤壞死因子─alfa (tumor necrosis factor alfa )、介白素-1 (interleukin-1)、介 白 素-6 (interleukin-6) 、 一 氧 化 氮 (NO) 等 的 表 現 ， 可 以 透 過 介 白 素 -10 (interleukin-10)將其抑制，因此，在「介白素」大家族中，「介白素-10」被科學 家 認 為 具 有 很 強 的 抗 發 炎 效 果 ， 「 介 白 素-10 」 可 以 透 過 磷 酸 化 細 胞 內 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)中的 p38 這路徑，而非 JNK 或 ERK， 活化「血紅素氧化酵素-1」 (heme oxygenase-1, HO-1) mRNA 與蛋白質表現， 來抑制「內毒素」所誘導「前發炎物質」如：腫瘤壞死因子、一氧化氮、MMP-9

等，但是分別使用 antisense 方式與血紅素氧化酵素抑制劑─ZnPP，阻斷「血

紅素氧化酵素-1」表現後，「介白素-10」抑制「內毒素」的現象也隨即消失， 這暗示著介白素-10」抑制「內毒素」誘導發炎反應的訊息傳遞路徑中，「血紅 素氧化酵素-1」扮演著舉足輕重的角色。 在尋找「血紅素氧化酵素-1」的調控 機制時，其進一步發現，「血紅素氧化酵素-1」代謝血紅素之後，所產生一氧化 碳(CO)，才是「介白素-10」作用的關鍵；從動物實驗中，也看到「介白素-10」 可以大幅提高了已注射內毒素老鼠的存活率；相同於細胞階段的發現，「血紅素 氧化酵素-1」、一氧化碳(CO) 確實是「介白質-10」避免內毒素在老鼠體內引起 劇烈發炎反應的重要原因(44)。在 Growth Factor and Hormones 在人類泌尿上 皮細胞癌之表現量中發現，interleukin-6 (IL-6) 的表現量在抗藥株都有被抑制下

來的現象，所以我們推測可能是被IL-10 抑制下來，不過這二者的先後順序可能

還需要實驗證明。

在Fig. 18 中，Signaling Intermediates在人類泌尿上皮細胞癌之表現量中， Superoxide dismutase (SOD)於N/P和N/As有被up-regulation的現象，而heme oxygenase-1 (HO-1) 於N/As有被up-regulation的現象，故我們從自由基之觀點 切入。何謂自由基：是指帶有不成對電子的分子、原子、或離子，因存在未成對 電子，因此特性。自由基 ─ 非常不穩定、具高度活性、它會去搶奪其他物質的 電子，而併發一連串連鎖反應，對身體有一定毒性；可能影響一些生物分子如蛋 白質、脂質、醣類、DNA等正常結構，及代謝反應造成不可回復的傷害，氧自 由基(O2)、氫氧自由基(OH)，其含有不穩定的氧分子，具有強烈的氧化作用，會 給組織細胞帶來氧化壓力，破壞細胞膜、血管壁、蛋白質及基因，使人體產生老 化及疾病，尤其是慢性病，包括癌症等。自由基是如何形成的：自由基隨時隨地 會產生，人體中自由基產生的原因可能來自身體能量產生的過程所釋放出來；人 體遭受感染、受傷等發炎狀態時，會啟動身體殺菌機制來清除外來物，例噬中性 球及巨噬細胞會立即進行respiratory burst，以增加氧氣攝入，活化HMS並產生 H2O2及O2；正常健康情況下，產生之殺菌自由基可為身體抗氧化營養素（如維 生素A、C、E、Se和Zn等）或酵素機轉(superoxide dismutase、glutathione peroxidase、catalase與thioredoxin reductase）所清除；但若在感染結束後， 宿主沒有足夠的保護機制，清除此過多的自由基，將造成細胞傷害（如細胞膜脂 質過氧化、DNA傷害等）。自由基造成傷害原因：造成胞膜脂質過氧化作用、 蛋白質間雙硫鍵形成、 DNA傷害。自由基與DNA反應可能造成癌症，自由基可 攻擊細胞核，導致細胞死亡或受損，突變等；自由基造成胞膜脂質過氧化作用、 並使低密度脂蛋白氧化，為造成心血管疾病、冠狀動脈硬化的主因(45)。從Fig. 18 中，一些與自由基有關的marker：COX-2、HO-1 和SOD，在抗藥株中都有表現 的差異，有可能是因為當細胞在癌化的過程中，細胞會產生reactive oxygen species (ROS)，而這個內生性的ROS會與抗癌藥物或放射線使得DNA產生突 變，經由粒腺體(mitochondrial)的呼吸傳遞鏈(respiratory chain)增加ROS的產 生，最後使DNA不穩定、產生突變與抗藥性的發生(56)。 18

我們將Western blotting 之方法所篩選人類泌尿上皮細胞癌細胞株與抗藥株

之蛋白質表現差異整理，發現在四株抗藥株：N/G、N/T、N/P 和 N/As 的 RhoA、

JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、 C/EBPβ 與 Cyclin D1 都有被 up-regulation 之現 象，其中RhoA 和 Cyclin D1 是調控 cell cycle 之調控子；JNK、ERK1/2、p-ERK1/2

和C/EBPβ 會開啟一些 survival 的基因，使細胞走向 survival 的狀況。在四株抗

藥株：N/G、N/T、N/P 和 N/As 的 Bcl-xL、Nrf-2 和 Hsp70 都有被 down-regulation

之現象，其中 Bcl-xL 為一腫瘤抑制蛋白，它在四株抗藥株中都被抑制下來，所

以可能無法達到抑制腫瘤的能力。熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp 70)是生 物用來對抗外在高溫環境的蛋白質，細胞中如果缺少這種蛋白質，就會比較容易 發生癌症反應。文獻指出(46)，研究細胞染色體分裂所需的端粒酶(telomerase) 時發現，一般細胞只有在染色體要分離時，才會產生端粒酶，幫助染色體分離。 然而，癌症細胞的端粒酶卻一直存在，此外，Hsp70 蛋白質也同時存在。 Paclitaxe(太平洋紫杉醇)在細胞毒性機制研究，在這項研究中, 收集證據來 證實paclitaxel 能藉由提高細胞內O2-, H2O2及 NO 水平來產生毒性的概念. 這

種理論由下列的結果說明 : (a) paclitaxel 導致O2- , H2O2及 NO的產生; (b)

paclitaxel 導致的DNA氧 化 損 傷; (c) 減少製造H2O2及 NO 的試劑會抑制

paclitaxel 引起的DNA 損傷、G2-M 停滯、細胞凋亡, 和抑制細胞生長; (d) 抑 制SOD or glutamylcysteine synthase 會增加paclitaxel 引起細胞凋亡; (e) 高總 抗氧化容量的細胞株對於paclitaxel 細胞毒性更有抗性; 以及(f) 減少群落生存 的試劑對於paclitaxel處理的細胞也會減少細胞總抗氧化容量. 因而, paclitaxel chemoresistance 化療藥物抗藥性與細胞內抗氧化容量有很好的關聯。許多化學 療法試劑對癌細胞藉由產生自由基來引發毒性反應, 導致細胞不可逆的傷害, 並 且在癌細胞中過度產生ROS可能會耗盡SOD容量及其他適當抗氧化防禦容量. 這個概念與我們的結果是一致的表示, 耗盡細胞的抗氧化容量會增加paclitaxel 毒性。最近, 據報導, paclitaxel 處理可活化MEK/ERK 和phosphatidylinositol 3-kinase/Akt 訊息傳遞(57) ，據報導, paclitaxel 可能導致單股DNA 鏈斷裂

(58-60). 我們的資料顯示, paclitaxel 能夠藉由增加H2O2及 NO 水平引起DNA 氧化傷害. 在DNA 損傷方面, 細胞能夠停止細胞週期的進行來修復損傷. 他們 也能夠初步控制細胞死亡或允許細胞週期繼續進行而不修復損傷甚至有過多突 變或分子改變. 對於paclitaxel 處理的細胞而言, DNA 損傷和G2-M 停滯之間或 DNA損傷及續發突變的仍是未知的. 這裡, 我們的結果顯示, 在T24 細胞以 0.02 mol/L低濃度paclitaxel處理後會導致的氧化DNA 併攏. 這個paclitaxel 的 水平比產生核碎裂, sub-G1 聚積及G2M停滯所需濃度還低. 的確, 這發現能夠解

釋為什麼基因突變從minor DNA insults能夠促進抗藥性細胞生長而不是死亡。這 些結果我們已經寫成論文並發表在Cancer Res期刊中(61)。

這些現象只能說明具抗藥性細胞株生存之能力，不能證明與抗藥性之關係，

就從參考文獻中推斷，有可能藉由 PI3K 的訊息傳遞路徑，活化 MRP-1 以產生 抗藥性，後面的實驗證明待留後人進一步研究。

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圖表

Heme Oxygenase-1

Cell lines

Fig.1 Real-time PCR 分析人類泌尿上皮細胞癌 HO-1 基因表現量

α-tubulin HO-1 NTUB 1 NTUB 1/As (0.2 ) NTUB 1/G (0.1 ) NTUB 1/P( 14) NTUB 1/T( 0.00 5) T24 _T24/ A(0. 4) BFTC C905 BFTC C909

Fig. 2 Western blotting 分析人類泌尿上皮細胞癌 HO-1 蛋白質表現量

HO-1 IHC

100 X

Negati ve c o n tr o l Positiv e co ntr o l Mu sc le inv a siv e bl ad der c a ncer Gr III Mu sc le inv a siv e bl ad der c a ncer Gr III Arsenic-unrelated Arsenic-related Fig. 3 免疫組織染色分析人類泌尿上皮細胞癌組織內 HO-1 表現量 28

SUI1 Cell Line NTUB 1P(14 ) BFTC 909 NTUB 1T(0. 005) NTUB 1 BFTC C905 TSGH 8301 _HTB5 R e la ti ve F o ld 0 2 4 10 12 14 Cisplatin IC50 1 = BFTCC905 2 = TSGH8301 3 = HTB5 6 = NTUB1 9 = BFTCC909 10 = NTUB1/T 11 = NTUB1/P High conc. Low conc.

Cisplatin

Putative translation initiation factor (SUI1)

Fig. 4 Real-time PCR 分析具 cisplatin 抗性/敏感人類泌尿上皮癌細胞株之 SUI1 基因表現量

TGFBRAP1 Cell Line BFTC C909 NTUB 1T(0.005 ) NTUB 1 NTUB 1G(0. 1) HTB5 T24 Rel ati ve F o ld 0 1 2 3 4 5

Gemcitabine

Gemcitabine

TGF beta receptor associated protein 1 (TRAP1)

Gemcitabine IC50 1 = NTUB1 2 = T24 3 = NTUB1/T 9 = BFTCC909 10 = HTB5 11 = NTUB1/G High conc. Low conc.

Fig. 5 Real-time PCR 分析具 cisplatin 抗性/敏感人類泌尿上皮癌 TRAP1 基因

表現量

Rac 1

T24 BFT C C909 NTUB 1 NTUB 1/G NTUB 1/T NTUB 1/P T24/ D

α

- tubulin

NTUB 1/As

Fig. 6.為使用 Western blotting 分析 Rac1 在人類泌尿上皮細胞癌細胞株與抗

藥株之含量。

RhoA

T24 BFT C C909 NTUB 1 NTUB 1/G NTUB 1/T NTUB 1/P NTUB 1/As

α

-tubulin

Fig. 7 為使用 Western blotting 分析 RhoA 在人類泌尿上皮細胞癌細胞株與抗

藥株之含量。

A

T2

4

BF

T CC

90

9

NT

UB

1

NT

UB

1/

G

NT

UB

1/

T

NT

UB

1/

P

NT

UB

1/

As

GADPH

cdc42

B

C dc42

0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 1 . 2 1 . 4

R

ela

tive

F

o

ld

Cell-line

BF TC C9 09 T24 / D T24 NT UB 1/A s NT UB 1/P NT UB 1/T NT UB 1/G NT UB 1 Fig. 8 A 為使用 RT-PCR 分析 cdc42 在人類泌尿上皮細胞癌細胞株與抗藥株之 含量；B 為利用 Real-time PCR 定量之結果。 33

Rac 1

C

o n

tr

ol

D

M

S

O

₆

hr

12

h

r

24

h

r

48

h

r

α

- tubulin

Fig. 9 NTUB1/Cisplatin (14 µM)-resistant 細胞株先處理 Lovastatin = 10 µM，經由 Time-course 之後，以 Western blotting 分析 Rac 1 蛋白質之表現

量。

6 hr

Control

DMSO

8.44 % 4.75 % 11.28 %

8 hr

12 hr

24 hr

18.8 % 3.57 % 3.0 %

Fig. 10 NTUB1/P細胞處理Lovastatin = 10 µM後，產生Sub-G1 fractions的現

象。時間經由6、8、12、24 小時後，發現Lovastatin對NTUB1/P細胞產生sub-G1

fractions的程度在 8 小時有增加的現象，但是在 12 小時之後有回復的現象。

Fig. 11 NTUB1/P 細胞處理 Lovastatin = 10 µM 後，產生 Cell cycle arrest 的

現象。時間經由6、8、12、24 小時後，發現 Lovastatin 對 NTUB1/P 細胞產生

Cell cycle arrest 的程度在 6、8、12 小時，細胞在 S 期有停滯的現象。

G0/G1 phase S phase G2/M phase

Control % 42.49 11.87 20.90 DMSO % 46.66 14.22 20.78 6 hr % 19.91 26.05 20.03 8 hr % 22.71 21.99 19.09 12 hr % 20.63 29.16 20.08 24 hr % 43.94 16.43 22.77 Control DMSO 6 hr 8 hr 12 hr 24 hr 36

Ki nase and Phosphat ase PKC- ζ α- t ubuli n JNK Akt 1/ 2 T24 BF TC C909 NT UB 1 NT UB 1/G NT UB 1/T NT UB 1/P NT UB 1/A s

Fig. 12 以 Western blotting 分析 Kinase and Phosphatase 在人類泌尿上皮

細胞癌之表現量。

T24 BFT CC 909 NT U B1 NT U B1/ G NT U B1/ T NT U B1/ P NT U B1/ As T24/ D ERK1/ 2 p- ERK1/ 2 α- tubuli n

Fig. 13 以Western blotting 分析 Kinase and Phosphatase 在人類泌尿上皮

細胞癌之表現量。結果發現具抗藥性之人類泌尿上皮細胞癌中 ERK1/2 和

p-ERK1/2 則有些許差異。

Tu mor Suppr essor s / Apopt osi s Bcl - 2 p53 Bad α- t ubuli n p21 Bcl - xL T2 4 BF TC C9 09 NT UB 1 NT UB 1/G NT UB 1/T NT UB 1/P NT UB 1/A s

Fig. 14 以 Western blotting 分析 Tumor suppressor/Apoptosis 在人類泌尿

上皮細胞癌之表現量。結果發現人類泌尿上皮細胞癌 Bcl-xL、Bcl-2 與 Bad 並

無明顯差異，而p53 及 p21 的蛋白質表現量則有些許差異。

T2

4

BF

T C

C9

09

NT

UB

1

NT

UB

1/

G

NT

UB1

/ T

NT

UB1

/ P

T2

4/

D

α

- tubulin

Caspase-3

NT

UB1

/ A

s

Fig. 15 以 Western blotting 分析 Tumor suppressor/Apoptosis 在人類泌尿

上皮細胞癌之表現量。結果發現人類泌尿上皮細胞癌 Caspase-3 的蛋白質表現

量則有些許差異。

Transcri pti on Regul ators I κB Nrf-2 STAT3 T24 BFT CC9 09 NT U B1 NT U B1/ G NT U B1/ T NT U B1/ P NT U B1/ A s α-t ubuli n

Fig. 16 以 Western blotting 分析 transcrition regulators 在人類泌尿上皮細

胞癌之表現量。結果發現人類泌尿上皮細胞癌STAT3、IκB 與 Nrf-2 的蛋白質表

現量並無顯著差異。

T24 BFT CC90 9 NT U B1 NT U B1/ G NT U B1/ T NT U B1/ P T24/ D α- tubuli n C/ EBPβ NF- κB ( p65) NT U B1/ As

Fig. 17 以 Western blotting 分析 transcrition regulators 在人類泌尿上皮細

胞癌之表現量。結果發現人類泌尿上皮細胞癌 NF-κB 的蛋白質表現量並無顯著

差異，而C/EBPβ則有些許差異。

Si gnaling Inter medi ates

SOCS-3

Hsp70

α

-t ubulin

TRAP-1

HO- 1

COX- 2

SOD

T24 BFT C C909 NTUB 1 NTUB 1/G NTUB 1/T NTUB 1/P NTUB 1/As

Fig. 18 以 Western blotting 分析 Signaling Intermediates 在人類泌尿上皮細

胞癌之表現量。結果發現人類泌尿上皮細胞癌中 COX-2、SOCS-3、Hsp70、

HO-1 和 SOD 的蛋白質表現量有些許差異，而 TRAP-1 並無差異。

Gr owt h Fact ors and Hor mones BRAK α- t ubuli n IL-6 T24 BFT CC9 09 NTU B1 NT UB 1/G NTU B1/ T NTU B1/ P NTU B1/ As

Fig. 19 以 Western blotting 分析 Growth Factor and Hormones 在人類泌尿

上皮細胞癌之表現量。結果發現具抗藥性之人類泌尿上皮細胞癌中 IL-6 的蛋白

質表現量有些許差異，而並BRAK 無明顯差異。

Cycli n E Cycli n D1 T24 BFT CC9 09 NT U B1 NT U B1/ G NT U B1/ T NT U B1/ P T24/ D

Cell Cycl e Protei ns

α- tubuli n

NT U B1/ A

s

Fig. 20 以 Western blotting 分析 cell cycle proteins 在人類泌尿上皮細胞癌

之表現量。結果發現具抗藥性之人類泌尿上皮細胞癌cyclin D1 與 cyclin E 的

蛋白質表現量有些許差異。

Me mbrane Receptor EGFR α-t ubuli n T24 BFT CC90 9 NT U B1 NT U B1/ G NT U B1/ T NT U B1/ P NT U B1/ As

Fig. 21 以 Western blotting 分析 membrane receptor 在人類泌尿上皮細胞癌

之表現量。結果發現具抗藥性之人類泌尿上皮細胞癌 EGFR 的蛋白質表現量有

些許差異。

Fig. 22 使用 paclitaxel 處理 T24 細胞造成 ROS 水平的增加及 DNA 氧化傷害

Fig. 23 抗氧化劑, pyruvate 及硒會抑制 paclitaxel 導致特有 DNA 鏈斷裂產生氧

化鹼基

Fig. 24 (A) 以 paclitaxel 處 理 T24 細 胞 增 加 了 NO levels 。 (B) BNO modulators、NAME 以及 c-PTIO 減少 paclitaxe 誘導 DNA 受損。

Fig. 25 (A)和(B)，抗氧化劑與 NO 調控物減少 paclitaxel 所誘導的凋亡作用。(C)

和(D)，BSO 與 2-ME 增加細胞凋亡，以藥物處理細胞 48 小時。

Fig. 26 不同細胞株對 paclitaxel 的抗性與細胞總抗氧化能力的正相關性