控制水稻內外穎發育基因之研究(3/3)

控制水稻內外穎發育基因之研究(3/3)

研究成果報告(完整版)

計 畫 類 別 ： 個別型 計 畫 編 號 ： NSC 95-2313-B-002-009- 執 行 期 間 ： 95 年 08 月 01 日至 96 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立臺灣大學農藝學系暨研究所 計 畫 主 持 人 ： 劉麗飛 計畫參與人員： 此計畫無參與人員：無 處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 96 年 12 月 21 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

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成果報告

控制水稻內外穎發育基因之研究 (3/3)

計畫類別：

■

個別型計畫

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整合型計畫

計畫編號：NSC

95

－

2313－B－002－009－95C－7210

執行期間：

95

年

8 月 1 日 至 96 年 7 月 31 日

計畫主持人：

劉麗飛

共同主持人：

計畫參與人員：

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：

□

精簡報告

■

完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列

管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢

執行單位：

國立台灣大學農藝系

中 華 民 國 96 年 12 月 21 日

摘 要

水稻是世界上最重要的糧食作物之ㄧ，水稻穎花大小決定榖粒發育，進而影響水稻產量。 本試驗目的擬探討水稻穎花發育相關基因。以農試所王強生博士團隊利用疊氮化鈉誘變品系 後代中，篩選到小穎花突變體(SLP/slp,stunded lemma and plea)為材料，進行生長性狀調查及基 因表現差異篩選，期可分離出穎花發育相關基因。本計畫第一年進行基因表現差異篩選，取 SLP 與 slp 突變體 1~4 公分幼花序，利用 cDNA-AFLP 方法，再經由 reverse northern blotting assay 確認，共計獲得 66 個 cDNA clones，定序後得到 57 筆完整定序資料，已知基因片段共 34 個，分屬 27 種基因，為穎花發育相關之候選基因。第二年乃挑選 6 個基因：salT 基因 (salt-induced protein)、GA-SPY 基因(gibberellin action negative regulator SPY-related protein)、 U2AF 基因(U2 snRNP auxiliary factor，small subunit -related protein)、kinesin-like 基因、 DnaJ-like 基因、及 EF hand 基因，利用 Real-Time RT-PCR 分析，發現 salT 基因在突變體幼 花序中大量表現。因此，進一步分析 salT 基因在水稻不同器官中的表現，發現 salT 基因在 水稻中僅有一個拷貝數，葉鞘 salT 基因表現量比葉身高，在 SLP/SLP 幼花序中幾乎不表現， 但在 slp/slp 幼花序中表現量極高，因此進一步進行基因轉殖，將 salT 基因大量表現或抑制表 現，但是觀察轉殖株性狀，發現除了水稻TNG67 之 p1USN 轉殖株形態類似 slp 突變體外，其 他不論促進或抑制 salT 基因表現的 To 代轉殖株，均無穎花大小及型態改變，與試驗的假設不 符合，無法證明 salT 基因對穎花內外穎發育的影響。 關鍵詞：水稻、穎花發育、穎花相關基因

Abstract

The size and shape of lemma and palea may limit the developing of rice grains, that could affect the rice yield indirectly. Therefore it is interesting to clone genes related to lemma and palea. In this study, six genes from the lemma/palea related gene pool which is established un the first year of this project were further studied. Those genes are salT gene (salt-induced protein), GA-SPY gene

(gibberellin action negative regulator SPY-related protein), U2AF gene (U2 snRNP auxiliary factor, small subunit-related protein), kinesin-like gene, DnaJ-like gene, and EF hand gene. At first, the gene expression in leaves and 1~4 cm inflorescences of normal

lemma/palea (SLP/SLP), smaller lemma/palea (SLP/slp), and stunted lemma/palea (slp/slp) was compared by Real Time RT-PCR. The results showed that salT expression is higher in leaf sheath than in leaf lamina, and is especially high in the inflorescence of slp/slp mutant. The Southern blot showed that only one copy of salT gene in rice genome.

Key words : Rice, lemma and palea, lemma/palea related gene

前 言

世界人口持續增加，一般估計到2030 年全球人口可能會增加一倍，因此糧食生產及供應 勢必日益不足。水稻是世界上最重要的糧食作物之ㄧ，在水稻植株性狀中，穀粒大小與充實 度是構成產量的最直接因素，穀粒大小則受到穎花內、外穎構造的影響。已知現有的水稻種 源中就有各種大小穀粒及穎花形態與構造的變異，但是大多數都還沒有選殖到相關的基因。 農委會農業試驗所王強生博士領導的研究團隊，利用疊氮化鈉針對台農67 號水稻品種進行誘 變處理，經多代自交純化建立水稻突變庫(mutation pool)(曾等，2003)，其中出現一個小穎花

突變體(SLP/slp)，其自交後代中則出現了內、外穎皆退化的突變體(slp)， 是以前未曾發現的珍貴材料。因此本試驗希望能藉 由這些突變體的研究，分離出相關的基因，並探討 對穎花發育調控的影響，期望未來可以應用於水稻 穎花構造的改良。本計畫試驗流程示於圖1，在第 一年進行基因表現差異篩選，取 SLP 與 slp 突變 體1~4 公分幼花序，利用 cDNA-AFLP 方法篩選出 335 個 差 異 表 現 的 cDNA 片 段 ， 經 由 reverse northern blotting assay 確 認 獲 得 66 個 cDNA clones，定序後得到 57 筆完整定序資料，已知基 因片段共 34 個，分屬 27 種基因，為穎花發育相 關之候選基因。第二年乃挑選其中6 個基因：salT 基 因 (salt-induced protein) 、 GA-SPY 基 因 (gibberellin action negative regulator SPY-related protein)、U2AF 基因(U2 snRNP auxiliary factor， small subunit-related protein)、kinesin-like 基因、 DnaJ-like 基因、及 EF hand 基因，進一步探討其 與穎花發育關係。第三年進行基因轉殖，將 salT 基 因大量表現或抑制表現，觀察轉殖水稻植株性狀的 改變。

研 究 目 的

本試驗目的擬探討水稻穎花發育相關基因。以農試所王強生博士團隊利用疊氮化鈉誘變 品系後代中，篩選到小穎花突變體(SLP/slp,stunded lemma and plea)為材料，進行生長性狀調查 及基因表現差異篩選，期可分離出穎花發育相關基因。

文 獻 探 討

在水稻穎花研究方面，現有的水稻種原中已有各種大小榖粒及穎花型態的變異，但大多數僅 定位基因在染色體上的位置，而未選殖出相關的基因(Oryzabase 網站)，如：造成水稻缺乏內 穎的突變基因 pal1 便是座落在第六條染色體上(Luo et al., 2005)。水稻內外穎發育相關基因的 研究上，大多針對穎花內外穎數目增減或型態的變異進行研究，如：OsMADS1 基因會調控 水稻內外穎的形狀(Joen et al., 2000；Prasad et al., 2001)，OsFOR1 基因則可調控內穎或外穎 的數目(Jang et al., 2003)，對於穎花發育不完全或內外穎變小之研究較少。農委會農業試驗所 王強生博士領導的團隊，對水稻台農67 號品種進行疊氮化鈉誘變處理 (曾等, 2003)，在後代 品系中出現一小穎花突變體(SLP/slp,stunted lemma and palea)，此為極珍貴的材料。劉(2003) 首先以該突變體為材料，利用 cDNA-AFLP 方法找出一群穎花發育相關的候選基因，本試驗 自該基因庫挑選出六個有興趣的目標基因繼續進行分析，希望可以找出與穎花發育相關的基 因，期可應用在穎花構造的改良上。

材料與方法

材料 水稻 SLP/slp 穎花突變體源於行政院農委會農業試驗所農藝 組，由王強生博士及曾東海先生提供，以疊氮化鈉處理水稻 台農 67 號(TNG67)，所得誘變材料經自交數代後篩選獲得 TM6 品系；TM6 品系再與台梗二號(TK2)雜交，後代經自交 五代分離得到 SLP/slp 小穎花突變體。SLP/slp 突變體自交後 代會分離出正常型潁花(SLP)、小穎花突變體(SLP/slp)及內外 穎退化突變體(slp)。 方法 一、水稻穎花突變體形態及性狀調查 包括：分離後代植株形態觀察、組織切片觀察和農藝性狀及分離率調查。 二、水稻穎花突變體基因表現差異篩選 1. cDNA-AFLP 法：以正常型穎花(SLP)及內外穎退化突變體(slp)1~4 cm 花序，進行 cDNA-AFLP 分析，以篩選出表現差異的 cDNA 片段。參考 Gibco BRL 之 AFLPTM Analysis System。 主要包括四個步驟：(1) cDNA 的合成， (2) 限制酵素降解處理及接合子的連接， (3) PCR 初步擴增含接合子的 cDNA 模板， (4) PCR 擴增有差異表現的 cDNA 片段。 (5) 聚丙醯胺膠體電泳分析。 2. Reverse Northern 法：確認並篩選正常型穎花 (SLP) 及內外穎退化突變體 (slp)中表現差異的 cDNA 片段。 3. 差異表現 cDNA 片段選殖、定序及比對。 三、水稻穎花相關基因表現分析 本試驗由第一年所建立水稻穎花發育相關候選基因，依據差異片段表現的強度及該基因 的研究近況，挑選出六個有興趣的目標基因：salT 基因、GASPY 基因、U2AF 基因、 Kinesin-like 基因、DnaJ-like 基因、及EF-hand基因，分別設計引子(表1)，利用Real-Time RT-PCR 分析不同基因在SLP/SLP、SLP/slp與slp/slp 突變體葉片及幼花序中表現之差異。

四、水稻 salT 基因表現分析

本試驗進一步鎖定salT 基因，探討salT 基因是否與水稻穎花發育有關。

1. 水稻內生salT 基因拷貝數

選擇salT 基因組序列中，沒有切位的酵素BamHI及EcoRV，及一個切位的酵素PstI，酶 切水稻台農67號品種、SLP/SLP、SLP/slp及slp/slp突變體基因組DNA，以Dig-labeled salT coding region 序列，進行南方氏墨點分析，了解基因組DNA中所含salT基因的拷貝數。

2. 水稻salT基因表現 利用Real-Time RT-PCR，分析salT 基因在三種突變體基因組中的特性、表現時期及部 位等。 五、salT基因轉殖水稻 1. salT 基因構築：構築 salT 基因大量表現或抑制表現的質體。 2. salT 基因轉殖水稻：利用農桿菌法進行水稻基因轉殖。 3. salT 轉殖水稻農藝性狀調查：觀察轉殖水稻植株性狀的改變。 表1. 水稻穎花發育相關基因片段之引子設計。 基因名稱 引子名稱 引子序列 (5＇→ 3’) 預期擴增cDNA 片段(bp)

salT 5’salT TACGGATCCATGAGGCTGGTGAAGATTGG 438

3’salT TCATCTAGACTCGAGTCAAGGGTGGACGTAGATGCC

GASPY 5’ GA-SPY TACAGACAAGCAATCCCAGTTAACAGCGC 257

3’GA-SPY TCAGTAGGCCTGCAAAGCGTCGAATTCT

U2AF 5’ U2AF TACTGCAAGGAGCCCAGTCAGGGAAA 234

3’U2AF TCACCTGCATTTAAAAGGGTTACTCAGCC

Kinesin 5’Kinesin TACCAGATCAAAAAGATGATGTCCGGG 300

3’Kinesin TCAAGAGAGGAAATCACATTAACGCCAC

DnaJ-like 5’DnaJ-like TACCCTGATACAGTGACAGGAGAC 382 3’DnaJ-like TCACTGACAATTGATTCCTGGGTCGTGG

EF-hand 5’EF-hand TACCTCCATGGTGATAACCTGGAGCAACC 323

3’EF-hand TCATCTACCTGTTCAACAGCTCC

G3PDH 5’G3PDH CCGTTGATGGACCGTCCAGC 384

結 果 與 討 論

一、水稻穎花突變體形態及性狀調查 1. 突變體植株形態觀察 觀察水稻小穎花突變體(SLP/slp)自交後代分離族群，可分為正常型穎花(SLP)、小穎花突 變體(SLP/slp)及內外穎退化突變體(slp)三種 (圖 3)。 觀察 SLP/slp 突變體自交後代分離族群，營養生長初期三種外表型間差異並不明顯，但到 營養生長後期，植株高度漸增時，可以觀察到有差異，植株外觀上 SLP 正常型株高平均 121cm，與其來源親本台農 67 號相似，沒有異常表現，SLP/slp 突變體株高平均 115cm，與 SLP 正常型株高相近，但 SLP/slp 突變體葉片較挺直；slp 突變體則略矮，株高平均 77cm，比 正常型矮約 36%，葉片顏色較為深綠、組織較脆較缺乏彈性，劍葉之葉身與葉鞘間常發生扭 曲影響抽穗。分析三種外表型株高組成，發現 slp 突變體之穗長平均 13cm、第一節間平均 17cm 及第二節間平均10cm，長度上明顯都較 SLP 正常型及 SLP/slp 突變體之相同部位短 6~12cm， 是造成 slp 突變體矮小的主要原因 (表 2)。 因為 slp 突變體植株完全不稔，所以只調查 SLP 正常型及 SLP/slp 突變體部分農藝性狀， 顯示 SLP/slp 突變體平均穗數為 26 穗，比 SLP 正常型之 17 穗多；每穗穎花密度(7 穎花/cm) 與 SLP 正常型相當；稔實率 7%及千粒重 7g，則遠低於 SLP 正常型稔實率 56%及千粒重 24g (表 3)。 植株開花後則可直接依照穎花型態加以區分。SLP 正常型的穎花形態及大小與一般梗稻 相同，長度約0.8cm；SLP/slp 突變體穎花則較小，長度約 0.5cm，稔實率較低，平均 7%；slp 突變體穎花最小，長度僅約 0.2cm，而且不稔，觀察穎花內花器結構，三者均沒有變化，亦 即均保持水稻穎花基本結構：一對護穎、一個外穎、一個內穎、一對鱗被、六個雄蕊、一個 雌蕊。但三者之內穎、外穎、雄蕊及雌蕊在發育的程度上有所差別。(圖 4) 2. 突變體後代分離率調查 將水稻穎花 SLP/slp 突變體自交後代種植在臺大農場，調查後代分離族群中三種穎花外表 型分離情形，並進行簡單的χ2分析，結果顯示在調查的68 株分離後代中 SLPSLP : SLPslp : slpslp=15:35:18 (χ2=0.324, P=0.851)，符合孟德爾單基因自交後代分離比 1:2:1 的模式(表 4)。 推測影響穎花發育之突變基因為單一隱性之遺傳性狀。 3. 突變體組織切片觀察 可觀察到 SLP 正常型穎花的內、外穎組成由外到內有：外側表皮厚壁細胞、皮下厚壁細 胞、柔組織層薄壁細胞及內側表皮細胞四層構造，其後壁細胞均有明顯木質素的累積，外側 表皮以外因二次細胞壁不均勻增厚，形成凹凸不平的粗糙結構，呈現明顯木質素反應(圖 5A)。 SLP/slp 突變體大致上保留四層細胞構造，但木質化程度較弱，外側表皮變大，有明顯空腔構 造，表皮以外則沒有凹凸不平的粗糙結構(圖 5B)。而 slp 突變體仍可看到未發育的內、外穎， 仍有四層細胞構造，但各層細胞分化不完全 (圖 5C)。

二、水稻穎花突變體基因表現差異篩選

1. cDNA-AFLP 及 Reverse Northern 篩選結果：

以 SLP 正常型與 slp 突變體 1~4cm 長的幼花序為材料進行 cDNA-AFLP，使用 Gibco BRL 之AFLPTM Analysis System I 及 System II 共 128 個篩選引子組合進行聚丙醯胺膠體電泳分析， 篩選具差異性表現之cDNA 片段(圖 6)。發現 SLP 正常型中表現增強的 cDNA 片段有 164 個； slp 突變體中表現增強的 cDNA 片段有 171 個，總和 335 個具有差異表現的 cDNA 片段。配合 反向reverse northern blotting assay 再進一步篩選確認 SLP 正常型與 slp 突變體間表現有差異之 cDNA 片段，由 335 個 cDNA 片段中篩選出約 102 個 cDNA 片段，而且大部份均顯示在 slp 突變體1~4cm 花序內有較強的表現(圖 7)。

2. 差異表現 cDNA 片段選殖：

差異表現cDNA 片段的選殖優先選取 reverse northern blotting assay 中已確認具再現性差 異表現明顯的cDNA 片段，其次選取差異表現較不明顯或沒有反應的 cDNA 片段。目前由 52 個cDNA 片段，共選殖得到 66 個 cDNA clones。

3. 選殖 cDNA 片段之定序及比對結果

將前述選殖到的66 個 cDNA clones 送定序後，經扣除相同篩選引子得到之相同序列及定 序不完整者，共計得到57 筆完整的定序資料，分別來自於 47 個 cDNA-AFLP 片段。由 TIGR 網站 (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1) Sequence Search 的相關資料庫比對發現，不論是來自 SLP 正常型或 slp 突變體的 1~4cm 花序具差異表現性之 57 個 clones，其基因序列均存在於水 稻的BAC 或 PAC clones 上，而且大部分都對應到水稻基因的 coding sequence(表 5)。扣除上 述第一群對照用之II-2-c 及 I-14-c 外，其他 clones 定序後不均衡的散佈在水稻的 12 條染色體 上。顯示，slp 突變體所影響的基因並非只有單一或少數，而是廣泛分散在水稻基因組內。

這些reverse northern blotting assay 差異較顯著的 cDNA 片段相關 clones，經由資料庫比對 搜尋所對應到之相關蛋白質包括：一部份的salt-induced protein (II-24-1 等) 、DnaJ-like protein (II-6-1) 、 microtubule-associated protein-like-related (I-35-2) 、 chromatin remodeling factor CHD3-related (I-42-2)、protein Kinase-like protein-related (II-7-1)、putative clathrin assembly protein (II-1-3)、putative protein kinase (II-6-2)、ribosomal protein S6e (II-1-4)等。在核酸序列之 層次上都有高達77%或以上的相似性。其他 revrese northern blotting assay 反應較弱，差異較 不顯著的 cDNA 片段相關 clones，經資料庫比對其相關基因除部分與上述相同外，其他有趣 的蛋白尚包括：putative retroelement-related (II-19-1b)、kinesin-like protein-related (II-2-1)、 putative transposable element-related (II-21-2)、putative gag-pol polyprotein-related (II-36-4)等等 (表 5)。

三、水稻穎花相關基因表現分析

分析第一年所建立水稻穎花發育相關候選基因庫，依據差異片段表現的強度及該基因在 相關物種中的研究近況，挑選出六個有可能與穎花發育有關的基因進行分析，各基因及其所 在色體分別為：salt-induced protein(salT)(chr.1)、gibberellin action negative regulator SPY-related protein(GA-SPY)(chr.8)、U2 snRNP auxiliary factor，small subunit-related protein(U2AF)(chr.5)、 Kinesin-like protein (chr.4)、Dna-J-like protein (chr.2)、及EF hand(chr.10)。從所選殖片段的定

序結果與原始序列比對到相似序列的附近區域，分別設計適當的引子序列，以slp/slp 突變體 1-4 公分幼花序為材料，進行RT-PCR 擴增後，可以獲得各基因專一片段：salT(438bp)(圖8)、 GA-SPY (257bp) (圖9)、U2AF (234bp) (圖10)、Kinesin-like 基因(300bp) (圖11)、DnaJ-like 基 因(382bp) (圖12)、及EF hand (323bp)片段(圖13)，經過定序及比對後確認為預期擴增片段序列 (表1)。 進一步以SLP/SLP、SLP/slp、及slp/slp 突變體，劍葉葉片及1~10 公分幼花序為材料，利 用Real Time RT-PCR 分析此六個基因組織表現的差異，以G3PDH 基因表現量進行標準後， 可以獲得各基因的相對表現量(圖14)，依其表現趨勢分成四類： (1) salT 基因：葉部表現低，在slp/slp 幼花序中大量表現，顯示可能與穎花器官的發育有關。 分析salT 基因啟動子序列，含有：(1)RVA1-A 及RAV1-B motif，可供RVA1 蛋白質的AP2-like 及B3 區域結合(Kagaya et al., 1999)，又阿拉伯芥中的AP2 基因屬於AE 模型中的A 基因 (Ferrario et al, 2004)。(2) CArG (MADS-domain protein binding element )保守序列，可供AGL15 (AGAMOUS-like 15)及FLC (FLOWER LOCUS C)結合，AGL15 屬於MADS 蛋白質之ㄧ(Tang and Perry,2003)，可能為阿拉伯芥AE 模型中之C 群基因(Ferrario et al, 2004)；FLC與CArG 結 合後，可以抑制SOC1 基因的作用，而影響開花時間。因此，salT 基因在幼花序表現的差異 是否受上述啟動子特殊結合區域的調控，值得進一步探討。

(2) Kinesin-like 及EF hand 基因：在葉部大量表現，幼花序中表現低，且在三種突變體幼花 序中，表現量並無太大差異，因此推測可能與slp/slp 穎花發育異常的關係不大。

(3) GASPY 及U2AF 基因：在葉部大量表現，且在SLP/SLP 正常型花中表現量較高，而在slp/slp 突變體幼花序中表現量較少，因此，亦可能與穎花發育有關。在植物發育過程中，GA-SPY基 因被認為是GA 及Cytokinin 交互作用過程中的調控者(Wainberg et al., 2005)，因此，是否 slp/slp 突變體上游存在之突變基因調控GA-SPY 表現，影響GA 及Cytokinin 之交互作用，進 而造成slp/slp 突變體性狀，尚須經實驗證實。 (4) DnaJ-like 基因：在葉部及幼花序表現量差異不大，且無專一表現，因此可能與slp/slp 突 變體穎花發育中花器的決定無直接關係；不過，該基因在SLP/SLP 5-7公分幼花序中有較強的 表現，可能表示：花器決定後需要大量DnaJ-like蛋白質表現，以支持後續細胞分化及花器發 育，此部分推論尚須進一步證實。 四、水稻salT 基因表現特性分析 由於salT 基因在slp/slp 突變體幼花序中專一並大量表現，顯示salT 基因極可能與水稻穎 花發育有關係。因此本試驗首先選擇salT 為目標基因，分析其在三種突變體基因組中的拷貝 數、組織表現的差異，及在幼花序中的表現。 1. 水稻內生salT 基因拷貝數 利用南方氏墨點分析法，分析水稻台農67 號品種、SLP/SLP、SLP/slp、及slp/slp 突變體 基因組中，內生salT 基因的拷貝數(圖15)。選用在salT DNA中無切位的限制酵素BamHI 及 EcoRV，及一個切位的限制酵素PstI 進行酶切，進行探針雜合反應後，分別可獲得：BamHI (1 個條帶) 、EcoRV (1 個條帶)及PstI (2 個條帶)，且各基因組所得到的條帶大小相同；因此認 為在水稻基因組中salT 基因有1 個拷貝數，且salT 基因在不同突變體中表現量的差異，應與 salT 基因存在的拷貝數無關。利用RT-PCR 擴增SLP/SLP、SLP/slp、及slp/slp 突變體coding region部份，進行定序分析，發現三者coding region 序列完全相同，顯示salT 基因的coding region 部份未發生變異。因此，salT 在不同突變體中表現量的差異可能是基因轉錄或後轉錄

過程中量的差異造成的。

2. 水稻salT 基因之組織表現差異性

以Real Time RT-PCR比較不同突變體中，營養生長期和生殖生長期葉、葉鞘及幼花序salT 基因表現的差異(圖16)。(1) 在三葉齡幼苗期：只有分析SLP/SLP品系，salT基因表現量葉鞘 最高，根次之，葉又次之。(2) 營養生長期：三種株型salT基因在葉片的表現量都很低，葉鞘 的表現量則比在葉片高，但全都比SLP/SLP品系幼苗葉片低。(3) 生殖生長期：劍葉葉片中表 現量仍很低，但在葉鞘有明顯增加。(4) 1-10公分幼花序：salT基因在SLP/SLP品系中表現量低， 但在SLP/slp及slp突變體中的表現量顯著高於其他組織的表現量，以slp/slp表現量高；以上結 果顯示：salT基因的表現除了有組織專一性外，也會依生長時期不同而改變。此結果與文獻 報導相同(Claes et al., 1990；Garcia et al., 1998)。

3. 水稻salT 基因在幼花序之表現

利用Real Time RT-PCR比較不同長度幼花序salT基因表現的差異(圖17)。在水稻SLP/SLP 品系中，不同長度幼花序salT基因表現量均低，與劍葉葉片表現量差不多，在大於9公分的花 序表現量才略提高1-2倍。在SLP/slp突變體中，salT基因在1~2公分及3~4公分的幼花序有極高 的表現，比SLP/SLP劍葉表現量高出30~34倍，而9~10公分及10公分以上表現量比SLP/SLP劍 葉表現量高出4~5倍，也略比SLP/SLP正常型發育後期幼花序高1.9~2.7倍。在水稻slp突變體 中，1~2公分、4~5公分、6~7公分及10公分以上的幼花序表現量最高，比SLP/SLP劍葉表現量 高出24~34倍；其次在5~6公分、7~8公分、及9~10公分也有略高的表現量，比SLP/SLP劍葉表 現量高4.3~6倍。總體而言，SLP/slp突變體及slp/slp突變體大部分長度幼花序，salT基因表現 均比SLP/SLP正常型高。 salT基因在突變穎花花序分化僅1-2公分時，即可觀察到其強表現，此時期為穎片分化期 到花器官分化期，因此，salT基因極可能在穎花發育的穎片分化及花器官分化過程中扮演重 要角色；至於salT基因真正表現的部位。仍需經由原位雜合反應進行確認。 五、salT基因轉殖水稻 進一步選擇 salT 基因，進行基因轉殖試驗，首先構築 salT 基因大量表現或抑制表現的 質體（圖 18），利用農桿菌法進行水稻基因轉殖。結果各質體都得到轉殖水稻，轉殖效率為

2% - 25.9%（表 6）。以南方墨點法分析，轉殖株有不同copy salT 基因（圖 19）。利用 Real Time RT-PCR 分析內生 salT 基因的相對表現量，發現各轉殖水稻間有明顯差異（圖 20, 21）。但是 進一步觀察轉殖株性狀，發現除了水稻TNG67 之 p1USN 轉殖株形態類似 slp 突變體外，其他 不論促進或抑制 salT 基因表現的 To 代轉殖株，均無穎花大小及型態改變（圖 22），與試驗的 假設不符合，無法證明 salT 基因對穎花內外穎發育的影響。 這個問題仍需再經下列試驗確認： (1)分析 salT 基因在轉殖株中幼花序的表現量：雖然分析轉殖株水稻營養生長期葉片可以發現 大部分 salT 基因有預期的表現，但是並未確定是否 salT 基因的表現可以延伸至生殖生長時期 的幼花序組織上；必須確認 salT 基因的確在幼花序組織表現且不造成穎花性狀改變，才能下 此定論。 (2) 分析 TNG67 之 salT 持續性表現的轉殖株：TNG67 之 p1USN 轉殖株雖然在型態上與 slp 突變體類似，但由於轉殖株過少，且生長狀況不佳，無法做深入的觀察與研究，必須提供更 多轉殖株才能加以分析確認。

(3) 分析轉殖株 T1 代性狀：雖然 salT 基因 T0 代轉殖株外表性狀，如：株高及穎花型態，看 起來與未轉殖水稻無明顯差異，但是觀察T1 代營養生長期性狀，發現部分轉殖株後代除有分 離現象外，株高也變矮，約只有非轉殖株的1/2，且葉色較深，類似 slp 突變體營養生長時期 的外表性狀，此部份待植株生長至生殖生長期，值得進一步進行分析。 (4) 分析其他可能與水稻穎花有關的基因：根據劉(2003)分析，slp 突變體可能是由一個隱性 基因突變後，調控其下游許多因子而造成型態上的變異；在下游基因中，或許除了 salT 基因 外，另有其他基因與 salT 分別或共同調控穎花發育，這也可能是 salT 基因轉殖株穎花型態不 如預期的原因之一。

附圖及附表

表 2. SLP/slp 突變體自交後代分離族群中三種外表型植株之穂長、各節間長及株高之調查。(單位：公分)

圖 4. SLP/slp 突變體自交後代分離出三種外表 型植株的花序及穎花形態。 (A) 三種外表型植株的稻穗。 (B) 三種外表型植株開放中的穎花長。 (C) 三種外表型植株的雌蕊。 (D) 三種外表型植株的穀粒。 圖 3. SLP/slp 突變體自交後代分離出三種 外表型的植株。(圖示為生長 90 天之植株) (A) Slp/slp 突變體自交後代分離出的三種 外表型，分別為：SLP 正常型(B)、SLP/slp 突變體(C)及 slp 突變體(D)。 表 3. SLP 正常型與 SLP/slp 突變體之平均穂數、每穗穎花數、穎花密度、稔實率與千粒重調查。SLP/slp 突變體穂數比 SLP 正常型多，但穎花密度相當，稔實率及千粒重均不及 SLP 正常型。

表5. 定序之 cDNA 相關 clones 與已知基因資料庫比對結果(部分)。

No. Candidate or genomic clone

I-49-1 I-56-2 II-17-2 II-20-2 II-24-1

AF285163 salt-induced protein |chr_1|P0440D10|2821

II-24-2 AF285163 salt-induced protein |chr_1|P0440D10|2821 II-39-1 beta-galactosidase |chr_10|OSJNBa0050M22|3168

表 4.SLP/slp 突變體自交後代分離族群中三種 外表型後裔之分離率調查。 圖 6. cDNA-AFLP 之聚丙醯胺膠體電泳圖(部 分)。▽ 為 slp 突變體表現被抑制的 cDNA 片 段，共有164 個。 △ 為 slp 突變體表現被誘 導的cDNA 片段，共有 171 個，共 335 個具有 差異性表現的片斷。II-20、II-21 及 II-22 為 cDNA-AFLP system II 使用之引子組合代號。

圖 7.差異表現 cDNA 片段進行 Reverse Northern Blotting 篩選結果（部分）。 SLP 代表 SLP 正常型1-4cm 花序，slp 代表 slp 突變體 1-4cm 花序 mRNA。數字 19~30 表示進行 cDNA-AFLP 所使用的引子編號，各引子可再分別得到不同的差異性 片段，以1、2…數字表示之。 圖 5. SLP/slp 突變體自交後代之穎花外穎的組織切 片觀察。(A) SLP 正常型，(B)SLP/slp 突變體，(C) slp 突變體。其內外穎組成由外而內為：外側表皮 厚壁細(a)，皮下厚壁細胞(b)，薄壁細胞(c)，內側 表皮細胞(d)。紅色為木質素染色的結果。

II-37-1 CG9752 gene product |chr_7|OJ1333_D04|2065

Oryza sativa genomic DNA, chromosome 7, BAC clone:OSJNBb0005G07. I-42-2 chromatin remodeling factorCHD3-related |chr_6|P0499E08|1895 II-33-1 helicase conserved C-terminal domain, putative |chr_3|OJ1123F12|4380 I-35-2 microtubule-associated protein-like-related |chr_6|OSJNBb0065C04|3775 II-4-2 myosin heavy chain, putative |chr_1|P0694A04|2789

II-38-1 putative bifunctional nuclease-related |chr_1|P0409B08|2704 II-36-4 putative gag-pol polyprotein-related |chr_6|P0417G12|1960 II-19-1b Putative retroelement-related |chr_1|B1131G08|4438 II-1-4 ribosomal protein S6e, putative |chr_7|OJ1119_F04|2014

II-62-1 Oryza sativa (japonica cultivar-group) chromosome 6 clone P0414E10. (AP005852) II-6-1 DnaJ-likeprotein|o_sativa|chr_2|P0519E06|4335

II-20-1a EF hand, putative putative |chr_10|OSJNBa0051J07|3650 II-2-1 kinesin-like protein-related |chr_4|OSJNBb0006N15|5373 II-41-1 protein kinase-like protein-related |chr_12|OJ1587_D05|4939 II-21-2 putative transposable element-related |chr_12|OJ1058_H10|5050 II-51-1 gibberellin action negative regulator SPY-related |chr_8|P0562A06|5623

U2 snRNP auxiliary factor, small subunit-related |chr_5|OSJNBb0053D02|4999 II-63-2 similar to cdc2 protein kinase |chr_8|OJ1325_B11|3078

II-61-1 helicase conserved C-terminal domain, putative |chr_3|OJ1123F12|4380 I-14-c putative pectinacetylesterase |chr_5|P0016H04|2965

備註：1.資料整合使用 The TIGR Rice Database (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)之 Sequence Search 內 All Rice BAC and PAC Sequence 與 TIGR Whole Rice Genome Annotation DB:Coding Sequence 兩個資料庫。 2. clone 的命名原則，以 II-19-2a 為例，表示該 clone 選自於 AFLP Analysis System II 第 19 個篩選引子

組合，篩選的第2 個差異表現 cDNA 片段；加註小寫英文字母，表示該 cDNA 片段重複選殖不同 clones， 得到不同定序結果。

14

圖8.

圖9. 圖10.

15

圖6. Kinesin-like 基因序列。

Kinesin motor domain (kinesin-like)基因序列源於The Institute for Genomic Research

(TIGR) 網站2004 年10 月4 日資料，編號9632.t02893，屬於未發表之基因組DNA 資料。黃色部份為基因組序列中與mRNA 序列相似的部份，可能為exon 區域。代 表與劉(2003)選殖片段相同的序列，數字部份代表鹼基數目編號，紅色粗體部分為 Real Time RT-PCR 反應引子設計的位置， 5’Kinesin 及3’Kinesin 引子擴增片段為 300bp。

圖11.

16 圖13. 圖 9. 圖14. 圖 10. 圖15. 圖 11. 圖16. 圖 12. 圖17.

17 表6. 水稻台農 67 號及 SLP 品系以農桿菌轉殖 salT 基因之轉殖效率。 圖18 . salT基因構築圖譜 (A) 誘導表現構築圖譜(p1ASN)：以ABRC1啟動子（受ABA誘導而表現）驅動salT基因，其在SLP 品系植株可受ABA誘導而大量表現。 (B) 持續表現構築圖譜(p1USA)：以玉米的ubi1 啟動子（持續性表現）驅動salT基因，使其在SLP 品系植株中持續大量表現。 (C) 抑制表現構築圖譜(p1RSN)：利用RNAi的原理，抑制SLP品系植株中內生salT基因之表現。 1 轉殖癒合組織：進行農桿菌感染之水稻癒合 組織總數。 2 抗 hygromycin 轉殖癒合組織：經過含抗生素 hygromycin 篩選培養後，具抗性的水稻癒合組 織總數。 3 再生植株之癒合組織：抗 hygromycin 的水稻 癒合組織中，具再生能力的總數。 4 轉殖水稻株數：獲得確認為轉殖株的數目。 5 轉殖效率(%)：轉殖效率，由 regenerated No. of calli / No. of callus infection 公式計算而來。

圖 19. 水稻 SLP 品系 salT 基因轉殖株之南方氏墨點法分析。

自 SLP 品系水稻 p1USN 及 p1RSN 轉殖株取 20μg 基因組 DNA，未轉殖的 SLP 及 p1ASN 以限制酵素 SacI 進行酶切，plUSN 轉殖株(SU)以限制酵素 SphI 進行酶切， p1RSN 轉殖株(TR)以限制酵素 KpnI 酵素進行酶切；於 0.8％瓊脂膠體進行電泳後， 轉漬於尼龍膜，以Dig 標定之 hpt 基因片段為探針進行雜合反應。M 代表 1Kb Marker。

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圖 20. 水稻 SLP 正常型 p1ASN 及 p1UAN 轉殖株 salT 基因表現量分析。

萃取水稻 SLP 品系之 p1ASN 及 p1USN 轉殖株葉片 RNA，利用 Real Time RT-PCR 分

析內生 salT 基因的相對表現量；ＳA 及ＳU 分別代表 p1ASN 及 p1USN 構築質粒。 ★表 示表現量比 SLP 未轉殖株大 50 倍之轉殖株。

圖 21. 水稻 SLP 品系 p1RSN 轉殖系抑制內生 salT 表現量分析。

萃取水稻 SLP 品系之 p1RSN 轉殖株葉片 RNA，利用 Real Time RT-PCR 分析內生

salT 基因的相對表現量；橫軸代表轉殖株編號，SR 代表 p1RSN 構築質粒。 ★表示抑制

80%以上內生 salT 表現量。

圖 23. 水稻 salT 基因轉殖株外表性狀及榖粒型態。 (A) 營養生長期轉殖株的外表型態。

(B) TU1 植株為 p1USN 促進 salT 表現轉殖株，TA1 植株為 p1ASN 誘導 salT 表現轉殖株，TU1 比 TA1 矮。 (C) TR1a 為 p1RSN 抑制 salT 表現轉殖株、TU2 為 p1USN 促進 salT 表現轉殖株，TU2 比其它植株矮。 (D) SLP 轉殖系榖粒型態,SA 為 p1ASN 轉殖系,SU 為 p1USN 轉殖系,SR 為 p1RSN 轉殖系,SLP 為非轉殖株。

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參 考 文 獻

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