應用體細胞核移植技術在家畜育種及生物醫學之研究(1/3)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

應用體細胞核移植技術在家畜育種及生物醫學之研究(1/3)

計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2317-B-002-021- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學畜產學系暨研究所 計畫主持人： 吳信志 共同主持人： 杜清富 計畫參與人員： 陳建宏、蕭士翔、黃馨儀、黃紹怡、連雯慈 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 5 月 30 日

農業生物技術國家型科技計畫成果報告

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※應用體細胞核移植技術在家畜育種及生物醫學之研究 ※

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計畫類別：□重點領域計畫 ██研發應用計畫

計畫編號：

NSC 93-2317-B-002-021

執行期間：93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日

計畫主持人：吳信志

共同主持人：、杜清富

計畫參與人員：陳建宏、蕭士翔、黃馨儀、黃紹怡、連雯慈

執行單位：台灣大學畜產系及台灣動物科技研究所

中 華 民 國

94 年 05 月 29 日

目錄

一、摘要………....PP 3-4

二、英文摘要………PP 4-5

三、計畫緣由與目的………PP 5-7

四、材料與方法………PP 7-9

五、結果與討論………PP 9-11

六、研究結果自評………....PP 11-13

七、參考文獻………PP 13-14

表

1.

優良種猪體細胞之建立……….P15

表

2.

以體內成熟猪卵母細胞進行體細胞複製猪產製試驗之結果………P16

圖

1.

成年優良種公猪之耳成纖維母細胞複製猪………P17

圖

2.

基因轉殖小鼠猪之綠色螢光表現……….P18

圖

3.

基因轉殖小鼠猪胎兒之骨髓所分離之表現綠色螢光的純系間葉幹細胞株 P19

圖

4.

紅色部份為源自骨髓之間葉性幹細胞經誘導分化 6 天(A 圖)及九天(B 圖)後之脂肪細胞 P20

農業生物技術國家型科技計畫成果報告

計畫名稱：應用體細胞核移植技術在家畜育種及生物醫學之研究

計畫編號：NSC 93-2317-B-002-021

執行期限：93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日

主持人：吳信志

執行機構及單位名稱：台灣大學畜產系及台灣動物科技研究所

共同主持人：杜清富

計畫參與人員：陳建宏、蕭士翔、黃馨儀、黃紹怡、連雯慈

執行機構及單位名稱：台灣大學畜產系及台灣動物科技研究所

一、摘要 本計畫第一年目標擬先以基因顯微注射法產 製 綠 色 螢 光 (enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因轉殖猪，作為第二年單株 骨髓間質幹細胞分離之用。另持續進行優良 種猪體細胞株之建立、種源保存、猪胚體外 培養系統之建立和體細胞複製猪試驗。自卵 巢表面濾泡 (直徑 2~8mm) 收集卵丘卵母細 胞複合體，培養於 NCSU-23 成熟培養液中 42-44 h，挑選排出第一極體之卵母細胞進行 去核，再將單一之成纖維母細胞 (fibroblast) 或間葉幹細胞細胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 注射至已去核之卵母細胞內，重組胚 經不同方式激活，包括 (1) 單次電擊激活 (electroporation, EP, 10 sec at 5V AC followed by a 1 x 30 µsec pulse at 2.2 kV/cm DC) 後， 配合細胞骨架鬆弛劑 (cytochalasin B, CB, 10 µg/mL) 合 併 蛋 白 質 合 成 抑 制 劑 (cycloheximide, CHX, 10 µg/mL) 處理，或 (2) 於單次電擊後，以蛋白質轉磷酸酶抑制劑 (6-dimethylaminopurine, 6-DMAP, 2mM) 處 理。結果顯示，以相同方式激活後，成纖維 細胞作為供核細胞者囊胚率較高於以間葉幹 細胞者 （37 vs. 34%, 28 vs. 24%），而以 EP ＋6-DMAP 激 活 處 理 之 分 裂 率 及 囊 胚 率 （88-89%, 34-37%）均較高於以 EP＋CB＋ CHX 處理者（75-80%, 24-28%），其中以 MSC 為供核細胞進行核轉置，並以 EP＋CB ＋CHX 激活之處理組，其囊胚率（24%）顯 著低於以EP＋6-DMAP 激活處理者（34-37%, p<0.05）。結果顯示，由 MSC 所形成之重組 胚體外發育能力較低於由成纖維細胞形成 者，而電激後添加6-DMAP 進行化學激活處 理可顯著改善重組胚之分裂及囊胚率。以上 述 試 驗 結 果 為 基 礎 ， 嘗 試 以 電 激 活 配 合 6-DMAP激活條件進行核移置胚之產製，期能 提高複製猪之產製效率，試驗係以優良種公 猪之耳皮膚成纖維母細胞當作供核細胞進行 核移植之試驗，再次成功複製九頭優良種公 猪，此結果證實產製效率已由0.5 % (4/795) 提高至 4 % (9/223)，同窩可分娩九頭複製 猪，已接近可產業化程度。此外，以顯微注 射 EGFP 基因生產不同品系之綠色螢光小 鼠，經基因注射後之原核胚，儘速移置回同 期化處理之代理孕母體內，待懷孕期滿，以 PCR 檢測小鼠是否帶有外源基因並觀察其螢 光表現。經分別移置326 及 60 個 FVB 及 ICR 鼠胚至 12 和 2 隻代理孕母體內，並產下 68 及15 隻小鼠。以 PCR 分析確定有 9 (13 %) 及 4 (27 %) 隻攜帶 EGFP 基因，其中會表現綠 色螢光者為6 (9 %, 2♂/ 4♀) 及 4 (27 %, 2♂/ 2♀) 隻。相同轉殖基因亦被以猪胚原核基因 顯微注入方式成功獲得二頭 EGFP 基因轉殖 猪胎兒，經長波長(365 nm)紫外光偵測後證實 均可表現EGFP。表現 EGFP 之小鼠均具有性 腺遺傳能力，其子代有不同比例 (25-50 %) 可表現EGFP。結果顯示，小鼠原核胚經注射 EGFP 基因及胚移置後，可成功產下不同品系 之基因轉殖小鼠，並可表現綠色螢光且具穩 定之性腺遺傳能力。進一步分離綠色螢光轉

基因小鼠純系之骨髓間葉幹細胞。以長波長 (365 nm)紫外光偵測綠色螢光蛋白質基因在 小鼠個體中之表現。結果顯示，各組織器官 除脾臟、肺臟與骨組織外，其他器官如：心 臟、肌肉、腦、肝、睪丸、腸道、腎、眼球 及胰臟等均高度表達綠色螢光。源自股骨與 脛骨的骨髓間葉幹細胞，經螢光顯微鏡檢查 結果證明此等幹細胞確有表達綠色螢光之事 實，進一步將猪及小鼠之骨髓間葉幹細胞於 特定培養條件下進行誘導分化之試驗，已確 認可分化成脂肪細胞。綜合上述，由MSC 所 形成之重組胚體外發育能力較低於由成纖維 細胞形成者，而電激後添加6-DMAP 處理可 顯著改善重組胚之分裂率、囊胚率及產製複 製猪之效率。本研究自綠色螢光小鼠骨髓成 功分離獲得純系間葉幹細胞，可提供以猪為 模式進行臨床前細胞治療、基因治療或組織 工程等極具研究應用潛力之細胞來源。 關鍵詞：體細胞，複製猪，核移植，體外成 熟，猪卵母細胞，間葉幹細胞 二、英文摘要

The purposes of this study in the first year was to proceed with the cryopreservation of ear skin fibroblast cells derived from elite pigs’ herds are able to march forward continuously for cloning of elite pigs as well as to generate of EGFP (enhanced green fluorescent protein) transgenic pigs harboring EGFP marker gene by pronuclear microinjection for isolation of mescenchymal stem cells (MSC) of single clone derived from their bone marrow. In our results, primary fibroblast cells of top-performance individuals were established from skin samples taken from ear tissues. So far, derived somatic cells from over 50 elite pigs containing golden couples had been cryopreserved in liquid nitrogen tank. In addition, pig oocytes derived from ovaries of sow, cumulus-oocyte complexes were matured

in vitro for 42–44h, and oocytes with 1st polar

body were selected for enucleation and reconstructed embryos could successfully activated by electrical activation and the electrical pulse combined with CB+ CHX or 6-DMAP would greatly improve the rates of cleavage to 80-90% and blastocyst formation

rate to 30-40%. To study the effects of different donor cell types and activation methods on the subsequent development of porcine reconstructed embryos produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT). A single suspended fibroblast or mesenchymal stem cell (MSC) was injected into enucleated ooplasm, and reconstructed embroys were activated by one of following methods: (1) electrical pulse (EP, 10 sec at 5V AC followed by a 1 x 30 µsec pulse at 2.2 kV/cm DC) combined with10 µg/mL cytochalasin B and 10 µg/mL cycloheximide for 4 h (EP+ CB+ CHX), or (2) EP combined with 2 mM 6-DMAP for 4 h (EP+ 6-DMAP). After activation treatments, the reconstructed embryos were thoroughly washed and cultured for 4 days in NCSU-23 medium. Results showed that the percentage of blastocyst formation in these treatments using the same activation method were greater in Fibroblast groups than in MSC groups (37 vs. 34%, 28 vs. 24%). The rates of cleavage and blastocyst formation were better in the groups treated with EP+ 6-DMAP (88-89%, 34-37%) than EP+ CB+ CHX (75-80%, 24-28%). Base on upper result, we generated successfully 9 cloned piglets in one litter by nuclear transfer of somatic cell derived from ear tissue of top-performance boar from core of artificial insemination. The efficiency of generating cloned piglet is elevated to 4 % (9/223) from 0.5 % (4/795). This result indicated the probability of this cloning technique for commercialization. Additionally, enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene was introduced into mouse genome of FVB and ICR strain embryos by pronuclear microinjection. A total of 326 FVB and 60 ICR survival embryos were transferred into 12 and 2 recipient mice, respectively, and 68 FVB and 15 ICR pups were born. Nine (13 %) FVB and four (27 %) ICR mice were confirmed to be transgenic mice by PCR and Southern blotting analysis. Among them, six FVB (9 %, 2♂/ 4♀) and four ICR (27 %, 2♂/ 2♀) TG mice could express EGFP fluorescent and exhibit stable integration of the transgene in their germ line. As the experiments of EGFP transgenic mice, two transgenic fetuses of pig were produced and the EGFP expression pattern is similar to the transgenic mouse.

The EGFP expression pattern of transgenic mice and pig fetuses was analysis by 365 nm UV light. Exclusion of spleen, lung and bone tissue, other organs (heart, muscle, brain, liver, testis, gut, kidney, eyes and pancreas etc.) highly expressed EGFP in transgenic mice and pig fetuses. Bone marrow was flushed out from femurs and tibias of transgenic candidates, the near-to confluence fibroblastic colony were obtained under the conditions of 2 X 106/cm2 of the starting culture and the incubation time of 72 hours. Expression of EGFP in isolated MSCs of transgenic pig fetuses and mice were detected by using fluorescent microscope. The EGFP MSCs derived from transgenic pig fetuses and mice were preliminary isolated from the transgenics in this study. Progressively, the MSCs were successfully conducted to give rise to adipocyte under defined culture conditions. In conclusions, our results indicates that the porcine reconstructed embryos using MSC as donor cell exhibit the poorer developmental potential in vitro, and the activation method of EP+ 6-DAMP was sufficient for cloned embryos to develop to term in our studies. The cell populations will be available in preclinical studies including cell therapy, gene therapy, tissue engineering fields and application in pig model.

Keywords: Somatic Cells, Nuclear Transfer,

Cloned pigs, In Vitro Maturation, Porcine Oocytes, Mesenchymal stem cells 三、計畫緣由與目的 家畜核移植技術未來將展望於複製遺 傳背景一致性的動物、表現性能優越之基 因轉殖動物，生產單一性別家畜及高生產 性能之優良種畜，甚至瀕臨絕種野生哺乳 動物之復育，以及將來哺乳動物之基因定 位轉殖或基因剔除之研究。基因轉殖技術 與複製動物技術為現今家畜基因工程之關 鍵性平台技術，胚原核基因顯微注射技術 在國內已發展十年，並已成熟至可例行性 產製基因轉殖家畜之階段，進而發展以基 因轉殖家畜為分子牧場，生產珍貴蛋白質 醫藥。在複製技術方面，因應用此技術將 成功轉染外源基因之細胞核移植於受核卵 後 ， 發 育 成 基 因 轉 殖 動 物 之 效 率 近 乎 100%，其技術價值可凌駕胚原核基因顯微 注射，複製技術可將高生產性能之家畜、 基因轉殖動物之體細胞、基因剔除之細胞 進行大量的複製，惟複製技術尚處於發展 階段，在國外1997 年起才有體細胞複製綿 羊報告，2000 年才有複製猪的報告，甚且 其成功獲得複製猪之效率僅1-2%，家畜基 因顯微注射技術成功將基因引入基因組之 效率達10-20%，相較之下複製動物技術仍 有很大之發展空間。 複製(clone)之定義一般指遺傳物質完全 相同之個體或產生遺傳物質完全相同個體之 過程。其中之個體，可以是特定之去氧核糖 核酸 (deoxyribonucleic acid; DNA) 片段、單 一細胞、或為完整之多細胞生物 (Smith and Wilmut, 1989)。研究脊椎動物複製之來龍去 脈，首推美國科學家Briggs & King(1952)成功 地自青蛙的胚(2n)細胞成功複製青蛙，開啟脊 椎動物複製之門。而1962至1975年Gurdon嘗 試將已分化之腸道上皮細胞核及成蛙之角化 皮膚細胞進行核移植，並探討其發育潛能， 結果發現在經紫外線照射後之卵細胞質的影 響下，得到發育正長之成蛙，此結果更震憾 全球生命科學界。從此觸發無數研究人員探 討複製哺乳動物之企圖心，試驗之初係以哺 乳動物為對象，重複Gurdon之試驗，但均未 能獲得具體之成果，直至1986年Willadsen首 次將綿羊八細胞階段之胚葉細胞核轉殖入另 一去核卵細胞，成功複製綿羊，創造了以哺 乳動物早期胚細胞複製成功之首例。在複製 猪研究方面，于1989年Prather 等以4-細胞期 猪胚經核移植過程獲得一頭仔猪，此乃最早 複製猪隻成功之例；至1990年以早期胚細胞 當供核細胞成功產製核移植之動物包括兔子 (Collas and Robl, 1990)及牛(Bondioli et al., 1990)。直至Wilmut et al.(1997)進一步培養成 年綿羊之初代乳腺上皮細胞，以逐漸降低培 養液中血清含量之方式，將其細胞周期回歸 至G0期後作為供核細胞，成功獲得核移置綿 羊-Dolly，此結果提示，分化後之細胞核可透 過人為之處理方式，促使回復(reprogram)至 分化前之狀態，同時突破了家畜核移置及基 因剔除技術之研究瓶頸。隨後，Schnieke et al.,

1997即以攜人類第九凝血因子基因之綿羊成 纖維母細胞作為供核者，結果獲得人類第九 凝血因子基因轉殖綿羊-Polly，可謂集核移置 及基因轉殖技術研究之大成。再者Wakayama et al.(1998)使用已分化之成年母小鼠之自然 排出卵丘細胞(cumulus cells)、賽托力氏細胞 (sertoli cells)及腦神經細胞(brain neuronal cells)，以預先製備之不同直徑大小玻璃針， 將細胞質去除後所得之細胞核當作供核者， 經注射於去核卵母細胞質後證實均具有發育 成胎兒之潛能，尤其以卵丘細胞核當供核者 之試驗結果更進一步證明可發育成完整個 體，再次證實體細胞再程序化後之發育潛 能。以綿羊體細胞核移植配合指定位置基因 轉殖技術亦於2000年被McCreath等人研發成 功；以體細胞當供核者進行複製猪研究之三 個團隊，幾乎同時發表複製成功之結果，其 中體內成熟 (Polejaeva et al., 2000; Onishi et

al., 2000)與體外成熟 (Betthauser et al., 2000)

之卵母細胞當受核，均成功地獲得複製猪， 全球首度成功複製哺乳動物「桃莉羊」之英 國羅斯林學院(Roslin Institute)PPL's公司亦在 其列，于西元2000年三月五日再以成年動物 體細胞複製米莉(Millie)、克莉絲塔(Christa)、 愛力克絲(Alexis)、卡蕊爾(Carrel)及達克肯 (Doccom)⎯五胞胎小猪，他們皆健康活潑， 且攜帶相同之遺傳物質。更可貴者，係同時 攜帶源自人類抗猪器官移植於人之抗排斥有 關的基因，此特性在家畜基因轉殖之研究及 應用領域上，極具發展潛力及經濟價值。依 專家對其器官移植於人體之臨床試驗所需時 間評估指稱，未來四至六年內可能完成猪器 官移植於人體之試驗目標，這項成果可在解 決全世界器官短缺危機問題上，提供近期解 決之道。而以猪之α-1,3-半乳醣基因轉移酵素 基因剔除猪胎兒成纖維母細胞當供核者進行 核移植試驗，成功獲得基因剔除複製猪之消 息，于2002年相繼由密蘇里大學Lai 等及PPL 公司Dai 等所發表，甚至基因座上的成對α -1,3-半乳醣基因轉移酵素基因剔除猪亦被 Phelps et al.(2003)成功獲得。以成年體細胞 (adult cells)成功複製優良遺傳性能之種公猪 于2002年3月首由Infigen 和 Genmark公司共 同發表。之後，複製貓(Shin et al., 2002) 、 兔(Chesne et al., 2002)、 騾(Woods et al.,

2003)、馬(Galli et al., 2003)及大鼠(Zhou et al., 2003)等均陸續被成功複製，上述結果提示， 複製動物技術已逐漸成熟，幾乎達可例行化 產製之境界 ，惟複製胚之產製效率及胚移置 後發育成完整個體之百分率仍低，其原因有 待進 一步試驗之結果謀求解決。 依Park 等人 2001 年所發表之攜綠色螢 光蛋白基因複製猪及Lai 等人 2002 年獲得之 α-1,3-半乳醣基因轉移酵素基因基因剔除複 製猪，均以體外成熟卵母細胞為受核卵質之 來源，然其健康狀況均未及PPL 公司以去核 之體內成熟卵母細胞所獲得之複製猪，雖複 製猪之產製方法及猪隻品系並未完全相似， 然就孤雌激活後之發育率及顯微操作後之耐 受性及存活率而言，體內成熟卵母細胞之品 質仍較體外成熟者為佳。此結果提示，目前 之猪卵母細胞體外成熟培養條件尚未臻完 善，未來仍有改善之空間。在複製猪研究方 面，1989 年 Prather et al.以 4-細胞期猪胚經 NT 獲得一頭仔猪；有關台灣複製猪之研究有 二個成功之例曾被報導者，畜產試驗所1992 年發表小耳種迷你猪 4 細胞期胚葉細胞核移 植於雜種猪之去核卵質中，結果成功獲得 8 頭核移植仔猪，其中存活 6 頭，2 頭死產， 最後育成 5 頭，此核移植小耳種迷你猪之出 生體重為小耳種猪之145.45 %。離乳體重為 純小耳猪之199.36 %，顯示此等操作策略對 猪隻之出生及離乳體重有改進之效果，惟其 遺傳背景並非完全相同。 收集自屠宰場卵巢之卵丘卵母細胞複 合體，于38.5℃、5% C02、相對濕度100% 條件下，體外成熟培養36小時後，經去卵丘 細胞及離心處理，約60-80%卵母細胞排出 第一極體，成熟培養時間延長至44-48小 時，則第一極體排出率可提高至80-90%。 排出第一極體之卵母細胞，經機械式壓擠方 式去核處理後，其去核率約50-80%，去核 率在批次間之差異甚巨，究其原因，發現可 能與各批次間卵母細胞之品質及新鮮度有 關，且卵細胞質品質鬆散及老化之卵母細胞 經去核處理後之去核率有偏低現象。以表現 猪乳鐵蛋白及人類凝血第九因子之雙基因 轉殖母猪體細胞作為供核細胞進行核移植 之結果已證實可育成複製猪，合計產製795 個外觀形態完整之複製胚，經胚移置於11

頭同期發情處理之受胚猪，其懷孕率可達55 % (6/11) ，其中三頭受胚猪發生早期流 產，合計流出6個已成形之複製猪胎兒，另3 頭受胚猪則順利懷孕至預產期，以剖腹產方 式共獲得4頭雙基因轉殖複製猪，產製效率 為0.5% (4/795)，其中第一頭複製猪於91年2 月15日誕生，為全球第一頭攜雙轉殖基因之 複製猪。 本計畫目標擬先以基因顯微注射法產 製綠色螢光基因轉殖小鼠及猪，作為第二年 單株骨髓間質幹細胞分離之用。另持續進行 優良種猪體細胞株之建立、種源保存、猪胚 體外培養系統之建立和體細胞複製猪試驗。 四、材料與方法 (一)、優良種猪體細胞之來源 經與國內多家種猪場接洽後，其中願景 金來、暉煌、及福昌種猪場參與本計畫之意 願，並擇期進行優良種猪耳組織之採樣，且 簽署優良種猪保種協議書。 (二)、採樣及體細胞初代培養 清潔及消毒耳組織後，以滅菌之耳刻鉗 剪下耳組織，經清潔及酒精浸泡後，置於 D-PBS 中，再以剪刀剪碎處理後，置於含 5% CO2, 95%相對濕度之 37℃培養箱中，以添加 10%胎牛血清之 DMEM 培養液培養 10-14 天 後，即可開始繼代及冷凍保存。 (三)、猪卵丘卵母細胞之收集 以 磷 酸 緩 衝 液(Dulbecco's Phosphate Buffer Saline; D-PBS, GIBCO 11500-030)或 生理食鹽水(Saline)配合保溫(25-39 )℃ 容器方 式，自地方屠宰場取得性成熟或接近性成熟 母 猪 之 卵 巢 ， 以 回 溫 蒸 餾 水 清 洗 後 置 於 D-PBS 中備用。使用 18G 之注射針吸取直徑 3-6 mm 濾泡之卵丘卵母細胞複合體(cumulus oocyte complexes; COCS)或將卵巢置於含緩 衝液之培養皿中，以解剖刀片逐一劃破及刮 擠之，將此懸浮液集中於15ml 離心管中靜置 10 分鐘使沉澱，並將 COCS 重新懸浮於 D-PBS 中備用。於立體顯微鏡下篩選卵丘細 胞包被完整之COCS 進行體外成熟培養。 作為供體內成熟卵母細胞用之雜交品 系母猪，係選用已屆性成熟者為佳。為獲得 較多卵母細胞進行試驗及提高受胚猪之懷孕 率，試驗用之供卵與受胚用新母猪，先後均 將其經律期媒(Regumate)、孕馬血清激性腺 素(pregnant mare's serum gonadotropin, PMSG)

及 人 類 絨 毛 膜 激 性 腺 素(human chorionic gonadotropin, hCG)處理，促使猪隻發情同期 化及發生超數排卵反應；一般而言，猪隻將 於hCG 注射後之翌日呈現穩定之發情反應。 估計此等供卵猪在hCG 注射後 36-42 小時期 間排卵；源自上述體內成熟之猪卵母細胞， 可直接將其外為包覆之卵丘細胞以玻尿酸酵 素配合機械方式移除之，經去除卵丘細胞及 核移除之卵母細胞可作為受核卵母細胞之來 源，或未經去核之卵母細胞直接進行孤雌激 活條件及猪胚體外培養條件之系統測試。截 至目前為止，以早期猪胚培養液體外培養144 小時後，可促使 50%體內成熟猪卵孤雌發育 至囊胚期。相同培養液培養孤雌激活之體外 成熟卵母細胞，亦可促使10% - 30%猪卵發 育至囊胚期。 (四)、猪卵丘卵母細胞複合體之體外成熟培養 以 NCSU-23 為基礎培養液，添加 10% 猪 濾 泡 液 、0.1mg/ ml 半 胱 氨 酸 (Sigma C-8152) ， 1 % 之 非 必 需 氨 基 酸 (Sigma, M-7145) ， 上 皮 細 胞 生 長 因 子 (epidermal growth factor; EGF, Sigma E-4127)及激性腺 素（2.5 g/ ml FSH 　 或LH 1ug/ml; Sigma F-2293），將成熟培養液作成 100 ul 液滴並 覆概礦物油後，使用前先置於含 5% CO2培 養箱中平衡2-10 小時。將 COCS 分成 20-25 個一組，將其分配於覆概礦物油之個別液滴 中，再置於38.5℃，相對濕度 100%，5% CO2 培養箱中培養 36-48 小時。上述成熟培養條 件，可促使卵母細胞成熟分裂至第二次減數 分裂中期，即排出第一極體，此成熟卵母細 胞可作為複製猪試驗之受核細胞質來源。 (五)、去卵丘細胞及離心處理: 玻 尿 酸 酵 素(Sigma H-2126) 溶 液 (300 I.U./ml in D-PBS) 配 合 適 當 口 徑 之 mouth pipett 將卵母細胞周圍之卵丘細胞移除。因 猪卵之脂質含量較高致較不易透光，需將去 卵丘細胞之卵母細胞離心(12000rpm 5-10 分鐘)後，使卵細胞質分層(stratified)，此處理 有利於含極體卵母細胞及卵母細胞品級之判 定。于立體顯微鏡篩選含極體卵母細胞。收 集含極體卵母細胞並置於NCSU23 胚培養液 中。 (六)、卵子去核: 將holding pipette(外徑 120-150 μm；內

徑 15-20 μm)及去核針於實驗操作之前預先 製備完成，並架設於顯微操作器上。備妥體 外 操 作 液 滴(D-PBS) 覆 以 礦 物 油 (Sigma M-3516)。將含極體卵母細胞置入顯微操作液 滴中(20 顆/批)，即可開始去核。控制每批卵 於30 分鐘內去核(吸除或壓擠法)完成。 (七)、篩選去核成功者: 準備去核物染色體檢查液(Hoechst33342 10 ug/ml), 於 35mm 培養皿上依序製作所需 之 微 滴(tiny drops)並蓋礦物油。以 mouth pipett 吸吐方式，將去核物與卵子粘連處分離, 並依序將去核物放入35mm 培養皿檢查液之 微滴中(1 to 1), 而卵子則置入另一 35mm 培 養皿相對位置液滴 (NCSU23)內。將去核物 浸入染色體檢查液中 37 ℃ 作用 10-15 分 鐘。於螢光顯微鏡下觀查去核情形並記錄 之。挑出相對位置中去核成功之卵子, 並集 中於NCSU23 液滴。 (八)、供核體細胞之處理: 選用繼代且長滿後2-5 天之體細胞(成纖 維母細胞)。以 PBS (Sigma 1000-3)清洗之, 並 吸除PBS。加入 0.25 % trypsin-EDTA 於 37 ℃ 作 用 5-10 min, 將 細 胞 消 化 後 ， 加 入 與 trypsin-EDTA 等體積之細胞培養液(DMEM, Sigma-5648 + 10% 胎牛血清)終止作用，將細 胞液移至離心管中以 173g, 離心 3 分鐘。去 上層液。以適量細胞培養液溶解細胞 pellet, 並作成細胞懸浮液。 (九)、供核細胞之注入: 將holding(外徑 120-150 μm；內徑 10-15 μm)及細胞注射針(外徑 20 μm；斜角 40 度) 於實驗之前製備完成。備妥體外操作液滴 (D-PBS)覆以礦物油(light oil)。打開加熱板於 37°, 並將去核卵(20 為限)與細胞懸浮液分別 移入不同液滴中將細胞注射針移入細胞懸浮 液滴吸取細胞 (直徑 10μm, ≦ 細胞膜平滑 者),每次可以裝載約 10 個細胞。於去核卵液 滴中將供核細胞逐一循原去核開口注入卵質 中。將完成細胞注入者，移入37℃培養箱中 培養2-3 小時後，即可進行激活處理。 (十)、電激活及化學激活處理: 以不同方式激活 (activation) 體外成熟猪卵 母細胞，建立良好之激活及其後續發育之培 養系統，用於改善體細胞核轉置 (somatic cell nuclear transfer, SCNT) 試驗之效率。自卵巢 之表面濾泡 (2~8mm) 收集卵丘卵母細胞複 合體 (cumulus-oocyte complexes, COCs )，培 養於 NCSU-23 成熟培養液中 42-44 h，成熟 之卵母細胞以單次電擊激活 (10 sec at 5 V AC followed by a 1 x 30 µsec pulse at 2.2 kV/cm DC)，之後再配合不同藥劑進行化學激 活 ， 包 括 以 10 µg/mL 細 胞 骨 架 鬆 弛 劑 (cytochalasin B, CB) 合併 10 µg/mL 蛋白質合 成抑制劑 (cycloheximide, CHX) 處理 4 小 時、單獨以 5 µM 鈣離子提昇劑 (calcium ionophore, A23187) 處理 5 分鐘、以 5 µM A23187 合併 2 mM 蛋白質轉磷酸酶抑制劑 (6-dimethylaminopurine, 6-DMAP) 處理 4 小 時或單獨以2 mM 6-DMAP 處理 4 小時，所 有激活卵均以NCSU23 清洗及體外培養之， 令其發育至胚移置之時期或于體外培養 6-8 天，記錄其發育至囊胚期之百分率，進一步 細胞核染色後評估其細胞數。以體內成熟猪 卵進行體細胞核移植試驗所產製之複製猪 胚，以電激活配合2 mM 6-DMAP 化學激活 處理 4 小時，經體外培養 12-16 小時後，將 其移置於發情同期化處理之受胚母猪輸卵 管，移製過程以外科手術為之。 (十一)、試驗動物之內泌素處理 1. 試驗小鼠之內泌素處理 本 研 究 中 做 為 供 胚(embryo donor) 及 受 胚 (embryo recepient)用之 ICR 母小鼠 (購自台 大動物中心)，均係選用 8 週齡以上已屆性成 熟者。全體試驗用小鼠係飼養於 14 L : 10 D 之計畫光照下，每天光照時間訂為 05:00 至 19:00；並隨時提供商用飼料 (#5001, PMI Feeds, Inc., USA) 與飲水，供其任食。供胚 母小鼠之超級排卵處理，係在擬進行基因注 射試驗前三日之上午 08:30，經由腹腔予以 注射 10 IU 之孕馬血清激性腺素(pregnant mare's serum gonadotropin, PMSG；中國化學 製藥 )，並於 PMSG 注射後 48 小時 再經

由腹腔注射 10 IU 之人類絨毛膜激性腺素

(human chorionic gonadotropin, hCG；中國化 學製藥)。此等供胚母小鼠均於 HCG 注射 後，立即被放入性成熟且具生育能力之雄性 小鼠籠內完成配種，再於翌日上午 08:30 檢 查並選取具有陰道栓者，自其輸卵管中沖洗 收取處於原核 (pronucleus) 階段之小鼠胚，

俾供進行基因注入之用。受胚用之母小鼠雖 未經內泌素進行超級排卵處理，但在進行供 胚母小鼠配種之同時，亦均使用業經輸精管 結紮後之雄性小鼠進行配種刺激，並於翌日 上午 08:30 檢查具有陰道栓者，以確認該小 鼠已處於偽懷孕狀態，可提供做為受胚母小 鼠之用。 2. 試驗猪之內泌素處理及原核胚收集 本研究作為供胚用之母猪，係使用核 心猪場北場提供之性成熟雜交品系女猪為 之，試驗猪隻均選用7 月齡以上已屆性成熟 者。全體試驗用之供胚用新母猪，均經如材 料方法 (三) 所述之超級排卵，發情同期化 處理及人工授精。估計此等供胚猪在 hCG 注射後56～62 小時，其受精卵將發育至原 核階段；因此選擇此一時段進行腹中線外科 手術，並經由沖洗輸卵管將猪胚悉數收集， 俾供進行基因注入之用。 (十二)、注射用基因之製備 本試驗供小鼠及猪胚顯微注射用之轉 殖基因為 beta-actin-EGFP ，基因載體源自 Dr. Okabe 實驗室，經限制酵素 Apal I 及 Bam HI 截切 3.43 kb 之轉殖基因片段，進一步以 二次banding 純化，純化後之基因以注射用 之TE 緩衝液稀釋到濃度 1 ng/μl ，即可分 裝及冷凍保存備用。 (十三)、小鼠及猪胚之基因注射與胚移置 小鼠胚因含有之脂肪球滴較少，可逕置 於顯微鏡下觀察確認雌原核及雄原核之位 置，俾進行基因注射之顯微操作。全體小鼠 胚 及 猪 胚 之 基 因 注 射 ， 均 於 分 光 干 擾 (differential interference contrast)倒立顯微鏡 (Diaphot TMD microscope, Nikon, Japan 200 x) 下進行，並以Narishige NT-8 (Japan)之顯微 操作器為之；其操作步驟係先於業經滅菌處 理過之凹槽玻片(depression microscope slide) 中心處置放一小滴(5～10μl)之 M2 緩衝液， 並 於 緩 衝 液 上 方 覆 蓋 重 級 礦 物 油(heavy mineral oil, Sigma, USA)，再將 10～20 個處

於原核階段之小鼠胚置入 M2 小滴中。供固 定胚用之平口固定針管(holding pipette)及供 注射基因用之微注射管(injection pipette)，其 製備方法悉依照Wu et al. (1995)之所述。顯 微注射之進行，係以平口固定針管先吸住原 核清晰之單細胞小鼠胚或猪胚，並調整焦距 至可清楚見及原核膜之程度，再移動預先吸 有轉殖基因(濃度為 1 ng/μl)之注射針，且將 其針尖焦距調整使之與核膜同焦，經由油壓 調整將注射針令其穿入小鼠胚或猪胚之透明 帶及原核內，同時將基因注入原核內，直至 原核體積明顯膨大時再迅速將注射針拔出。 基因之注入量，以令原核脹至約原來之 1.5 倍為原則，其注入之體積量約 2 pl。全體業 經DNA 注射後之小鼠胚，其仍保有緻密卵黃 質且外觀形態完整者，移置於自然發情並經 偽懷孕處理之受胚母小鼠兩側輸卵管中；每 側輸卵管被移置之胚數，平均為10～20 個。 猪胚之細胞質中因含有大量之脂肪球 滴，致未能逕自顯微鏡觀察下明確分辨其原 核之所處位置，遂均先於 25 ℃ 溫度下進 行高速(12,000 × g)離心 10 分鐘，令其顯露 原核後，始克方便基因之注入。基因之注入 量，仍以令原核脹至約原來之 1.5 倍為原 則，其注入之體積量約2 pl。全體業經 DNA 注射後之猪胚，移置於受胚猪兩側輸卵管 中；每側輸卵管被移置之胚數，平均為 10 ～20 個。 (十四)、基因轉殖動物之分析 源自移置業經注入beta-actin-EGFP 基 因之小鼠及猪胚所產生之幼仔，經剪取其 尾巴之組織抽取其中之基因組DNA，俾供 分析該外源基因在基因組DNA 中之嵌插情 形，分析方法將以聚合酵素連鎖反應及南 方吸漬法確認轉殖基因之嵌入，綠色螢光 蛋白質之表現，則採用長波長(365 nm)紫外 光偵測法配合黃色濾光片直接觀察記錄 之。 (十五)、間葉性幹細胞之誘導分化 間葉性幹細胞經體外培養至完全長滿 後，以脂肪細胞誘導生成之培養液(a-MEM with 20% FBS, 2mM L-glutamine, 10 ug/ml insulin, 1uM dexamethasone, 0.5mM IBMX and 100uM indomethacin) 進一步培養 6 及 9 天後，其間每隔三天換培養液一次，脂 肪細胞生成之確認係以 Oil Red-O 染色為 之。 五、結果與討論 (一)、綠色螢光小鼠之產製及性腺傳承效率 源自水母(jellyfish)之綠螢光蛋白質為一 種自發性螢光蛋白質，不需添加受質即可於 活體細胞中觀察，因此為極佳之報導基因。

本研究之目的係以胚原核基因顯微注射方 式，將 EGFP 基因引入不同品系之綠色螢光 小鼠之基因組中，並觀察其性腺傳承效率。 試 驗 使 用 4-6 週齡之 FVB 或 ICR 小鼠 (mouse) ，經超級排卵及配種後收集原核時 期受精卵，經基因注射後之原核胚，儘速移 置回同期化處理之代理孕母體內，待懷孕期 滿，以PCR 檢測小鼠是否嵌入外源基因並觀 察其螢光表現。經分別移置326 及 60 個 FVB 及ICR 鼠胚至 12 及 2 隻代理孕母體內，並產 下68 及 15 隻小鼠。以 PCR 分析確定有 9 (13 %) 及 4 (27 %) 隻攜帶 EGFP 基因，其中表 現綠色螢光者為6 (9 %, 2♂/ 4♀) 及 4 (27 %, 2♂/ 2♀) 隻。而表現 EGFP 之小鼠均具有性 腺遺傳能力，其子代有不同比例 (25-50 %) 可表現EGFP。由上述結果顯示，小鼠原核胚 經注射 EGFP 基因及胚移置後，可成功產下 不同品系之基因轉殖小鼠，並可表現綠色螢 光(圖 2A)且具穩定之性腺遺傳能力。相同之 技術及方法亦被應用於產製 EGFP 基因轉殖 猪胎兒，合計 109 個原核時期之猪胚，經 EGFP 基因注入及胚移置於四頭同期化處理 之受胚猪後，目前已成功產製二頭表現EGFP 之基因轉殖猪胎兒(圖 2B)， (二)、綠色螢光轉基因小鼠及猪骨髓間葉幹細 胞之建立及誘導分化潛能之探討 間葉幹細胞可分離自骨髓中擁有自我更 新及分化為數種細胞形式能力的幹細胞群 體，該等細胞具有易於分離培養與體外增生 快速等特性，逐年受研究者重視。本研究嘗 試以原核胚顯微注射技術產製綠色螢光轉基 因小鼠及猪胎兒，繼而分離其純系之骨髓間 葉幹細胞。以長波長(365 nm)紫外光偵測綠色 螢光蛋白質基因在小鼠個體中之表現。結果 顯示，各組織器官除脾臟、肺臟與骨組織外， 其他器官如：心臟、肌肉、腦、肝、睪丸、 腸道、腎、眼球及胰臟等均高度表達綠色螢 光。源自股骨與脛骨的骨髓細胞，在接種密 度2 X 106/cm2與72 小時的培養條件下，呈 現緊密的成纖維細胞群落。初代培養的骨髓 細胞包含高度異質性的細胞群體，包括：球 形、紡錘形與扁平狀等各類型細胞；惟隨著 培養時間之進展，紡錘形細胞群體乃呈對數 曲線方式逐漸取得生長優勢。此等細胞外徑 約80-90 μm，細胞質呈現許多顆粒狀分佈， 並具直徑約30 μm 之細胞核，屬典型的間葉 幹細胞型態。螢光顯微鏡檢查結果且證明此 等骨髓間葉幹細胞確有表達綠色螢光及經體 外誘導分化成脂肪細胞(圖 4AB)潛能之事 實。綜合上述，本研究自綠色螢光小鼠及猪 骨 髓 成 功 分 離 獲 得 純 系 間 葉 幹 細 胞( 圖 3AB)，可提供以猪為模式進行臨床前細胞治 療、基因治療或組織工程等極佳研究之用途。 (三)、不同型態之供核細胞與激活方式對猪胚 體細胞核轉置效率之影響 本研究之目的在於利用不同型態之供核 細 胞 (donor cell) 及激活方式 (activation) 進 行 猪 胚 之 體 細 胞 核 轉 置 (somatic cell nuclear transfer, SCNT)，係以觀察並改善重組 胚 (reconstructed embryos) 之激活及後續發 育效率。自卵巢之表面濾泡 (2~8mm) 收集 卵 丘 卵 母 細 胞 複 合 體 (cumulus-oocyte complexes, COCs)，培養於 NCSU-23 成熟培

養液中42-44 h，挑選排出第一極體之卵母細

胞進行去核 (enucleation)，再將單一之成纖 維 母 細 胞 (fibroblast) 或 間 葉 幹 細 胞 細 胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 注射至已去核 之卵母細胞內，重組胚經不同方式激活，包 括 (1) 單次電擊激活 (electroporation, EP, 10 sec at 5V AC followed by a 1 x 30 µsec pulse at 2.2 kV/cm DC) 後，配合細胞骨架鬆 弛劑 (cytochalasin B, CB, 10 µg/mL) 合併蛋 白質合成抑制劑 (cycloheximide, CHX, 10 µg/mL) 處理，或 (2) 於單次電擊後，以蛋 白 質 轉 磷 酸 酶 抑 制 劑 (6-dimethylaminopurine, 6-DMAP, 2mM) 處 理。經激活之重組胚於體外培養168 h，期間 觀察各處理組之分裂率、囊胚率及囊胚細胞 數。由結果得知，以相同方式激活後，成纖 維細胞作為供核細胞者囊胚率較高於以間葉 幹細胞者 （37 vs. 34%, 28 vs. 24%），而以 EP＋6-DMAP 激活處理之分裂率及囊胚率 （88-89%, 34-37%）均較高於以 EP＋CB＋ CHX 處理者（75-80%, 24-28%），其中以 MSC 為供核細胞進行核轉置，並以 EP＋CB ＋CHX 激活之處理組，其囊胚率（24%）顯 著低於以EP＋6-DMAP 激活處理者（34-37%, p<0.05）。結果顯示，由 MSC 所形成之重組 胚體外發育能力較低於由成纖維細胞形成 者，而電激後進一步以6-DMAP 進行化學激 活處理，證實可顯著改善重組胚之分裂及囊

胚率。 (四)、黃金組合優良種公猪之體細胞種源庫之 建立 目前已完成三家(願景金來、暉煌及福昌) 種猪場優良種猪完整體細胞之種原保存工 作，合計保存源自十五頭優良種猪之 298 管 初代耳成纖維母細胞(表 1)，包括杜洛克種公 猪五頭及種母猪五頭、藍瑞斯種公猪二頭及 種母猪三頭，其後裔之檢定合格率、性能指 數及體重達 110 公斤之日齡均為各該種猪場 之精英之選，其中七對屬黃金組合種猪，優 良種猪體細胞初代培養之成功率100%，顯示 該技術已成熟並可將技術。尚有順安(預計採 藍瑞斯種猪之黃金組合)及大統畜牧(預計採 約克夏種猪之黃金組合)二種猪場之採樣及 細胞培養工作仍進行中。 (五)、優良種猪體細胞複製猪之產製試驗 收集自性成熟雜交女猪之體內成熟卵母 細胞，經去核後做為受核卵質，進一步以優 良種公猪之耳成纖維母細胞當供核者，合計 移置 342 個核移植胚於三頭受胚母猪，其中 一頭懷孕，並以剖腹產方式成功獲得一頭複 製猪。另以迷你猪之骨髓幹細胞作為供核 者，總計胚移置 178 個核移植胚於三頭受胚 猪，然未獲得任何受胚猪之懷孕訊息。已成 功產製之優良種源複製猪，目前以發育達150 公斤體重，正進行採精(圖 1A)及繁衍後代之 試驗中，待其後代成功繁衍後即可與供核之 本尊進行優良種猪複製之表現性能比對。 依目前國際上已發表之複製猪資料顯 示，複製猪之產製效率約移置胚數之 0.5-0.9 %，單窩分娩頭數均低於五頭。本研究另進 行二批複製猪試驗之結果(表 2)顯示，以外科 手術方式回收 11 頭供卵猪之體內成熟卵母 細胞，合計收集287 個猪卵，其中 264 個含 極體之卵母細胞經壓擠方法去核，該去核卵 進一步以完整體細胞注入方式完成核移植， 細胞注入後之 224 個形態完整者被用於電激 活及化學激活，激活處理後之核移植胚培養 於含牛血清白蛋白之體外培養液 NCSU-23 中培養 12-16 小時，體外培養後之 223 核移 植胚被移置於同期化處理之二頭受胚母猪輸 卵管中，其中一頭懷孕並自然分娩九頭仔猪 (圖 1B)，創下產製效率及單窩分娩複製猪頭 數最高之世界記錄，亦將複製猪之產製效率 由雙基因轉殖複製之酷比猪 0.5 %(4/795)提 升至4 % (9/223)(表 2)之複製優良種公猪。 家畜之完整體細胞種源保存及體細胞核 移植技術之進展，未來將有助於優良種源及 瀕臨絕種動物之種源保存及復育之應用，透 過之前執行之核移植、激活條件及體細胞核 移植之再程序化過程的改善，可將動物種源 保存、復育之技術逐漸邁向例行化之境界， 未來在農業生物技術、生物醫藥及動物育種 等相關研究之應用極具潛力。 六、計畫成果自評 本研究之目的係應用已建立之基因轉殖 及複製動物之技術平台，建立猪胚體外培養 系統，並將核移植猪胚發育至囊胚之百分率 提高約10%。目前已成功產製表現綠色螢光 之基因轉殖小鼠及猪胎兒，並自其體組織及 骨髓採樣，個別分離體細胞及骨髓間葉幹細 胞，並進行表面抗原特性及體外誘導分化能 力試驗，確認其複能性(multipotent)。另以體 內及體外成熟猪卵母細胞進行體細胞之核移 植試驗，除探討及比較不同供核源及激活條 件對核移植猪胚之體外發育能力影響，並獲 得複製猪胚產製之較佳激活條件，以該條件 進行優良種猪複製之結果證實，合計獲得9 頭成年體細胞複製猪，複製猪之產製效率已 由0.5 % (4/795)提高至 4 % (9/223)，同窩可 分娩九頭複製猪，已接近可產業化程度。其 中一頭複製之優良種公猪，已進行採精分析 中。試驗期間持續進行優良種猪體細胞種源 保存之例行工作，目前已完成50 頭台灣優良 種猪之體細胞建立及保存工作。 本研究另成功產製表現綠色螢光之基因 轉殖小鼠及猪胎兒，並進一步自其骨髓分離 間葉性幹細胞，證實悉數表現綠色螢光，彼 等表現綠色螢光之幹細胞亦經體外誘導分化 試驗證實具複能性。綠色螢光之基因轉殖猪 之試驗持續進行中。 本計畫主旨係將九十一及九十二年度 執行期間所建立之基因轉殖及複製動物相 關技術平台，進一步應用於農業及生物醫學 之領域。應用於農業上之主要執行成果包 括：a. 優良種畜體細胞銀行之建立；b. 優 良種猪之保種及複製；c. 培育數十位國內基 因轉殖及複製相關技術之生殖科技人才。在 生物醫學上之應用包含：a. 表現綠色螢光基 因轉殖小鼠及猪之產製；b. 表現綠色螢光

之純系體細胞及源自骨髓幹細胞之建立。該 等細胞株在幹細胞之分化、組織工程及細胞 治療等生物醫學領域極具應用價值，若配合 綠色螢光之活體偵測儀器，將可加速幹細胞 分化能力研究之進展及促進幹細胞產業之 發展。 在體細胞種原保存、基因轉殖及複製 猪之技術平台發展已臻成熟，基因轉殖動物 之技術平台已技轉予台岳生技股份有限公 司，體細胞種原保存及核移植之相關技術轉 移，亦曾與生技公司洽談。 本年度共發表四篇期刊論文(其中二 篇 SCI)、六篇研討會論文、一篇技術報告、 申請四件專利及一項技術轉移。參考資料如 下： 期刊論文、專利申請及技轉 吳信志 鄭登貴 陳全木 林劭品 顏重河 楊 平政，泌乳期間穩定性表現人類凝血第 九因子及抗病蛋白基因於非人之多基因 轉 殖 哺 乳 動 物 【 台 灣 專 利 申 請 案 號 092132541】 杜清富 楊淇凱 林志生 顏重河 陳逸仲 吳 信志 孫玉苓 劉明薰 楊平政，水蛭素表 現載體及含該載體之轉型體【美國專利 申請案號10/053,641】

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表 1.優良種猪體細胞之建立 序號 耳號及性別 冷凍細 胞代數 冷凍細胞管數 登錄號 (種號) 種猪場 1 D611-1 ♂ P2 15 162841 願景金來 2 D974-12 ♀ P2 17 169477 願景金來 3 D1213-1 P2 24 166615 願景金來 4 D1127-11 P2 18 147528 願景金來 5 L1885-2 P2 27 162852 願景金來 6 L4001-11 P2 12 149848 願景金來 7 L413-13 P2 21 148991 願景金來 8 D1477-3 P2 18 157226 暉煌 9 D131-11 P2 27 167911 暉煌 10 L400-14 P2 20 159612 暉煌 11 L461-4 P2 18 159626 暉煌 12 D377-1 P2 23 160983 福昌 13 D1665-15 P2 14 171022 福昌 14 D1420-2 P2 23 150884 福昌 15 D720-15 P2 21 163364 福昌 Total 298

表2. 以體內成熟猪卵母細胞進行體細胞複製猪產製試驗之結果

Table 2. Trial of somatic cell nuclear transfer using in vivo matured porcine oocytes

Donor cell derived(供核細胞來源) Landrace boar (L277-10)

No. of oocyte recovered(回收卵母細胞數) 287

No. of enucleated oocytes(去核卵母細胞數) 264

No. of cell injected ooplasms(核移植卵數) 238

No. of activated cloned embryos(激活之複製胚數) 224 No. of cultured cloned embryos(培養之複製胚數) 224 No. of cloned embryos transferred(移置之複製胚數) 223

No. of recipients(受胚猪數) 2

A

B

圖1. A 圖為成年優良種公猪之耳成纖維母細胞所複製之成年公猪；

A

B

圖2.綠色螢光基因轉殖小鼠之表現，A 圖左：對照組小鼠；右：表現綠色螢光之基因轉殖小鼠；

A

B

圖3. A 圖由綠色螢光基因轉殖小鼠之骨髓所分離之純系間葉幹細胞株

A

B