2012 年第廿三屆國際生物奧林匹亞競賽－實驗試題(I)

一實驗試題 (I)

中華民國生物奧林匹亞競賽代表團

實駿一:細胞及分子生物學

總分: 100 分 總、操作時間: 90 分鐘 【實驗材料與儀器】 實驗材料與儷器 數量 單位 限制臨 REI

(Ndel)

(置於冰上) 4μl 戶目2耳 限制鵲 RE2

(EcoRI)

(置於冰上) 4μl 戶昌宜 DNA 待測樣品溶於限制酪緩衝液中(標示:

T)

(置於冰上)

10

μI

x 4

戶昌自 rniliQ 純水(標~:

W)

戶屆1l:; DNA 電泳槽和電源供應器 _組 微量分注器和分注器吸管尖 (pIO ，

plOO)

2

件 計時器 個 足標 DNA(作為樣品大小參考標準， LI 適用於 100bp 差異;

2

戶屆逆耳 L2 適用於 Ikbp 差異)(置於冰上) DNA 加注染料(藍色) 紅目2耳 預先已做好的電泳膠(己放在電泳緩衝液 running buffer 中) 片 大培養血(裝盛電泳膠片送去照相時使用) 個 標記有你的國家代號的卡片:招呼協助時使用 個 圓形浮水離心管座(標記有你的國家代號) 個 微量離心管 組

37

QC

7.K浴槽(使用指定的一個) 個 膠片照相裝置(使用指定的一個) 個

第一部分:以限制時切割 DNA 片段後推定基因切位圖(1 00 分)

【背景介紹】 基因的限制酪切位圖常被使用於分析 DNA 片段的順序和內容。一個 DNA 片段經限制酪 切割，並透過電泳分離後會顯示此 DNA 片段特有的模式。此技術在還殖基因、研究基 因功能和調控、尋找疾病相關基因和疾病診斷，及法醫分析上均為有用的工具。 A 部分:確認在一選殖質體上含有插入的人類 DNA 片段 (80 分)

科學教育月刊 第 386 期 中華民國 105 年 3 月

是否已被插人到一個選殖質體“ V" 內 (V 是環狀 DNA ，長度大約是 2570

base

pairs) 。 你要先設計排定一個DNA 的限制鷗切割實驗去分析樣品DNA

“

T"

，並且遵循一般限制 酪使用和電泳操作程序(詳述於後)去操作實驗。電泳完成後，電泳膠片將會有實驗室助 理協助染色，請對實驗結果進行分析並作出解釋。

【實驗步聽】

I.在答案卷上的衰格內排定你的 DNA 限制臨切割實驗，每個切割項目的體積為

20

1'/

' 你最多可以做 4 個切割項目。

盟矗-.!.:.! (20 分)

寫下你計畫的每個項目中各種成分的用量，如Tube 2 項下所示，所有的單位都是μl 。

2

依你的實驗設計來標示微量離心管，小心吸取正確定量的各項成分，用微量分注器 輕緩混合於各反應微量離心管內。要小心避免各項處理項目間的相互污染，每次吸 取時要用乾淨未用過的吸管尖。注意:使用 plO 分注器(白色頂)吸取 10μi 以下的 量。[注意.如果你要求額外的樣品，會被扣 20 分，請小心使用你的反應樣品] 3. 用述你離心機將 4 管反應混合液離心至離心管底部(離心時請平衡放置離心管於相 對位置)。準備反應混合液時及離心後，隨時將離心管放在冰上。

4

當所有反應混合液都準備好後，將離心管置於標記好的浮水離心管座，放在指定 37 QC 水浴中反應 20 分鐘(以計時器計時)。記得 20 分鐘後要取回你的實驗樣品。 5. 利用 20 分鍾的反應時間回答答案卷上的問題。

盟盛L主 (10 分)

對下列各項敘述，正確的請打勾 (.r) ， 錯誤的請打叉 (X) 。 a. 每一種限制鷗在特定的序列上切斷 DNA b. 每一種限制臨只在 DNA 的 3' 和 5' 末端'J.J

DNA.

c. 限制酪切 DNA 的作用在 4°C 時最有效 d 限制酪可以在室溫中保存數月不變質。 e. 不同於外切醋，限制臨只能作用在DNA 的內部序列。

盟壘L主 (10 分)

對下列有關電泳分離DNA 原理的敘述，正確的請打勾(.r) ， 錯誤的請打叉(X) 。 a. 整體而盲， DNA ):l段是帶正電荷。 b 較小的 DNA 片段在電流下通過膠片的速度較，快。 c 較小的 DNA 片段因為比較大的片段帶電荷為少，所以通過膠片較快。 d 膠體的相對密度影響分離DNA 所需的時間。 e. 依照注人膠片中 DNA 的量來決定電泳時使用的電壓。

6. 當 20 分鐘反應時間終了時，從水浴槽取回你的樣品。

7. 在反應樣品中加入 4μIDNA 加注染料(藍色) ，以分注器混合後，離心至離心管底部。 8. 使用 plOO 微量分注器(黃色頂) ，分別取的州的反應樣品(混合加注染料)及足標 DNA ，依照下列順序，自左至右注人膠片的樣品槽中。注意輕緩加人樣品，千萬不

要流出樣品槽外。

Marker L I

Tube I

Tube 2

Tube 3

Tube 4

Marker L2

9. 葦上電泳槽蓋，連接電源，以100volts 進行電泳 20 分鐘，請小心不要碰觸電極和電 源供應器。 10. 留意樣品是否向正極方向移動。如果你需要協助去確認樣品是否正確移動，請將你 的協助卡夾在實驗隔間的右側壁上。 II 進行電泳時，回答下列問題於答案卷上 盟軍~(20 分) 假設有一段線性的人類DNA(I kbp)' 用特定限制酪 RE3 切時，得到二個片段，一個 650bp 和一個 350bp 。若用特定限制酪 RE4 切時，得到一個 800bp J=i段和一個 200

bp

片段。若同時用 RE3 和 RE4 切時，得到三個片段，分別是650bp， 200bp 和 150 bp 。 按照下方的例圖模式，畫出一直線限制酪切位圖，並標出RE3 和 RE4 的切位及切出 的片段大小。

RE3

RE4

RE3

1.

2

2.5

3

4.5

(的 kbp) 12.20 分鐘電泳結束後，關閉電源，打開電泳槽上蓋。小心取出膠片(仍然留在膠片板 上) ，放在培養血上，帶至指定的膠片照相裝置處，質驗室助理會幫你將膠片照像。 13 取回你的膠何和照片，回到質驗隔間，使用你的協助卡通知監考人員將照片訂在答 案卷上。

盟且~(10 分)

你的實驗技術會由你的電泳結果來評定。 14. 依據你的電泳膠結果，回答下列問題於答案卷上。 固且1.豆 (5 分) 根據下方足標 DNA 分離模式的標準圖(以 basepair 顯示) ，估計你的電泳結果中各片 段的大小，你可以在你的膠片照片上的片段和足標 DNA 間畫線來幫助估計。 REI 和 RE2 分別切出幾個月段?估計片段的大小分別是多少?

科學教育月刊 第 386 期 中華民國 105 年 3 月

LI: 100 bp DNA Ladder

L2: I kb DNA Ladder

區且1.

7

(1 分)

估計 DNA 樣品 (T) 的大小是多少?

盟且主主 (1 分)

根據你的實驗結果， DNA 樣品 (T) 與空的載體 (vector)相比，是較大?較小?還是一 樣大?在正確的答案空格內打勾( v")。

盟崑--.L.旦 (1 分)

DNA 樣品 (T) 是否攜帶插入的 DNA 片段?若有攜帶打勾(

v")

，沒有則打叉 (X) 。 間顧1. 10(2 分) 沒有切的 DNA 質體在電泳時移動的比 RE2 切出的片段都要快，原因是甚麼?在正 確的答案空格內打勾(v")。 a. 因為沒有切的 DNA 被分解成為較小的片段。 b. 因為沒有切的 DNA 構形較緊密，所以在膠片上移動較快。

c. 因為 RE2 依然附在 DNA 片段上，所以被 RE2 切的片段移動較慢。

B 部分:請決定插入 DNA 片段的排列方向。 (20 分)

且且.2.J1. (20 分)

按照下方的例圖模式，在答案卷上畫出 DNA “T" 所有可能的限制酪切位圖，標出 REI 和 R凹的相關切位，以及各切位間的距離。

Ndel

1.

2 kbp

2.5 kbp

4.5 kbp

實驗二:微生物學&生化學

任務一:噬菌體:一個有效的媒介用於殺死細菌

【實驗材料與儷器】

feaRI

材料和器材 數量 單位

micropipette tips

10μl 微量滴管尖 至iZZ=Lr

micropipette tips

200μl 微量滴管尖 i'自~、

micropipette tips

1000μl 微量滴管尖 'i日z。a、

micropipette I -

10μl 微量滴管

_支

micropipette 2 -

20μl 微量滴管

_支

micropipette 20 -

200μl 微量滴管

_支

micropipette 100 -

1000μl 微量滴管

_支

微量離心管盒 個 比色管盒 個 微量離心管(放於燒杯內)

很多

合昌唱 以 LB 培養液培養的大腸桿菌原液(濃度 lxl07 個細胞/毫升) 管 LB 培養基(放在一個 50 毫升的離心管) 戶目耳 滅過菌的去離子水(放在微量離心管中) 管 溶解於去離子水的 ampicillin 抗生素原液(

I mg/ml)

管 溶於去離子水的噬菌體原液(濃度為I

08pfu/ml)

紅昌宜 比色管(放在一個燒杯內)

4

個 碼錶計時器 個 可漂浮的圓形微量離心管架(已經標示了你的國碼) 個

37

QC 的水浴槽(有指定一個讓你使用) _組 uv 至可見光的分光光度計(有指定一個讓你使用) 生且 大腸桿菌培養盤的照片(標:tT'A 到 H) 組

科學教育月刊 第 386 期 中華民國 105 年 3 月 A 部分 噬菌體和抗生素對殺死具抗藥性之大腸桿菌的影響 【背景知讀】 噬菌體( bacteriophage) 是一種可以感染細菌的病毒。某些噬菌體可以透過溶解細菌來 殺死細菌。噬菌體目前被認為是一種有效的媒介用於殺死致病的細菌。如此可以作為抗 生素之替代方案，來對抗對傳統抗生素具抗藥性之致病細菌。 你被要求設計一個簡單的實驗與適當的控制組，來檢驗噬菌體殺死具 ampicillin 抗藥性 之大腸桿菌的效率。請按照以下的說明與指引，來回答答案卷上的問題。

盟噩~(1 分)

為 7 稀釋大腸桿菌溶液從)

x

10

7

cells /

ml 至 2

x

10

5

cells / ml

' 你要稀釋多少倍?

盟盟」主 (1 分)

ampicillin 溶液，於 Iml 之大腸桿菌培養液中(最終濃度為2

X

10

5

cells / ml) ?

盟盟1.主(l分)

請問你必須使用多少體積之噬菌體原液(

10

8

piu /

ml)

， 來配製最終效價為l0

5

pfil /

ml

的噬菌體溶液，於 I ml 的大腸桿菌培養液中(最終濃度為2

x

I 0

5

_{cells / ml )}

_?

圓圈 1二至 (15 分)

按照上述所計算出之稀釋倍率，將你的實驗設計填人答案卷上之表格。 l 號管(

Tube

I

)的例子已經幫你填人表格中了。所有填人之數字的單位都以 μl 表示。執行你的

實驗設計來配製這四個管子。並且將這四個管子(放在有標示的圓形微量離心管 架) ，漂浮於 37 QC 的水浴槽中培養 40 分鐘(有提供碼錶)。將插上這四個管子的可 漂浮圓形微量離心管架交給水浴槽前的助理人員。 經過 40 分鐘培養之後，將樣品轉移至標示好 l 到 4 的比色管中。為 7 觀察殺死細菌 的效果，請測量 595 nm 的吸光值。帶著你的樣品至你附近的分光光度計，並且交給 助理人員。但是!你必須自己記錄每一個樣品的讀值。

盟且L豆

填人每一個樣品之 595 nm 的吸光值於答案卷上。 595 nm 之吸光值為 l 時的大腸桿

菌濃度為 I x

I 0

7

cells /

ml 。請計算每一個管子之大腸桿菌濃度分別為多少?

盟且L豆

下列問題的敘述正確者請打勾(./) ;錯誤者請打叉 (X) A. 由於對 ampicillin (抗生素)的抗藥性，細菌細胞壁可以避免抗生素輕易的穿透。 B 大腸桿菌之 ampicillin 抗藥性無法防止噬菌體吸附在細菌上的能力。

C 噬菌體似乎約有 20 至 30 分鐘之溶菌生活史，因此可以在短短的實驗中觀察到大 腸桿菌的溶解。

D. 37

QC 不是 ampicillin 抗生素殺死大腸桿菌的正確溫度。 E. 噬菌體與大腸桿菌競爭 LB 培養基內的養分，並且細菌會被溶解是因為養分不夠 了所造成的。 B 部分:噬菌體效價和風染的多樣性(19 分) 下表秀出大腸桿菌塗佈培養之照片的圖說.分別為未處理和經噬菌體廠染的照片。本實

驗所使用之大腸桿菌的起始細胞濃度為0.5

x 10

4

cells

/ 州，並用 0.5ml 的噬菌體來國染大腸

桿菌細胞。按照表中之系列稀釋的噬菌體培養液用在此廠染寶驗。(本實驗任務所提供之 照片標示為 A 至 H)

A

= 10-

5

dilution 稀釋

B

= 10-

5

dilution 稀釋

C=IO

-4

dilutionf希單單

D

= 10-

3

dilution 稀釋

E

= 10-

2

dilution 稀釋

F

= 10-

1

dilution 稀釋

G = neat phage

H = E. coli lawn

uninfected by phage

僅有噬菌體 無噬菌體廠染之大腸桿 菌的塗佈培養 固盛1.7 根據照片中所觀察到的溶菌斑，請計算當使用未稀釋的噬菌體溶液時，可以觀察到 的溶菌斑的數目為何? 且直1.星 (3 分) 為了估計噬菌體培養液的效價，照片A 至 H 的系列稀釋是被正確進行的。按照溶菌 斑的數目，勾選(/)能確認噬菌體效償之最好的稀釋倍率。

盟盟L旦

使用所提供的資訊和你上述的答案，得出-A.

所使用之噬菌體為多少 pfu/ml 0 (4 分)

B

問題 1.8 所得到之最佳稀釋濃度下之感染多樣性的數值為多少? (廠染多

樣性的定義為噬菌體濃度除以大腸桿菌濃度的比值) (4 分) (待續)

轉載自.中華民國生物奧林匹亞委員會網站 National

Biology

Olympi叫， Taiw訓， R.O.C