National Sun Yat-sen University Institutional Repository:Item 987654321/39754

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

影響蛋白質雙硫鍵異構化及配對之結構因子(1/2)

中 華 民 國 93 年 5 月 25 日

中文摘要

由 Ophiophagus hannah 蛇毒中純化 Oh-4 及 Oh-5 兩種 Long α-neurotoxin，經由胺基 酸分析顯示兩者具有完全相同的序列，但是兩者在 HPLC Column 具有不同的 retention

time，同時 CD 分析也顯示兩者二級結構明顯不同，以 Dithiothreitol 進行部份還原，顯示係 C27-C31 異構化而產生 Oh-5 及 Oh-4 兩種蛋白質。 部分還原後的產物進行 Refolding 形成 Oh-5，而 Oh-5 可在鹼性溶液中緩慢轉換成 Oh-4，在 GSH/GSSG 等硫基化合物存在，不需 變性試劑即可還原 Oh-5 及 Oh-4 之雙硫鍵 C27-C31，而含硫化合物與此兩個 Cysteine 接合， 將此接有 GSH 基團的蛋白質溶於鹼性溶液中則可 Refolding 形成 Oh-4 及 Oh-5，但以 Oh-5 為主要產物。 以合成 Peptide 分析此兩個 Cystein residues 的鍵結，顯示可能由於 Trp26 及

Phe30 的側鏈，影響 C27-C31 鍵結的穩定性，因而產生 Oh-4 和 Oh-5 兩種雙硫鍵的異構物。

關鍵詞：雙硫鍵異構化；結構再形成；部分還原。

英文摘要

Two α-neurotoxin isotoxins, Oh-4 and Oh-5, were isolated from Ophiophagus hannah venom. Although they shared the same amino acid sequence, but they had different retention time in the HPLC reversed column and different gross conformation as revealed by CD spectra. Selective reduction on the disulfide bridges between Cys27-Cys31 at the tip of their loopII structure resulted in the production of the partially reduced derivative eluted at the same positions. In alkali solution, the partially reduced derivative exclusively refolded as Oh-5 in the absence of GSH/GSSG.. Refolded Oh-4 and Oh-5 were noted by the addition of GSH/GSSG into refolding buffer. However, Oh-5 could be further but slowly converted into Oh-4. Synthesized peptides with Gly26 or Gly30, which substituted for Trp26 or Phe30, respectively, were exclusively formed intramolecular disulfide bonds. On the contrary, the peptide containing Trp26 and Phe30 formed the product with intermolecular disulfide bonds. This result suggests that the bulky side chains with Trp26 and Phe30 neighboring to Cys27 and Cys31 may affect the stability of disulfide linkages, and consequently cause a feasible pathway to form disulfide isomers.

前言

在蛇毒中有一群以 Three-loop structure 為結構特徵的蛋白質，目前已知其成員有

short α-neurotoxins(如 Cobrotoxin)、Long α-neurotoxins(如 α-bungarotoxin)、κ-Neurotoxins、 Neurotoxin homologs 、 Cardiotoxins 、 Cardiotoxin-like basic protein 、 Muscarinic toxins 、 Anticholinesterase toxin，這些蛋白質具有保留性的 Cysteine residues [1]，但其是否具有相同 的雙硫鍵被對並未完全探究。 在我們先前的研究工作中發現 Cobrotoxin 的碳端的兩對雙 硫鍵具有異構化的現象，經由雙硫鍵異構化可產生三種雙硫鍵異構物[2,3]，另一方面對 Long

neurotoxin 的 研 究 ， 則 顯 示 其 位 於 loop II 頂 端 的 單 一 對 雙 硫 鍵 可 能 有 Cis-Trans isomerization[4]。 在本研究計畫中我們以 Ophiophagus hannah (King cobra)蛇毒中所純化 的 Long α-neurotoxin Oh-4 及 Oh-5 作為研究標的，分析影響其 loop II 頂端的一對雙硫鍵產 生 Cis-Trans isomerization 的結構因子。

結果與討論

根據先前實驗方法[5]，我們由 Ophiophagus hannah 蛇毒中純化 Oh-4 及 Oh-5 兩種 長鏈神經毒，其胺基酸排列序次在之前研究工作顯示其胺基酸有些微差異，但在本計畫中 將其進行 Reduction and S-carboxymethylation 後以 V8 protease 水解後，發現其 peptide mapping 完全相同，進行胺基酸定序之後，也顯示 Oh-4 及 Oh-5 有完全相同的胺基酸序列， 但是 Oh-4 及 Oh-5 在 Reverse phase column 有不同的 retention time，同時其 CD 圖形也顯示 兩者具有不同的構型。 為了進一步了解其結構差異是否由於雙硫鍵異構化所致，因此先 以 Dithiothreitol (DTT)將其進行 Partial reduction，結果發現 Oh-4 及 Oh-5 均可以在 0.2 M Tris buffer (pH 8.6) 內含 0.1％EDTA 的緩衝液中，被兩倍莫爾數 DTT 部分還原，以 HPLC column 分析時發現兩者均在相同的位置被 eluted 出來(圖一)，並且以 CD 分析 Oh-4 及 Oh-5 partial reduction 的產物兩者圖譜完全相同，但與 Native Oh-4 及 Oh-5 則有明顯不同，進一步將此 partial reduction 的 Oh-4 及 Oh-5 與 DABIA 試劑反應後，將此產物再以 V8 protease 水解後， 於 345nm 分析具有吸收的分劃，經定序分析後其序列相當於 Oh-4 及 Oh-5 位於 14-39 的

支持 Oh-4 及 Oh-5 其結構不同係來自同一雙硫鍵異構化所產生。 如將雙硫鍵(C27-C31) 部分還原的蛋白質溶入 50 mM sodium bicarbonate (pH 9.6) 的緩衝液中，可見在 72 小時， 此部分還原產物完全轉換 Oh-5（圖一），如果將緩衝液中添加 2 mM GSH 及 0.5 mM GSSG， 則可見在 10 min 之內幾乎所有部份還原蛋白完全轉變成 Oh-5，但隨著時間延長另有兩種產 物產生 (I 及 II)，以質譜分析顯示 I 為蛋白質與 2 分子 GSH 結合的產物，而 II 則為蛋白質 結合有一分子 GSH。 如將 Oh-5 溶於 sodium bicarbonate 緩衝液中，可見在 20 天後，約 有 25％左右的 Oh-5 轉換成 Oh-4，但如果將 I 的樣品溶於同樣緩衝液中，在第一天的 Refolded 產物中即可見 Oh-4 及 Oh-5 同時產生，隨著時間延長，可見 Oh-5 的量約為 Oh-4 的三倍左 右，此一事實顯示 I 可同時轉換成 Oh-4 及 Oh-5，但其轉換成 Oh-5 的速率大於轉換成 Oh-4 的速率，上述結果顯示在蛇毒蛋白中部分 Oh-4 的產生可能來自 Oh-5 雙硫鍵異構化所致。 將 Oh-4 溶於 Sodium bicarbonate 緩衝液中，如外加 10 mM GSSG 可見 Oh-4 可轉 換成 Oh-5 和 I 兩種產物，同樣的加入 10 mM GSH 也可轉變成 Oh-5、I 及 II 三種產物，而 且在 2 hr 內幾乎所有 Oh-4 轉變成其他產物。 在 Oh-5 的溶液中加入 GSH 及 GSSG 也可 見到此現象，但是有趣的是在 GSH 及 GSSG 存在下，Oh-4 可轉變成 Oh-5，但是 Oh-5 僅 會轉變成 I 及 II 兩種產物，且不會轉變成 Oh-4，顯然 GSH 及 GSSG 可能經由還原 Oh-4 双 硫鍵產生双硫鍵的異構化，進而觀察到 Oh-5 的產物。

分析雙硫鍵 (C27-C31)其周圍的胺基酸，可見有兩個具有芳香族基團的胺基酸分別為 Trp26 及 Phe30，比對其他 Long neurotoxin 並不全具有此兩個胺基酸，此兩個胺基酸側鏈較 其他胺基酸為大，因此推斷是否這兩個胺基酸的側鏈影響了 C27-C31 的穩定性，使其易與 GSH 或 GSSG 反應，並且增加双硫鍵異構化的現象，為了證實這一可能性於是合成三段 Peptides: KTWCDVFCQTRGRVIE (Oh-1) KTGCDVFCGTRWRVIE (Oh-2) KTWCDVGCGTRFRVIE (Oh-3)

同樣於 Sodium bicarbonate，加入 GSH 或 GSSG，除可見有 GSH 結合 peptide 出現外，Oh-2 及 Oh-3 亦產生双硫鍵已結合的 Peptide，由質譜分析顯示均為分子內双硫鍵，唯一例外為 Oh-1 除了可見分子內双硫鍵形成的產物外，另有 Dimeric peptide 由兩 Peptide 形成分子

間的雙硫鍵，此一事實部分支持 Trp26 及 Phe30 大的側鏈確實影響双硫鍵穩定性的觀點， 可能因而使 C27-C31 的鍵結在 Oh-4 及 Oh-5 分子中處於較易於被還原的狀態。

在本計畫中，我們證實 Oh-4 及 Oh-5 為雙硫鍵的異構物，其雙硫鍵的鍵結可能因為

Trp 及 Phe 大的側鏈存在，而存在有 Cis-Trans isomerization 的現象，我們結果顯示 Oh-4 及 Oh-5 分子中 C27-C31 鍵結均處於不穩定之狀態，如果沒有 GSH/GSSG 存在下時，需較長 時間 Oh-5 才慢慢轉換成 Oh-4，但如果有 GSH/GSSG 等富含硫基化合物存在，則傾向還原 Oh-4 及 Oh-5 分子間的双硫鍵而產生結合有 GSH 基團的產物，此外此結合有 GSH 基團的 產物可再 Refoded 形成 Oh-4 及 Oh-5，但以形成 Oh-5 為主要路徑。

計畫成功自評 本計畫研究結果，目前正繕寫投稿中

參考文獻

1. Tsetlin, V.I. (1999) Eur. J. Biochem. 264, 281-286.

2. Chang, L.S., Lin, S.R. and Chang, C.C. (1998) Arch. Biochem. Biophys. 354, 1-8.

3. Chang, L.S., Lin, S.R., Chang, C.C. and Yang, C.C. (1998) Arch. Biochem. Biophys. 358, 164-170.

4. Lin, S.R., Chang, L.S. and Chang, C.C. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 104-108.

5. Chang, C.C., Huang, T.Y., Kuo, K.W., Chen, S.W., Huang, K.F. and Chiou, S.H. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 191, 214-223.

圖一、 Oh-4 及 Oh-5 之 C27-C31 双硫鍵還原的產物，在 Sodium bicarbonate buffer 及外加 GSH/GSSG 狀況下，其 refolding 產物的變化

(A) 及(B)為 partially reduced 的產物分別在 2 mM GSH/0.5 mM GSSG 存在或不存在下 refolding 的產物，以 HPLC Column 分析之結果。 (A), a, 10 min; b, 6 hr; c, 24 hr; (B) a, 6 hr; b, 24 hr; c, 72 hr. 插圖為 Oh-4 及 Oh-5 以 DTT 部分還原後可見其產物有相同的 retention time，插圖中箭號所指為 partially reduced 的產物。

圖二. Oh-5 及結合 GSH 基團的蛋白質隨著時間而變換其異構物組成的過程。

(A) Oh-5 及(B) I 分別溶於 Sodium bicarbonate 中，定時取樣以 HPLC column 分析 之。 （A）a, 0 day；b, 20 day；（B）a, 1 day；b, 4 day；c, 8 day。