綠膿桿菌與金黃葡萄球菌
吸附重金屬能力的探討
陳昱豪
鄭儀 林榆婕 李竹昀 洪巧芸 王依宸 蔡玉薰 房樹生*
國 立 臺 南 家 齊 女 子 高 級 中 學壹、研究動機
除 了 少 數 的 致 病 細 菌 ， 多 數 的 細 菌 對 人 類 是 無 害 甚 至 有 益 的 。 經 常 食 用 含 有 嗜 酸 性 乳 酸 桿 菌（Lactobacillus acidophilus） 或 比 菲 德 氏 益 菌 （Bifidus） 的 食 品 對 腸 道 的 蠕 動 及 消 化 相 當 有 幫 助 ， 另 外 還 有 許 多 抗 生 素 也 是 由 細 菌 分 泌 所 製 造 出 來 ； 細 菌 在 目 前 生 物 科 技 的 發 展 上 也 扮 演 了 舉 足 輕 重 的 角 色 。 細 菌 是 非 常 細 小 的 生 物 ， 但 在 環 境 中 卻 扮 演 非 常 重 要 的 角 色 ， 負 責 分 解 動 植 物 的 遺 體 及 廢 物 ， 也 有 根 瘤 菌 可 以 將 大 氣 中 的 氮 氣 轉 為 氮 化 物 ， 供 植 物 吸 收 利 用 。 除 了 前 面 提 到 對 環 境 的 影 響 ， 部 分 細 菌 在 環 境 中 還 具 備 了 一 種 特 異 功 能 ， 那 就 是 吸 附 重 金 屬 。 近 年 來 有 相 當 多 的 文 獻 指 出 部 分 細 菌 確 實 具 有 一 定 程 度 的 吸 附 重 金 屬 的 能 力[1] ， 如 光 合 細 菌 (Rhodobacter capsulatus)[2] 、 球 形 芽 孢 桿 菌 (Bacillus sphaericus)[3] 、 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa)[4]等。 隨 著 工 業 革 命 的 開 始 ， 雖 然 便 利 了 人 們 的 生 活 ， 但 其 引 發 的 污 染 卻 漸 漸 破 壞 地 球 的 環 境 ， 尤 其 是 重 金 屬 的 污 染 更 是 日 益 *為本 文 通 訊 作 者 惡 化 。 重 金 屬 會 透 過 飲 食 、 呼 吸 或 是 直 接 接 觸 的 路 徑 進 入 人 體 ， 但 是 重 金 屬 不 像 其 他 的 毒 素 可 以 在 肝 臟 分 解 代 謝 ， 排 出 體 外 。 相 對 的 ， 它 極 易 積 存 在 大 腦 、 腎 臟 等 器 官 ， 漸 進 式 的 損 壞 身 體 正 常 功 能 。 重金 屬 進 入人 體 後 ， 大部 分 會 與 我們 體 內 的 蛋 白 質 、 核 酸 結 合 。 蛋 白 質 在 生 物 體 內 的 作 用 主 要 是 進 行 酵 素 反 應 ， 當 這 些 酵 素 和 重 金 屬 結 合 時 ， 就 會 導 致 酵 素 的 活 性 消 失 或 減 弱 。 另 一 方 面 ， 當 重 金 屬 和 核 酸 結 合 ， 便 會 導 致 核 酸 的 結 構 發 生 變 化 ， 使 得 基 因 突 變 ， 影 響 細 胞 遺 傳 ， 產 生 畸 胎 或 癌 症[5]。 如 何 減 少 環 境 中 重 金 屬 的 污 染 是 目 前 世 界 各 國 政 府 及 環 保 團 體 努 力 的 課 題 ， 而 部 分 細 菌 的 吸 附 重 金 屬 能 力 更 是 漸 漸 被 重 視 而 加 以 研 究 。 在 我 們 的 研 究 裡 ， 我 們 希 望 可 以 藉 由 觀 察 重 金 屬 濃 度 對 常 見 細 菌 生 長 的 影 響 ， 進 而 瞭 解 細 菌 吸 附 重 金 屬 的 能 力 。貳、文獻探討
近 年 來 重 金 屬 污 染 是 最 主 要 的 環 境 污 染 之 一 ， 農 業 及 工 業 的 污 染 是 其 主 要 肇 因 ， 就 像 一 場 戰 爭 一 樣 ， 重 金 屬 污 染 對 環境 、 公 共 衛 生 以 及 經 濟 造 成 全 面 性 的 重 大 影 響 。 重 金 屬 污 染 中 ， 常 見 的 有 錳 、 銅 、 鋅 、 鐵 、 鎘 、 鉛 、 鋁 、 鎳 等 ， 而 這 些 重 金 屬 污 染 又 常 是 不 可 分 解 且 永 續 存 在 的 ， 目 前 常 用 於 分 離 液 體 中 重 金 屬 的 方 式 有 ： 化 學 沈 澱 法、化 學 氧 化 還 原 法、離 子 交 換 法、 過 濾 法 、 電 子 化 學 處 理 、 反 轉 滲 透 等 方 式 [1]，但 多 流 於 昂貴 或 不 夠 有效 率，所 以環 境 工 程 學 家 以 及 學 者 目 前 仍 致 力 於 低 成 本 且 有 效 移 除 重 金 屬 的 方 式 。 生 物 材 料 在 重 金 屬 吸 附 的 應 用 在 近 幾 年 被 大 幅 研 究 ， 生 物 材 料 具 有 速 度 快 、 吸 附 能 力 佳 、 低 成 本 及 材 料 易 取 得 等 優 點 ， 但 仍 具 有 易 飽 和 等 缺 點 。 目 前 常 用 的 生 物 材 料 包 括 藻 類 、 植 物 及 微 生 物 ， 而 其 中 又 以 細 菌 的 效 益 最 大 ， 因 為 細 菌 體 積 小 ， 總 和 面 積 大 ， 相 對 的 吸 收 能 力 也 較 其 他 生 物 材 料 來 的 高 。 已 經 陸 續 有 文 獻 指 出 ， 螢 光 假 單 胞 菌 （ Pseudomonas fluorescens ） 對 釷 ， 土 壤 微 生 物 Streptomyces noursei 對 鉻 、銅 、 鉛 、 鋅、 鎘 ， 以 及 芽 孢 桿 菌 屬 中 的 Bacillus firmus 對 鉛 、 銅 、 鋅 等 重 金 屬 具 有 吸 收 能 力[1]。 細 菌 能 夠 吸 附 重 金 屬 取 決 於 構 造 上 的 特 性 ， 細 菌 具 有 細 胞 壁 ， 而 細 菌 的 細 胞 壁 含 有 豐 富 的 多 醣 類 及 醣 蛋 白 ， 如 葡 聚 糖 （glucans）、 基 丁 質 （ chitin）、 甘 露 聚 醣 （ mannans ） 以 及 磷 酸 甘 露 聚 醣 （phospho-mannans）， 而 這 些 帶 正 電 聚 合 物 扮 演 了 吸 附 重 金 屬 的 重 要 角 色 ， 可 以 藉 由 靜 電 引 力 與 許 多 金 屬 離 子 （ 如 ：Cu2+、 Ni2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+）相 結 合，進 一 步 降 低 液 體 中 重 金 屬 的 含 量[6]。 在 2004 年 八 月的 報 導 中 ，有 一 則 這 麼 提 到：「 大 甲 鎮 永 信 段 芋 田 受 污 染，台 中 縣 環 保 局 經 從55 丘 段，取 樣品 化 驗 後，有 6 區 確 實受 到 鎳污 染。」[7] 國際 癌 症 研究 中 心(IARC) 致 癌 性 分 類 中 ︰ 金 屬 鎳 是 屬 於 2B，可 能 會 致癌；而 鎳 化合 物 是 屬 於第 一 類，有 致 癌 性。美 國 EPA 也 認 定 鎳 的粉 塵 與Ni3S2 具 有致 癌 性。當 不 幸 誤 飲 鎳污 染 的 水 ， 或 透 析 用 水 被 污 染 引 起 二 價 鎳 中 毒 ， 其 症 狀 為 噁 心 、 嘔 吐 、 頭 痛 、 心 悸 、 虛 弱 、 呼 吸 急 促 、 咳 嗽 等 會 持 續 1-2 天 。 慢 性 中 毒 則 會 呈 現 過 敏 性 皮 膚 炎 、 慢 性 呼 吸 道 疾 病 、 免 疫 機 能 異 常 等 症 狀 ， 甚 至 癌 症 都 有 可 能 發 生[8]。 錳 污 染 在 台 灣 較 少 見 到 ， 但 在 大 陸 地 區 卻 是 嚴 重 的 污 染 項 目 之 一 ， 而 錳 污 染 主 要 來 自 鋼 鐵 製 造 、 焊 接 、 採 礦 及 提 煉 過 程 中 所 產 生 的 粉 塵 。 另 外 有 機 錳 也 用 作 有 機 鉛 的 代 用 品 ， 作 為 燃 料 抗 震 劑 。 錳 中 毒 是 一 種 嚴 重 的 神 經 中 毒 ， 主 要 病 變 在 於 大 腦 基 底 核 ， 尤 其 蒼 白 球 的 神 經 細 胞 變 性 為 其 共 同 點 ， 將 造 成 身 體 行 動 上 的 障 礙 ， 出 現 類 似 類 似 巴 金 森 症 的 症 狀[9]。 由 於 鎳 、 錳 的 污 染 其 研 究 文 獻 較 少 ， 但 鎳 污 染 與 錳 污 染 卻 也 是 造 成 環 境 嚴 重 污 染 的 元 兇 之 二 ， 所 以 在 我 們 的 研 究 中 ， 我 們 希 望 從 日 常 生 活 常 發 現 的 細 菌 中 ， 尋 找 可 能 具 有 錳 、 鎳 重 金 屬 吸 附 能 力 的 細 菌 ， 於 是 我 們 從 目 前 仍 未 被 報 導 的 大 腸 桿 菌 （Escherichia coli ）、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus ） 以 及 綠 膿 桿 菌
（Pseudomonas aeruginosa）著 手，希 望能 利 用 細 菌 與 金 屬 溶 液 共 培 養 後 ， 以 原 子 吸 收 光 譜 儀 （AAs） 測 量 其 共 培 養 菌 液 的 上 清 液 中 重 金 屬 的 濃 度 變 化 ， 由 其 中 發 現 具 有 重 金 屬 吸 附 能 力 菌 種 。
參、研究目的
一 、 以 分 光 光 度 計 求 得 金 黃 色 葡 萄 球 菌 以 及 綠 膿 桿 菌 、 大 腸 桿 菌 菌 液 O.D. 值 與 實 際 菌 數 之 關 係 。 二 、 不 同 濃 度 的 硫 酸 鎳 以 及 硫 酸 錳 溶 液 對 三 種 細 菌 生 長 的 影 響 。三 、 以AAs (atomic absorption spectrometer) 確 認 三 種 細 菌 吸 附 金 屬 的 能 力 。
肆、研究設備與材料
( 一 ) 生 物 材 料 ： 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 、 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa)。 (二 ) 化 學 藥 品 ： 硫 酸 鎳 、 硫 酸 鈉 、 硫 酸錳(NiSO4、Na2SO4、MnSO4)、酒 精 。 (三 ) 恆 溫 器 材 ：恆溫 培 養 箱。 (四 ) 儀 器 設 備：電 子 天 秤、加 熱 攪 拌 器 、 滅 菌 鍋、無 菌 操 作 台、筆 記 型 電 腦 、 恆 溫 震 盪 培 養 箱 、 離 心 機 （Sigma 6K15 成 大生 理 所懷 孕 生 理 實驗 室 提 供 ）。 (五 ) 其 他 器 材 ： 光 學 目 鏡 、 微 量 吸 取 器 (Pipettes，p20、p200、p1000)、微 量 吸 取 尖(Tips)、 試 管 、 有 蓋 試 管 、 三 角 錐 瓶 、 量 筒 、 燒 杯 、 種 菌 環 、 刮 勺 、 玻 璃 漏 斗 、 離 心 試 管 、 玻 棒 、 懸 滴 玻 片 、 紙 巾 、 拭 鏡 紙 、 石 蠟 膜 (Parafilm)、濾 紙、鋁 箔 紙、蒸 餾 水 、 微 離 心 管 (Eppendorf)。 (六 ) 各 種 溶 液 ： 1. 細 菌 培 養 液 [LB (Luria-Bertani) medium, NB (nutrient broth) medium]
2. Luria - Bertani agar plate ( LB agar plate )：2.5% (w/v) LB powder、 2%(w/v) agar、pH 7.0。
3. Nutrient broth (NB agar plate)： 0.8% (w/v)、 1.5%(w/v)agar、 pH 7.0。 4. 1M 金 屬 溶 液（ 硫 酸 鎳 、硫 酸 鋅 、 硫 酸 銅 、 硫 酸 鈉 、 硫 酸 錳 ）
伍、研究過程與方法
一、各菌種的培養
1. 取 一 個 培 養 皿 （ LB agar plate for
E.coli，NB agar plate for S. aureus and P.
aeruginosa），底 部 標 明 日 期、菌 株 名 稱 及 組 別 。 2. 將 接種 環 在 酒精 燈 火 焰 下燒 紅，並 將接 種 環 在 培 養 基 空 白 處 輕 戳 數 次 以 冷 卻 ， 再 挑 取 單 一 菌 落 。 3. 打 開培 養 皿，將 沾 有 菌 落之 接 種 環 以三 區 畫 線 的 方 式 分 出 單 一 菌 落 。 4. 將 培 養 皿 倒 置 ， 於 37℃ 恆 溫 培 養 箱 中 培 養24 小 時 。 5. 取 一 罐 裝 有 滅 菌 過 200ml LB 培 養 液 （NB for S. aureus and P. aeruginosa）
的錐形瓶，標明菌種名稱、組別及日期。 6. 將 接種 環 在 酒精 燈 火 焰 下燒 紅，待 冷卻 後 自 agar plate 上挑 取 單 一菌 落 。 7. 將 沾有 菌 落 的種 菌 環 深 入錐 形 瓶 中，輕 敲 瓶 壁 使 菌 落 掉 下 。 8. 將 錐形 瓶 口 以酒 精 燈 燒 一下，蓋 上 鋁箔 紙 。 9. 將 錐形 瓶 放 入恆 溫 培 養 箱中 搖 晃 24~48 小 時 。
二、生長趨勢與菌落的計數
1. 待 恆 溫 培 養 箱 中 的 菌 液 培 養 24~48 小 時 後 ， 取 出 菌 液 測 量 其 吸 光 值 。 2. 將 吸光 值 達 到 1.07 之 大腸 桿 菌 、 吸光 值 達 到 0.8 之 金黃 色 葡 萄 球菌、吸 光 值 達 到 0.72 之 綠 濃桿 菌 菌 液 取出 使 用 。 3. 將 菌液 以 LB 或 NB 培 養液 依 下 列比 例 稀 釋：（ 原 液 比 medium）1：1、2：1、 4：1、10：1，並 分別 測 量 其吸 光 值（ 三 重 複 ）。 4. 將 原 菌 液 與 稀 釋 過 的 菌 液 以 連 續 稀 釋 （series dilution） 稀 釋 107~108倍 ， 取 出100μl 稀釋後的菌液塗盤於培養皿中 （ 三 重 複 ）。 5. 將 塗 盤 之 培 養 皿 置 入 恆 溫 培 養 箱 中 培 養 24 小 時 。 6. 取 出培 養 皿 計算 其 上 之 菌落 數 目，並 與 其 相 對 吸 光 值 作 圖 。三、各菌種與各金屬溶液共培養
1. 取 出 培 養 後 的 菌 液 ， 將 吸 光 值 稀 釋 至 0.05。 2. 將 吸光 值 0.05 之菌 液 分 別取 50ml 分 裝 至 五 瓶 錐 形 瓶 中 ， 並 分 別 加 入 0μM， 100μM，150μM，200μM，250μM，或 750μM ， 1000μM ， 1250μM ， 1500μM 的 金 屬 溶 液 。 3. 加 入 重 金 屬 吸 附 液 後 ， 置 入 37℃ 恆 溫 培 養 箱 中 培 養，並 分 別 於0、5、8 小 時 後 測 量 其 吸 光 值 。 4. 將 各 時 間 點 所 測 得 之 吸 光 值 及 其 相 對 之 重 金 屬 吸 附 液 濃 度 繪 圖 。四、金屬再吸收之測試驗證
1. 取 出 1.5ml 含 金 屬 之 菌 液，並 裝 入 微離 心 管 中 。 2. 以 10000 rpm 的 轉 速 離 心 3 分 鐘 。 3. 取 出 上 清 液，裝 入 乾 淨 之 微 離 心 管 中 。 4. 以 AAs(atomic absorption spectrometer)測 量 各 實 驗 組 別 菌 液 中 的 金 屬 濃 度 。
陸、實驗結果
一 、 以 分 光 光 度 計 求 得 不 同 菌 液
O.D.值與實際菌數之關係：
為 了 後 續 的 實 驗 操 作 方 便 ， 我 們 希 望 利 用 分 光 光 度 計 測 量 菌 液 的 吸 光 值 來 表 示 細 菌 的 數 量 多 寡 ， 所 以 我 們 首 先 必 須 先 證 實 菌 液 的 吸 光 值 與 實 際 的 菌 數 有 線 性 關 係 。 而 從 圖 一 中 可 以 發 現 ， 我 們 所 使 用 的 三 種 細 菌 其 菌 液 吸 光 值 與 實 際 菌 數 具 有 高 度 的 正 相 關 性 ， 其 中 又 以 大 腸 桿 菌 的 線 性 關 係 最 高 ， 其 相 關 係 數 達 到 0.9679，即 便 是 綠 膿 桿 菌 也 有 將 近 0.8 的 正 相關 性 ，代表 我 們 所 使 用 的 三 種 細 菌 ， 在 我 們 所 測 得 的 吸 光 值 範 圍 內 確 實 可 以 菌 液 的 吸 光 值 來 代 表 實 際 係 菌 數 量 的 多 寡 。 除 了 得 知 此 三 種 細 菌 菌 液 與 實 際 菌 數 的 高 度 相 關 性 外 ， 我 們 還 觀 察 到 ， 相 較 於 大 腸 桿 菌 和 金 黃 色 葡 萄 球 菌 ， 綠 膿 桿 菌 在 相 同 吸 光 值 所 代 表 的 實 際 菌 數 要 高 出 十 倍 ， 此 現 象 可 提 供 後 續 實 驗 做 為 調 整 的 參 考 。
二 、 不 同 濃 度 及 種 類 重 金 屬 對 細 菌
生長的影響：
從 前 面 的 實 驗 已 知 菌 液 的 吸 光 值 在 我 們 所 測 得 的 吸 光 值 範 圍 內 可 代 表 菌 數 。 為 了 進 一 步 證 實 細 菌 吸 附 重 金 屬 的 能 力 ， 所 以 我 們 先 將 三 種 不 同 的 細 菌 與 硫 酸 鎳 與 硫 酸 錳 進 行 共 培 養 ， 在 不 同 的 時 間 點 觀 察 細 菌 生 長 的 狀 況 是 否 受 到 重 金 屬 濃 度 與 種 類 的 影 響 。 從 圖 二(a)中 我 們可 以 觀 察 到，在 硫 酸 鎳 濃 度 低 於 150μM 時，對金黃色葡萄球菌 的 生 長 沒 有 顯 著 影 響 。 但 隨 著 濃 度 提 升 ， 不 論 是 五 小 時 或 八 小 時 ， 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 生 長 隨 著 硫 酸 鎳 濃 度 提 升 到 250μM 而 受 到 抑 制 。 在 五 小 時 的 時 間 點 上 ， 相 較 於 S . a u r e u s 0 .0 0 0 .2 5 0 .5 0 0 .7 5 1 .0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 r2 0.8905 O .D N u mb er (1 0 7) P . a e r u g in o s a 0 .0 0 0 .2 5 0 .5 0 0 .7 5 1 .0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 r2 0.7659 O .D Nu m b er ( 10 8 ) E . c o li. 0 .0 0 0 .2 5 0 .5 0 0 .7 5 1 .0 0 1 .2 5 0 1 0 2 0 3 0 4 0 r2 0.9679 O .D Num b e r (1 0 7 ) (a) (b) (c) 圖 一 、O.D 值 與 實 際 菌 數 的 比較 。 (a)為 金 黃 色 葡 萄球 菌 ， (b)為綠 膿 桿 菌 ， (c)為 大 腸 桿 菌 。 大 腸 桿 菌 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 實 際 菌 數 為 數 值 的 107倍 ， 而 綠 膿 桿 菌 為 數 值 的108倍 。 誤 差 範 圍 為 平 均 值±SEM。控 制 組 ， 僅 有 200μM 及 250μM 硫酸鎳對 金 黃 色 葡 萄 球 菌 生 長 有 顯 著 性 的 抑 制 ； 但 在 八 小 時 的 時 間 點 ，100、150、200 以 及 250μM 硫 酸 鎳 都 對 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 生 長 產 生 抑 制 的 效 果 。 而 對 綠 膿 桿 菌 而 言 ， 五 小 時 的 時 間 點 上 ， 隨 著 硫 酸 鎳 濃 度 的 提 升 ， 綠 膿 桿 菌 的 生 長 顯 著 受 到 抑 制 ， 此 抑 制 效 果 在 150μM、200μM、250μM 可見，並在 250μM 最 為 顯 著 ； 但 隨 著 時 間 來 到 八 小 時 ， 可 以 明 顯 看 出，除 了 250μM 濃度硫酸鎳的共培 養 下 ， 綠 膿 桿 菌 幾 乎 停 止 生 長 外 ， 其 餘 濃 度 相 較 於 控 制 組 都 沒 有 顯 著 地 抑 制 綠 膿 桿 菌 的 生 長（ 圖 二 b）。此 現 象 表 示 在200μM 以 內 的 硫 酸 鎳 可 能 為 綠 膿 桿 菌 可 承 受 的 濃 度 範 圍 ， 並 且 綠 膿 桿 菌 可 能 在 五 小 時 及 八 小 時 這 三 小 時 的 間 隔 中 ， 具 備 某 些 能 力 使 其 受 到 硫 酸 鎳 抑 制 的 現 象 抒 解 ， 使 生 長 趨 於 正 常 。 另 外，在 硫 酸 鎳 濃 度 低 於 750μM 時， 對 大 腸 桿 菌 的 生 長 沒 有 顯 著 影 響 （ 圖 二 c）。 但 隨 著 濃 度 提 升 ， 不 論 是 五 小 時 或 八 小 時 ， 大 腸 桿 菌 的 生 長 隨 著 硫 酸 鎳 濃 度 提 升 到 750μM 以 上 而 開 始 受 到 抑 制 ， 在 1250μM 及 1500μM 濃度的硫酸鎳共培養 下 ， 大 腸 桿 菌 生 長 更 是 幾 乎 完 全 被 抑 制 。 E.coli + NiSO4 0.00 750.00 1000.00 1250.00 1500.00 0.0 0.5 1.0 1.5 5hr 8hr * * * concentration (μM) O. D . * * * 圖 二 、 不 同 硫 酸 鎳 濃 度 在 五 小 時 與 八 小 時 對 金 黃 色 葡 萄 球 菌(a)、 綠 膿 桿 菌 (b)與 大 腸 桿 菌 (c)菌 數 的 影 響 。 *p<0.05 分 別 相 較於 控 制 組 （ 0μM），以 one-way ANOVA 統計。 (a) (b) (c) S.aureus + MnSO4 0.0 100.0 150.0 200.0 250.0 0.0 0.5 1.0 1.5 * * * * * * * concentration (μM) O. D. P.aeruginosa + MnSO4 0.0 100.0 150.0 200.0 250.0 0.0 0.5 1.0 1.5 5hr 8hr * * * * * * * * concentration (μM) O. D.
我 們 另 外 使 用 了 硫 酸 鈉 來 作 為 控 制 組 ， 與 大 腸 桿 菌 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 以 及 綠 膿 桿 菌 共 培 養，從 圖 四(a)、(b)及(c)可 以看 出 硫 酸 鈉 對 細 菌 的 生 長 沒 有 影 響 ， 也 證 明 硫 酸 鎳 及 硫 酸 錳 對 細 菌 所 造 成 的 不 同 影 響 確 實 是 來 自 於 金 屬 濃 度 的 改 變 ， 而 非 操 作 誤 差 及 人 為 因 素 。
三、金屬再吸收之測試驗證：
為 了 進 一 步 探 討 我 們 從 共 培 養 中 發 現 的 現 象 ， 我 們 將 特 定 濃 度 重 金 屬 共 培 養 的 菌 液 經 過 離 心 後，取 出 上 清 液，以 AAS （atomic absorption spectrometer） 測 量 其 吸 光 值 ， 並 對 照 標 準 曲 線 得 到 絕 對 濃 度 ， 以 確 認 此 一 生 長 曲 線 改 變 的 現 象 是 否 與 細 菌 的 重 金 屬 吸 附 功 能 有 關 。 從 表 一 中 我 們 發 現 ， 大 腸 桿 菌 不 管 是 對 於 鎳 離 子 或 是 錳 離 子 ， 都 沒 有 顯 著 性 的 影 響 ， 表 示 大 腸 桿 菌 對 於 鎳 離 子 與 錳 離 子 在 我 們 使 用 的 濃 度 及 時 間 點 並 沒 有 呈 現 金 屬 吸 收 的 功 能 。 而 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 鎳 離 子 可 能 具 備 一 定 的 吸 收 程 度 ， 於 五 小 時 即 可 達 到 22%左 右的 吸 收率 ， 而 八 小時 可 達 到 25% 左 右 。 對 照 鎳 離 子 濃 度 對 於 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 生 長 的 影 響 ， 我 們 發 現 當 硫 酸 鎳 濃 度 達 200μM 時，金黃色葡萄球菌的生長於五 小 時 後 減 緩 ， 而 這 可 能 也 同 時 反 應 在 吸 收 率 上 ， 其 吸 收 率 在 五 小 時 及 八 小 時 的 差 異，並 沒 有 如 150μM 硫酸鎳的增加幅度。 S.aureus + Na2SO4 0.0 100.0 150.0 200.0 250.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 concentration (μM) O. D . P.aeruginosa + Na2SO4 0.0 100.0 150.0 200.0 250.0 0.0 0.5 1.0 1.5 5hr 8hr concentration (μM) O. D . E.coli + Na2SO4 0.00 750.00 1000.00 1250.00 1500.00 0.0 0.5 1.0 1.5 5hr 8hr concentration (μM) O. D. 圖 四、不 同 硫 酸 鈉 濃 度 在 五 小 時 與 八 小 時 對 金 黃 葡 萄 球 菌(a)、綠 膿 桿 菌 (b)以 及 大腸 桿 菌(c)菌 數 的 影 響 。 (a) (b) (c)此 外 ， 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 錳 離 子 可 能 有 較 佳 的 吸 收 效 果 ， 在 硫 酸 錳 濃 度 200μM 的 共 培 養 下 ， 其 五 小 時 即 可 達 34.759%的 吸 收 率 ， 而 八 小 時 其 吸 收 率 更 可 達 到 81.283%， 表示 金 黃色 葡 萄 球 菌對 於 錳 離 子 確 實 有 顯 著 的 吸 附 作 用 ； 即 便 面 對 較 高 濃 度 的 錳 離 子 ， 其 吸 收 率 在 五 小 時 及 八 小 時 也 分 別 可 達 到 22.345% 及 73.869%。 表 一 、 細 菌 對 鎳 離 子 與 錳 離 子 的 吸 收 率 。 控 制 組 為 硫 酸 金 屬 溶 液 ， 無 細 菌 共 培 養 。 吸 收 率 為 ： 實 驗 組/控 制 組 *100%。 細 菌 （ 原 始 濃 度 ）金 屬 共 培 養 (μM ) 控 制 組(μg/L) （ 共 培 養 ）(μg/L) 實 驗 組 吸 收 率（ ％ ） 150 μM Ni2+ 5hr 8.632 x 10-4 6.732 x 10-4 22.01 150 μM Ni2+ 8hr 8.632 x 10-4 6.302 x 10-4 26.992 200 μM Ni2+ 5hr 1.09 x 10-3 0.852 x 10-3 21.835 200 μM Ni2+ 8hr 1.09 x 10-3 0.84 x 10-3 22.943 200 μM Mn2+ 5hr 1.122 x 10-2 0.732 x 10-2 34.759 200 μM Mn2+ 8hr 1.122 x 10-2 0.21 x 10-2 81.283 250 μM Mn2+ 5hr 1.083 x 10-2 0.841 x 10-2 22.345 金 黃 色 葡 萄 球 菌 250 μM Mn2+ 8hr 1.083 x 10-2 0.283 x 10-2 73.869 150 μM Ni2+ 5hr 8.632 x 10-4 5.732 x 10-4 33.596 150 μM Ni2+ 8hr 8.632 x 10-4 1.102 x 10-4 87.234 200 μM Ni2+ 5hr 1.09 x 10-3 0.837 x 10-3 23.211 200 μM Ni2+ 8hr 1.09 x 10-3 0.23 x 10-3 78.9 250 μM Mn2+ 5hr 1.183 x 10-2 1.204 x 10-2 -1.775 綠 膿 桿 菌 250 μM Mn2+ 8hr 1.183 x 10-2 1.172 x 10-2 0.93 750 μM Ni2+ 5hr 3.684 x 10-3 3.544 x 10-3 3.8 750 μM Ni2+ 8hr 3.684 x 10-3 3.478 x 10-3 5.6 1000 μM Ni2+ 5hr 5.127 x 10-3 5.239 x 10-3 -2.138 1000 μM Ni2+ 8hr 5.127 x 10-3 5.312 x 10-3 -3.6 1500 μM Mn2+ 5hr 5.73 x 10-2 5.411 x 10-2 5.57 大 腸 桿 菌 1500 μM Mn2+ 8hr 5.73 x 10-2 5.328 x 10-2 7.01
另 外 我 們 可 以 明 顯 看 出 ， 不 同 於 金 黃 色 葡 萄 球 菌 ， 綠 膿 桿 菌 對 於 錳 離 子 則 沒 有 明 顯 吸 附 作 用 ， 但 對 於 鎳 離 子 的 吸 附 效 果 卻 較 為 明 顯 ， 不 管 是 在 150μM 硫酸鎳或 200μM 硫酸鎳的共培養，綠膿桿菌對於鎳 離 子 的 吸 收 率 在 八 小 時 都 可 以 達 到 八 成 左 右 的 能 力 ， 表 示 綠 膿 桿 菌 對 於 鎳 離 子 具 有 較 高 的 敏 感 性 與 吸 附 性 。
柒、討論
一 、 大 腸 桿 菌 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 以 及 綠 膿 桿 菌 都 是 日 常 生 活 中 常 出 現 的 細 菌 ， 但 其 生 長 速 率 略 有 不 同 ， 在 我 們 確 認 生 長 曲 線 與 實 際 菌 數 的 線 性 關 係 時 發 現 ， 在 同 樣 標 準 程 序 下 二 十 四 小 時 的 生 長 過 程 中 ， 大 腸 桿 菌 可 以 達 到 1.2 的 吸 光 值 ， 但 金 黃 色 葡 萄 球 菌 及 綠 膿 桿 菌 卻 只 有 0.8；但在 每 0.1 吸 光 值 所 代 表 的 實 際 菌 數 中 ， 卻 又 以 綠 膿 桿 菌 所 生 長 的 實 際 菌 數 最 多 ， 可 達 108 個 ， 而 大 腸 桿 菌 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 則 有 107個（ 圖 一 ）。所 以 在 我 們 的 系 統 中 ， 統 一 以 吸 光 值 來 代 表 實 際 菌 數 ， 並 且 分 別 比 較 重 金 屬 對 不 同 菌 種 生 長 的 影 響， 並 不 受到 菌 種 間 生長 速 度 與 實 際 菌 數 不 同 的 干 擾 。 二 、 因 為 在 我 們 的 預 備 實 驗 中 發 現 （ 未 顯 示 ），大 腸 桿 菌 對 於 金 屬 濃 度 變 化 比 較 不 敏 感 ， 可 以 承 受 較 高 濃 度 的 重 金 屬 溶 液 ， 故 我 們 使 用 較 高 濃 度 的 重 金 屬 溶 液 來 與 大 腸 桿 菌 共 培 養 。 從 我 們 的 結 果 中 可 以 發 現 大 腸 桿 菌 對 於 鎳 和 錳 幾 乎 沒 有 吸 收 的 效 果（ 表 一 ），而 我 們 認 為 此 一 現 象 可 能 可 以 從 大 腸 桿 菌 與 重 金 屬 共 培 養 的 結 果 獲 得 一 點 呼 應 ： 從 圖 二 中 我 們 可 以 看 到 ， 大 腸 桿 菌 對 於 鎳 金 屬 離 子 敏 感 度 較 低 ， 相 對 的 也 就 是 耐 受 性 較 高 ， 但 當 濃 度 提 升 到 1000μM 時 ， 大腸 桿 菌 的 生長 速 度 開 始 受 到 影 響 ， 相 對 於 沒 有 重 金 屬 的 組 別 其 生 長 受 到 部 分 抑 制 ， 而 當 濃 度 再 提 升 到1500M 時，其 生 長 幾 乎 停 止 ， 表 示 大 腸 桿 菌 對 於 鎳 金 屬 離 子 可 承 受 的 濃 度 可 能 落 在 1000μM ～ 1250μM 之 間。就 數 據 來 看，750μM～1000μM 的 斜 率 較 1000μM～ 1250μM 的 斜 率 大 ， 表 示 大 腸 桿 菌 可 能 較 為 缺 乏 緩 衝 環 境 變 化 的 能 力 ， 當 濃 度 提 升 到 一 個 閾 值 時 ， 其 生 長 就 很 快 陷 入 停 擺 ； 而 相 較 於 鎳 的 作 用 ， 雖 然 圖 三 中 錳 金 屬 離 子 對 於 大 腸 桿 菌 生 長 仍 有 顯 著 性 地 差 異 ， 但 沒 有 顯 著 性 地 濃 度 相 關 性 （dose-dependent）抑制，甚至 在 較 低 濃 度 如750μM 或 1000μM 還有部分促 進 大 腸 桿 菌 生 長 的 效 果 ， 而 此 一 現 象 可 能 來 自 於 此 濃 度 錳 金 屬 離 子 啟 動 了 大 腸 桿 菌 的 某 些 促 活 （pro-survival） 機 制 ， 使 其 生 長 速 度 加 快 。 三 、 而 不 同 於 大 腸 桿 菌 ， 我 們 發 現 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 錳 金 屬 離 子 可 能 有 吸 附 的 能 力 ， 在 五 小 時 及 八 小 時 都 發 現 有 金 黃 色 葡 萄 球 菌 共 培 養 的 組 別 中 ， 錳 金 屬 離 子 濃 度 相 較 於 控 制 組 要 低 ， 經 過 換 算 後 發 現 ， 在 八 小 時 金 黃 色 葡 萄球 菌 可 能 可 以 達 到 80% 的 吸 收 能 力 （ 表 一 ），此 一 現 象 同 樣 的 可 以 從 金 黃 色 葡 萄 球 菌 與 錳 離 子 共 培 養 的 結 果 尋 得 相 關 性 ， 從 圖 三 中 我 們 發 現 金 黃 色 葡 萄 球 菌 與 硫 酸 錳 共 培 養 五 小 時 時 ， 硫 酸 錳 從 100μM 的濃度開始，呈現濃 度 相 關 性 地 抑 制 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 生 長 ， 但 再 經 過 三 小 時 ， 達 到 八 小 時 則 發 現 ， 僅 有 250μM 的硫酸錳造成 0.1 的 吸 光 值 下 降 ，100μM 及 150μM 的 濃 度 還 呈 顯 著 性 地 些 微 促 進 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 生 長 ， 表 示 金 黃 色 葡 萄 球 菌 在 三 個 小 時 內 ， 可 能 因 其 吸 附 錳 金 屬 的 吸 附 率 由 22%上 升 到 73%，而 使 環 境 恢 復 到 金 黃 色 葡 萄 球 菌 可 以 接 受 的 程 度 ， 使 其 生 長 情 況 恢 復 甚 至 更 好 ， 而 低 濃 度 硫 酸 錳 促 進 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 效 果 可 能 來 自 於 濃 度 錳 金 屬 離 子 啟 動 了 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 某 些 促 活 機 制 ， 使 其 生 長 速 度 加 快 。 四 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 鎳 離 子 的 吸 附 效 果 可 能 沒 有 如 同 錳 離 子 的 吸 附 效 果 好 ， 就 我 們 的 結 果 而 言 ， 此 吸 附 上 限 可 能 在 21%～26%（ 表 二 上半 部 ），而 此 現 象 也 能 從 硫 酸 鎳 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 共 培 養 的 結 果 獲 得 呼 應 ， 從 圖 二 我 們 發 現 五 小 時 及 八 小 時 所 呈 現 的 菌 數 走 勢 相 似 ， 都 隨 著 硫 酸 鎳 濃 度 提 升 而 抑 制 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 生 長 ， 而 且 從 八 小 時 的 趨 勢 圖 中 我 們 可 以 發 現 ， 硫 酸 鎳 抑 制 金 黃 色 葡 萄 球 菌 生 長 的 程 度 更 甚 於 五 小 時（ 圖 二 a），可能 是 由 於 自 五 小 時 後 ， 其 吸 附 能 力 已 到 極 限 ， 金 黃 色 葡 萄 球 菌 受 限 於 環 境 中 的 壓 力 ， 而 影 響 其 生 長 的 速 度 。 五 、 跟 金 黃 色 葡 萄 球 菌 相 反 的 ， 綠 膿 桿 菌 缺 乏 對 錳 離 子 的 吸 附 能 力 ， 但 可 能 具 備 良 好 的 鎳 離 子 吸 附 能 力（ 表 一 ），而 從 綠 膿 桿 菌 與 硫 酸 鎳 共 培 養 的 結 果 我 們 可 以 發 現 ， 在 五 小 時 的 時 間 點 綠 膿 桿 菌 受 到 鎳 離 子 濃 度 相 關 性 地 抑 制 ， 但 在 八 小 時 的 時 間 點，除 了250μM 的 硫 酸 鎳 之 外 ， 其 餘 濃 度 硫 酸 鎳 的 抑 制 效 果 已 消 失 ， 其 生 長 的 情 況 都 與 控 制 組 無 異 ， 表 示 綠 膿 桿 菌 可 承 受 的 硫 酸 鎳 的 濃 度 在 200μM 以內（圖二 b）， 並 且 可 以 在 八 小 時 內 吸 附 此 濃 度 內 的 鎳 離 子 ， 使 生 長 不 受 影 響 。 六 、 而 從 圖 三 中 我 們 也 發 現 ， 硫 酸 錳 對 於 綠 膿 桿 菌 不 但 沒 有 影 響 ， 反 而 呈 現 濃 度 相 關 性 地 刺 激 其 生 長 ， 這 可 能 表 示 在 我 們 使 用 的 硫 酸 錳 濃 度 內 ， 綠 膿 桿 菌 受 到 輕 微 的 刺 激 ， 但 不 至 受 到 傷 害 ， 形 成 一 種 良 性 刺 激 ， 活 化 了 綠 膿 桿 菌 的 促 活 系 統 ， 使 其 生 長 情 況 顯 著 提 升 。 而 綜 合 我 們 的 研 究 發 現 ， 低 濃 度 的 錳 離 子 似 乎 對 於 細 菌 而 言 是 一 種 良 性 地 刺 激 ， 都 能 使 其 有 效 地 增 加 生 長 速 度 ， 而 關 於 此 作 用 我 們 仍 然 沒 有 相 關 文 獻 地 佐 證 ， 將 來 可 以 從 這 裡 針 對 錳 離 子 的 促 活 作 用 做 延 伸 ， 深 入 探 討 。 七 、 細 菌 、 藻 類 及 真 菌 類 能 吸 附 重 金 屬 已 有 相 當 多 的 報 導[1]，但 針 對鎳 及 錳 金
屬 離 子 的 吸 收 文 獻 仍 相 當 有 限 ， 為 我 們 研 究 獨 特 性 之 一 ； 而 且 就 目 前 為 止 的 文 獻 中 ， 並 沒 有 提 及 重 金 屬 離 子 濃 度 與 細 菌 生 長 的 關 係 ， 是 我 們 研 究 的 獨 特 性 之 二 ； 再 者 ， 綠 膿 桿 菌 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 比 起 文 獻 中 提 到 的 光 合 作 用 菌 或 生 物 技 術 改 良 的 菌 種 都 要 來 的 常 見 ， 其 取 得 也 較 為 方 便 ， 相 信 其 應 用 價 值 不 低 。 八 、 我 們 的 研 究 中 都 是 針 對 單 一 細 菌 對 單 一 重 金 屬 的 吸 附 效 果 作 探 討 ， 但 實 際 環 境 中 的 重 金 屬 污 染 通 常 是 多 樣 的 ， 所 以 我 們 必 須 針 對 同 時 存 在 多 種 重 金 屬 的 溶 液 進 行 實 驗 ， 觀 察 細 菌 是 否 仍 具 有 特 定 的 重 金 屬 吸 附 能 力 。
捌、結論
一 、 大 腸 桿 菌 對 於 鎳 與 錳 金 屬 離 子 無 吸 附 功 能 。 二 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 錳 離 子 具 有 較 佳 吸 附 功 能 ， 吸 附 率 於 八 小 時 平 均 可 達 77%。 三 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 鎳 離 子 八 小 時 平 均 吸 附 率 約 24%。 四 、 綠 膿 桿 菌 對 於 鎳 離 子 具 有 較 佳 吸 附 功 能 ， 八 小 時 平 均 吸 附 率 可 達 83%。 五 、 低 濃 度 錳 離 子 具 有 刺 激 大 腸 桿 菌 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 以 及 綠 膿 桿 菌 生 長 的 作 用，不 同 細 菌 有 不 同 的 錳 離 子 耐 受 度。玖、參考文獻
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