百合抗病性防禦基因CDNA選殖及表現分析

行 政 院 國 家 科 學 委 員 會 專 題 研 究 計 畫 成 果 報 告

百合抗病性防禦基因之 cDNA 選殖及表現分析

cDNA cloning and expr ession analysis of defense genes involved in

disease r esistance of lily

計畫編號：NSC 87-2313-B002-043 執行期間：86年8月1日 至 87年7月31日 計 畫 主 持 人 ： 陳 昭 瑩 執 行 單 位 ： 臺 灣 大 學 植 物 病 蟲 害 學 系 ( 87年8月1日起為 植 物 病 理 學 系 ) 一 、 中 英 文 摘 要 抽取百合葉片全 RNA 進行圓點斑 跡雜合分析，以大麥、燕麥及菜豆抗 病相關基因作為探針，在水楊酸處理 的在百合葉片中可偵測到類似防禦基 因表現加強的情形。與大麥 PR-4, 14-3-3, chalcone synthase 及燕麥tlp 類似 的基因可能存在於百合中，且可能為 水楊酸所誘導表現。為進行北方雜合 分析，首先以 PCR 法釣取百合 18S rDNA，並完成分子選殖及序列的確 認。續以 RT-PCR 自百合葉片全 RNA 中 釣 取化 學 物質 誘 導 性 防 禦 基 因 的 cDNA 片段。由已知幾丁質分解酵素基 因及大麥 PR-4,燕麥 tlp 核酸序列設計 引子，進行 RT-PCR，釣取百合有抑菌 功能的基因 cDNA 片段。在大麥 PR-4 引子的 RT-PCR 反應中獲得了與番茄 低溫表現的 cysteine proteinase 有 32% 相似度的 cDNA 片段，可能與百合的 防禦反應有關。

In the dot blot analysis with total RNA of lily leaves treated with salicylic acid (SA), the barley PR-4, 14-3-3, chalcone synthase and oat tlp gene

probes detected stronger signals, indicating that related genes may present in lily and are SA inducible. In order to perform northern hybridization analysis, the 18S rDNA of lily was cloned and sequenced after PCR amplification. In order to clone the cDNA fragments of defense genes of lily in response to the induction of chemicals, RT-PCR was perfomed using primers designed according to the sequences of chitinase, barley PR-4, and oat tlp genes. A cDNA

fragment with similar size to the prediction was amplified. The amino acid sequence showed 32% similarity to

that of cysteine proteinase of tomato, a protein expressed in cold temperature. This cDNA fragment was presumed related to the defense reaction of lily.

二、計畫緣由與目的

已知水楊酸及 probenazole 可誘導 百合產生對灰黴病的抗性(Chen and Huang, 1997; Lu and Chen, 1998)。誘導 抗病反應發生的時候，許多植物防禦 基因如 PR 基因會被誘導表現。水楊酸 可誘導煙草、阿拉伯芥等植物 PR 基因 的表現(Palva et al., 1994; Ward et al., 1991）；probenazole 也可以促進水稻、 阿 拉 伯 芥 及 煙 草 PR 基 因 的 表 現 (Midoh and Iwata, 1996, 1997; Nakashita et al., 1997)。在植物防禦蛋 白質中，有許多是具有抑制真菌生長 的作用，如 PR-2, PR-3, PR-4, PR-5 等。已知大麥 PR-4 蛋白質是一個具有 抑制真菌生長活性(antifungal activity) 的蛋白質，可與大麥的 PR3 蛋白質(即 幾丁質分解酵素)及 PR-5 蛋白質有協 力抑菌的作用；燕麥 PR-5 蛋白質也具 有抑菌的作用(Heigaard et al., 1992; Linet al., 1996)。幾丁質分解酵素在許 多植物抵抗微生物或害蟲為害時所產 生的防禦性蛋白質，可以分解真菌細 胞壁以及節肢動物外殼 (Meins et al., 1994; Schlumbaumet al., 1986)。幾丁質分 解酵素 種 類 甚多 ， 目 前至 少 已有 六 類，ClassⅠ的抑菌效果最強；Class Ⅳ 幾丁質分解酵素與 Class I 幾丁質分解 酵素氨基酸序列十分接近，僅 catalytic domain 有些微差異 (Collinge et al.,

1993;Levorson and Chlan, 1997)。在本研

究中，希望以現有的防禦基因探針鑑 定出百合中在誘導抗病反應中有增強 表現的防禦基因，並希望針對有抑菌 活性的防禦基因作進一步的研究。 三、結果與討論 以 來 自 大 麥 peroxidase (wir3), PAL (pp15), beta-1,3-glucanase (PR-3), PR-4, chalcon synthase (CHS14), glucose-regulating protein (GRP94), germin-like protein 等基因、燕麥 PR-5 (tlp) 基因，菜豆 protein kinase regulator

基因(14-3-3) 探針分析百合防禦基因 表現情形時，顯示百合誘導抗病性可 能與類似於大麥 PR-4、大麥 CHS14、 燕麥 tlp、菜豆 14-3-3 等基因的表現有 關。由於以這些源於其他植物的防禦 基因作為探針，無法順利進行北方轉 漬分析，以瞭解百合防禦基因誘導表 現的情形，故嘗試選殖百合相關基因 的 cDNA，以便作為探針，來分析百合 防禦基因誘導表現情形，增進對百合 系統性誘導抗病特性的瞭解。 由於大麥 PR-4 蛋白質及燕麥 Tlp 蛋 白 質 均 有 抑 制 真 菌 生 長 的 作 用 (Heigaard et al., 1992; Lin et al.,

1996)，故也希望藉此獲得具有抑菌活 性的基因，作為植病防治，建立抗病 植物的有用基因資源。 (一) 百合tlp 類似基因之選殖 根據燕麥 tlp 序列設計引子組 88-402,5'-ATCACCAACAACTGCGGCT TC-3';89-402,5'-GGTGATCTGGTAGT TGCTGTTG-3';90-402,5'-GT GCCAGC GCGG CCACCTTC-3'，以百合基因組 DNA 及水楊酸處理的全 RNA 為模版，進 行 PCR 及 RT-PCR。僅以基因組 DNA

為模版時，可增殖一大小約為 650 bp 的片段；以全 RNA 作為模版並未獲得 RT-PCR 產物。 (二) 百合與大麥 PR-4 類似基因之選 殖 以大麥 PR-4 cDNA 序列設計引子 組，分別為 082-402, 5’-TGCAGGTTG TCACTGATC-3’;083-402,5’-TTAGCT AGCCTTGGATCC-3’; 084-402,5’-ATG GCGGCACGCCTGATGC-3'及 085-402, 5’-CTAGTCGCGGCAGTCGACG-3’。 先以百合基因組 DNA 為模版，進行 PCR 反應，結果顯示 084-402 與 085-402 引子組可放大出一段大小約 400 bp 的 DNA 片段；但電腦分析並未發現 類似的序列 。以 probenazole 處理的百 合全 RNA 為模版，084-402 與 085-402 為引子組時，可增殖相同大小的 RT-PCR 產 物 。 經 分 子 選 殖 ( 命 名 為 pNTU462)及 序 列 分 析 顯 示 所 釣 取 的 cDNA 片段氨基酸序列(圖一)與番茄 cysteine proteinase 有 32% 相似度。番 茄 cysteine proteinase 為低溫表現的蛋 白質 (Schaffer and Fisher, 1988).。雖然不 如預期地獲得 PR-4 類似基因，但仍釣 取到與逆境有關的防禦基因。 (三) 百合幾丁質分解酵素基因之選殖 根據水稻大麥 Class I 幾丁質分解 酵素基因保守序列設計引子：52-402, 5’-GGGGCTACTGCTTCAAG-3’;69-402,5’-AACTGCCTCTGCTGCAGC-3’; 70-402,5’-AACCCGGACCTGGTGGC CACG-3’;63-402, 5’-TGTAGCAGTCG AGGTTG-3’;64-402,5’-GGCGTCATC CAGAACCA-3’。以百合基因組 DNA 為模版，在六組引子中 52-402 及 64-402 可增殖得到一約 550 bp 左右大小 的 PCR 產 物 ， 經 分 子 選 殖 命 名 為 pNTU204，電腦分析並未發現具有相 似性的 DNA 序列。以水楊酸處理的百 合葉片全 RNA 為模版，則無法獲得 RT-PCR 產物。 根 據 菜 豆 、 胡 蘿 蔔 、 Vigna unguiculata 及葡萄等植物 ClassⅣ幾丁 質分解酵素基因 catalytic domain 的保 守序列，設計引子：065-402, 5’-GG TTACTGTGGCACT-3’; 066-402, 5’-A TAGTTGTAGTTCCA-3’; 067-402, 5’-CGCGAGATTGCAG CT-3’; 068-402, 5’-TCCAGTACCACAAGGCT。以百合 基因組 DNA 為模版，僅 065-402 與 066-402 引子組可以增殖大小約 600 bp 的 PCR 產物，經分子選殖序列分析並 無相似序列，可能為非專一性 PCR 產 物 。 以 probenazole 處 理 的 百 合 全 RNA，進行 RT-PCR，無論是處理組或 對照組均可在進行第二次 PCR 反應 後，得到一約 600 bp 的片段；但經核 酸解序後，均與幾丁質分解酵素序列 無關，且似為 ribosomal DNA 分子，為 非專一性 PCR 產物。因此推測百合幾 丁質分解酵素基因序列與已知序列岐 異 度 可能 很 高或 引 子 序 列 設 計 不 理 想，導致非專一性雜合機率過高或幾 丁質分解酵素基因誘導表現程度並不 如預期的高，模版量過低，降低了釣 取的機率。 四、成果自評 目 前 已 在 百 合 葉 片 上 獲 得 一 與 cysteine proteinase 具有 32%相似性的 cDNA 片段，雖然不如預期地獲得 PR-4 類似基因，但仍與逆境有關的基因具 有相似性，有可能也與百合誘導抗病

性有關。由於幾丁質分解酵素基因的 釣取並不如意，可能為試驗策略不理 想，未來將純化 mRNA 作為模版，將 所設計引子組再作 RT-PCR，期望能增 加 釣 取 的 機 率 ； 也 將 製 備 cDNA library，嘗試直接於幾丁質培養基上進 行幾丁質分解酵素基因 cDNA 的篩選 或於含真菌胞子的培養基上直接篩選 具有抑菌活性的 cDNA 克隆；並考慮 增加處理強 度， 提 高 基 因表 現 的 程 度。 由於 RT-PCR 有負反應的情形， 在缺少正對照下，無法判斷是基因無 誘導表現或 RT-PCR 反應不佳，故設 計 actin 基因引子，以確定 RT-PCR 反 應的有無，作為判讀負反應真偽的正 對照。 五、參考文獻

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1 KLSKNKSDRY LPKVGDSLPE SIDWREKGVL VGVKDQGSCG SCWAFSAVAA 51 MESINAIVTG NLISLSEQEL VDCDRSYNEG CDGGLMDYAF EFVIKNGGID 101 TEEDYPYKER NGVCDQYRKN AKVVKIDSYE DVPVNNEKAL QKAVAHQPVS 151 IALEAGGRDF QHYKSGIFTG KCGTAVDHGV VIAGYGTENG MDYWIVRNSW 201 GANCRENGYL RVQRNVSSSS GLCGLAIEPS YPVKTGPNPP KPAPSPPSPV 251 KPPTECDEYS QCAVGTTCCC ILQFRRSCFS WGCCPLEGAT CCEDHYSCCP 301 HDYPICNVRQ GTCSMSKGNP LGVKAMKRIL AQPIGAFGNG GKKSSS

圖一、以大麥 PR4 cDNA 序列設計之引子組釣取百合類似基因 cDNA 之氨基酸 序列