添加麩醯胺對腹膜炎引致敗血症老鼠腸道及全身性免疫反應之影響(1/2)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

添加麩醯胺對腹膜炎引致敗血症老鼠腸道及全身性免疫反

應之影響(1/2)

計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC92-2314-B-002-278- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學醫學院外科 計畫主持人： 陳維昭 計畫參與人員： 賴育妮 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 93 年 5 月 13 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫進度報告

計畫名稱：添加麩醯胺對腹膜炎引致敗血症老鼠腸道及全身性免疫功能之影 響（I）

Effects of glutamine supplementation on the systemic and mucosal immunity in rats with gut-derived sepsis

計畫類別：個別型計畫 計畫編號：NSC-92-2314-B-002-278 執行期間：92 年 8 月 1 日 94 年 7 月 31 日 第一年計畫執行期間：92 年 8 月 1 日 93 年 7 月 31 日 計畫主持人：陳維昭 計畫參與人員：賴育妮

執行單位：台大醫學院外科

中華民國九十三年五月十三日

前言

敗血症（sepsis）是一種在臨床上十分常見而且死亡率極高的併發症， 當細菌以及其內毒素侵入人體後，會造成體內的代謝失衡以及組織之分解，最後 導致多重器官之衰竭，其中包括對小腸之損害。敗血症會造成腸繫膜血流阻力增 加而降低腸繫膜之血流量、小腸黏膜水腫、小腸細胞對葡萄糖及 glutamine（Gln） 之利用率降低、黏膜中酵素活性及吸收功能下降，這些構造和功能上之改變，會 造成腸道免疫功能受損，使細菌轉移之情形更為嚴重。

全靜脈營養（total parenteral nutrition,，TPN）是一種非經腸道的營養支持 方式，常用於腸道功能障礙之病人，由於 TPN 之使用會造成腸黏膜細胞及組織 內 gut associated lymphoid tissue (GALT)發生萎縮，而使得腸黏膜通透性增 加，增加細菌轉移的比例而引發感染，並併發敗血症等症狀。

在體內的免疫系統中，腸道淋巴組織(gut associated lymphoid tissue, GALT) 是腸道及腸外黏膜組織重要的防禦系統，其中有 70-80%的免疫球蛋白由腸黏膜 產生以抵禦侵入腸道之致病原。GALT 包括 Peyer’s patches、Intraepithelial lymphocytes 及 Lamina propria lymphocytes。當有細菌侵入 GALT 後，則會刺 激 GALT 內的 lymphocytes 分泌出一些免疫相關物質來對抗細菌，如：IgA 跟一 些 cytokines。IgA 是保護體內黏膜組織最主要的免疫球蛋白，其可防止黏膜組 織細菌過度生長，並跟細菌結合防止細菌沾黏於黏膜上，而一些體外實驗發現 IgA 的分泌受到一些 cytokines 的調控，如：Th1 細胞所分泌的 interferon(IFN)-γ 及 tumor necrosis factors(TNF)-α會抑制 IgA 的分泌，而 Th2 細胞所分泌的 Interleukin(IL)-4, 6,10 則有促進 IgA 分泌的作用。 近年來免疫營養(immunonutrition)遂成為研究之重點，而 Gln 之添加受到相 當之重視。Gln 為人體中含量最多的游離胺基酸，佔骨骼肌細胞內游離胺基酸量 的 60%，由於其可以自行在體內合成故屬非必需胺基酸，它同時也是一些快速 生長細胞之能量來源。有研究顯示在一些異化作用疾病發生時，體內 Gln 的量會 減少。已有研究顯示 Gln 添加於全靜脈營養的配方中，有助於維持腸道構造和功 能之完整性並可增加氮保留量並預防細菌轉移，敗血症老鼠若補充 Gln 可增加其 存活率。體外實驗顯示 Gln 之添加可促進 T lymphocyte 增生。另外，於 TPN 溶 液中添加 Gln 可維持 Th2 細胞所分泌的 cytokines－IL-4、IL-10 mRNA 的表現 量並維持小腸 IgA 的分泌，增進黏膜免疫的功能。

其他研究也觀察到，在以盲腸結紮並穿刺手術(cecal ligation and puncture, CLP)引致敗血症後給予之 TPN 輸液中補充 Gln，可減少體內蛋白質的分解、增 加肌肉蛋白質的合成、進而改善氮平衡的情形、維持腸胃道黏膜的功能，而使存 活率有明顯之改善。 本實驗擬在敗血症前以由口進食，敗血症後以 TPN 輸入方式給與 Gln，來 研究 Gln 對敗血症的影響，以完整探討 Gln 對敗血症時腸道及全身性免疫反應 之影響。由於敗血症之發生並無法預知，因此本實驗在敗血症發生之前後給或不

給 Gln 來模擬有敗血症危險之重症病人，是否可在住院後即給予 Gln，來預防敗 血症或減輕敗血症之嚴重程度，或事後以靜脈輸入也可達到同樣之效果。本計畫 分成兩年進行，第一年主要探討 GALT、脾臟、血液中 T 及 B 淋巴細胞之分佈比 例，腹腔中巨噬細胞及全血中白血球之吞噬能力等。第二年分析血中營養素變 化、腹水中 cytokine 濃度、腸道中 sIgA 之濃度、巨噬細胞及腸道、脾臟收集之 淋巴細胞以體外刺激後之免疫反應。現僅就第一年之執行進度作一報告。

材料與方法

以 230-250g 之 Wistar 雄性老鼠為實驗對象，共分為五組，經一星期之適應 期後，其中三組給予自行調配一般組成之 semipurified diet，其餘兩組給予相同形 式並以 Gln 取代總氮量 25%之飲食，兩組為等熱量等氮量(30)。各給予十天後， 除 control 組施行 sham operation，其餘四組均實行 CLP 手術，control 組與 4 組 CLP 組均進行頸靜脈插管手術。CLP 手術為將老鼠以乙醚麻醉後，在上腹部中 線切開約 2 公分，在 ileocecal value 下方以 2-0 絲線紮緊，用 18 號針頭穿刺盲腸 兩次後將腹部縫合，以引致腹膜炎及敗血症。在兩種飲食之 CLP 組別中各取一 組與 control 組在敗血症後輸入一般之 TPN 輸液，剩下之兩組輸入以 Gln 取代總 氮量 25%之 TPN 輸液，故五組中一組為 normal control 組，不做 CLP 但作頸靜 脈插管手術，手術前給一般配方，插管手術後給一般 TPN 配方。其餘四組均施 行 CLP 及頸靜脈插管手術，分別為：（1） CLP 前給一般配方，CLP 後給一般 TPN 配方（－－組） （2）CLP 前給一般飲食，CLP 後給富含 Gln 之 TPN 輸液 （－＋組） （3）CLP 前給富含 Gln 之飲食，手術後給一般之 TPN 輸液（＋－ 組）（4） CLP 前後均給富含 Gln 之配方（＋＋組）。五組之營養素組成、總熱量 以及總氮量均相等，分組如下圖所示。

＋＋

Semipurified diet

10 days

CLP

TPN solution

3 days

Adaptation

1 week

sacrifice

－

－

＋Gln

＋Gln

－

－

－－

＋Gln

－＋

－

＋－

＋Gln

－

control

sham operation

結果 一、腹腔灌洗液中白血球的總細胞數之計算（圖一）： 腹腔灌洗液中的細胞主要為巨噬細胞和嗜中性白血球，以 Turk’s solution 染色計數後，在腹腔灌洗液中，其腹腔中巨噬細胞數五組間並無 統計上之差異。 二、 小腸壁上 Peyer’s patches 之總顆粒數（圖二）以及其中淋巴細胞數量之 計數（圖三） 由 Pretest 得知進行 CLP 手術後的第三天，老鼠小腸壁上 Peyer’s patches 內的淋巴細胞受腹腔內細菌刺激而增生，Peyer’s patches 腫大而 明顯。而在敗血症前後均補充 Gln 組，其小腸上 Peyer’s patches 之總顆粒 數明顯比 CLP 前後均未添加 Gln 組多，並有統計上之差異。而 Peyer’s patches 中淋巴細胞的總細胞數，不論在敗血症之前或之後有添加 Gln 之 3 組均明顯較 control 組高，且有統計上之差異。

三、 全血、脾臟以及 Peyer’s patches 中淋巴細胞亞群（subpopulation）分佈 （1）全血中淋巴細胞亞群分佈（圖四） 經由流式細胞儀的分析，全血中 B 細胞（CD45Ra＋ ）在有施行 CLP 手術的四組間並無統計上的差異，但在敗血症前後都有添加 Gln 組則 明顯高於 control 組，有統計上之差異。Total T 細胞在有施行 CLP 手 術的四組間無統計上的差異，且不論在敗血症之前或之後添加 Gln 之 三組與 control 組亦無統計上的差異，但在敗血症前後皆無添加 Gln 組其 Total T 細胞則明顯低於 control 組，有統計上之差異。輔助 T 細 胞（CD4＋ ）則是 CLP 前有添加及前後均有添加 Gln 之兩組與 control 組無統計上之差異，並都高於 CLP 後有添加及前後均無添加 Gln 之兩 組並且有統計上之差異。抑制 T 細胞及殺手 T 細胞（CD8＋ ）之分佈， 五組間並無統計上之差異。 （2）脾臟中淋巴細胞亞群分佈（圖五） 經由流式細胞儀的分析，脾臟細胞中 B 細胞（CD45Ra＋ ）在有施行 CLP 手術的四組間並無統計上的差異，並且明顯高於 control 組，有 統計上之差異。Total T 細胞在有施行 CLP 手術的四組間無統計上的 差異，且不論在敗血症之前或之後添加 Gln 之三組與 control 組亦無 統計上的差異，但在敗血症前後皆無添加 Gln 組其 Total T 細胞則明顯 低於 control 組，且有統計上之差異。輔助 T 細胞（CD4＋ ）在有施行 CLP 手術的四組間並無統計上的差異，並且明顯低於 control 組，有 統計上之差異。抑制 T 細胞及殺手 T 細胞（CD8＋ ）之分佈，有施行 CLP 手術的四組間並無統計上的差異，而 CLP 前後均補充 Gln 組則 較 control 組高，且有統計上之差異。

（3）Peyer’s patches 中淋巴細胞亞群分佈（圖六）

Peyer’s patches 中 B 細胞（CD45Ra＋）和抑制 T 細胞及殺手 T 細胞 （CD8＋ ）之分佈，五組間並無統計上之差異。而 Total T 細胞及輔助 T 細胞（CD4＋）則都在有施行 CLP 手術的四組間無統計上的差異， 且不論在敗血症之前或之後添加 Gln 之三組與 control 組亦無統計上 的差異，但在敗血症前後皆無添加 Gln 組其 Total T 細胞則明顯低於 control 組，且有統計上之差異。 四、細胞吞噬能力之測定 （1）腹腔灌洗液中巨噬細胞之吞噬能力（圖七） 結果顯示，在敗血症前後均補充 Gln 組以及引致敗血症前補充 Gln 組 其巨噬細胞之吞噬能力明顯較引致敗血症前後皆無補充 Gln 組以及控 制組為強。但引致敗血症前補充 Gln 組及引致敗血症後補充 Gln 組則 無統計上之差異。 （2）全血中嗜中性白血球之吞噬能力（圖八） 經由 Flow cytometry 的分析，五組之週邊血液中嗜中性白血球之吞噬 能力並無明顯之差異。

0

5

10

15

20

25

1

m

a

c

rophage

control

---+

+-++

(X 1 0 6 )

Figure 1. The numbers of macrophage in peritoneal lavage fluid (PLF) in the five groups 3 days after CLP

0 5 10 15 20 25 1 n u m ber of P e yer 's pat che s -- + + -+ -+ b ab ab a

Figure 2. The number of Peyer’s patches on the whole small intestine in the four groups 3 days after CLP

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

ly

m

pho

c

y

te

control ---+ +-++ b a ab b b ( X 1 0 6 )

Figure 3. The number of lymphocyte in the Peyer’s patches in the five groups 3 days after CLP

0 10 20 30 40 50 60 70 80 CD45Ra+ CD3+ CD4+ CD8+ % control ---+ +-++ b a ab ab ab b a ab ab ab b a b a a

Figure 4. The distribution of CD45Ra+, CD3+, CD4+ and CD8+ lymphocytes in

the whole blood in the five groups 3 days after CLP

0 10 20 30 40 50 60 CD45Ra+ CD3+ CD4+ CD8+ % control ---+ +-++ a b b b b b a ab ab ab a b b b b ab b a ab b

Figure 5. The distribution of CD45Ra+, CD3+, CD4+ and CD8+ lymphocytes in

0 10 20 30 40 50 60 70 CD45Ra+ CD3+ CD4+ CD8+ % control ---+ +-++ a b ab ab ab b a ab ab ab

Figure 6. The distribution of CD45Ra+, CD3+, CD4+ and CD8+ lymphocytes in

the Peyer’s patches in the five groups 3 days after CLP

0 1000 2000 3000 4000 1 F luor escei n ( E x= 4 85nm , E m = 535n m ) control ---+ +-++ a b bc a ac

0

20

40

60

80

100

1

%

control ---+ +-++

Figure 8. Phagocytic activity of peripheral blood neutrophils by flow cytometry

討論

References

1. Leon P, Redmond HP, Stein TP, et al: Arginine supplementation improves histone and acute phase protein synthesis during gram-negative sepsis in the rats. J Parenter Enter Nutr 15:503-508, 1991

2. Fischer JE: Muscle protein catabolism in cirrhotic patients reduced by branch-chain amino acids Nutr Rev 41:146-149, 1983

3. Bagby GJ, Spitzer JA: Decreased myocardial extracellular and muscle lipoprotein lipase activities in endotoxin-treated rats. Proc Soc Exp Biol Med 168:395-398, 1981

4. Bagby GJ, Corll CB, Martinez RR: Triacylglycerol kinetics in endotoxic rats with suppressed lipoprotein lipase activity. Am J Physiol 253:E59-64, 1987

5. Kiyono H, McGhee JR: T helper cells for mucosal response responses. In: Ogra PL, Lamm ME, McGhee JR, et al., eds. Handbook of mucosal

immunology. San Diego:Academic Press: 263-273, 1994

6. Daly JM, Reynold J, Thom A: Immune and metabolic effects of arginine in the surgical patients. Ann Surg 208:512-515, 1988

7. Kay JE, Lindsay VJ: Polyamine synthesis during lymphocyte activation. Exp Cell Res 77:428-436, 1973