反意寡核酸作為癌症治療藥劑之研發

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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

計畫名稱：反意寡核酸作為癌症治療藥劑之研發

計畫編號：NSC 87-2314-B002-284

執行期限：86 年 8 月 1 日至 87 年 7 月 31 日

主持人：台灣大學醫事技術學系副教授 C

e-mail: [email protected] 一、中文摘要 本研究以肝癌細胞株為材料，利用類 因素林第二生長因子(IGF-II)的反意寡核酸 來探討這個生長因子對肝癌細胞株生長的 影響。我們發現在體外試驗有兩株人類肝 癌細株產生較高的 IGF-II，他們會隨著細 胞內 IGF-II 的降低而降低增殖活性。而 IGF-II 產量少的細胞株則不受影響。而將 HepG2 細胞接種於 SCID 鼠的皮下進行 in vivo 腫瘤生長抑制試驗也顯示 IGF-II 的反 意寡核酸可以減低腫瘤的生長速率。 關鍵詞: 反意寡核酸，類因素林第二生長因 子，肝癌細胞株 Abstr act

To study the importance of insulin-like growth factor II ( IGF-II ) for the growth of hepatoma cells, antisense oligonucleotides were used to inhibit translation of insulin-like growth factor II ( IGF-II ). In vitro, two cell

lines of human origin producing higher IGF-II were effected by the antisense oligonucleotide. Their proliferative activities

were reduced. While the cells produce lower IGF-II were not effeced. In vivo experiment

was done on SCID mice bearing subcutaneous tumor formed by HepG2 cells. Antisense oligonucleotides of IGF-II were found to decrease tumor growth rate.

Keywor ds: Antisense oligonucleotides, Insulin-like growth factor II, Hepatoma cell line

二、計畫緣由與目的

癌細胞內有些蛋白質與癌細胞的惡性 生長有關，這些蛋白質有些是基因產生變 異，有些是調控機制異常導致基因過度表 現。臨床研究發現，肝癌組織有類因素林 第二生長因子（Insulin-like growth factor II，簡稱 IGF-II）過度表現的現象（Su et al., 1994; Schirmacher et al.,1992; Fiorentino et al., 1994）。我們利用反意寡核酸[Antisense oligonucleotides]抑制肝癌細胞株中 IGF-II 的轉譯，探討癌細胞的生長是否因而受影 響。 IGF-II 是由 67 個氨基酸所組成的單鏈 蛋白質，分子量為 7.5 KDa。其對細胞的影

2 響可經由與受體結合以達成，在細胞表面 的受體有兩型，一為 IGF-I 受體（第一型受 體），另一為 IGF-II 受體(第二型受體)。 IGF-II 可藉由與細胞膜上的第一型受體結 合而活化酪胺酸激 ，引起一連串複雜的 訊息傳遞而促進生長（Humbel 1990）。而 與第二型受體的結合，沒有促進細胞生長 的效果，由於第二型受體的蛋白質序列與 mannose-6-phosphate 受 體 有 80% 相 似 性，因此功能上可能和醣類代謝有關。 IGF-II 與生長、發育、細胞分化有關。根 據文獻報導 IGF-II 的表現量在胚胎發育期 及青少年生長時期 IGF-II 在胚胎組織或血 清中的表現量有大量增加的現象，過了生 長期，IGF-II 表現量又下降（Hemming et al., 1992; Humbel., 1990）。而在一些腫瘤組織 及細胞可發現致癌基因的活化及腫瘤細胞 生長過程有自分泌 旁分泌機制來促進生 長有關。根據文獻報導在許多種癌組織， 包括肝癌, 其腫瘤組織均有 IGF-II 過度表 現或 IGF-II 胚胎型的 mRNA 增加的現象， IGF-II 在腫瘤發生中所扮演的角色被認為 是會在致癌基因引起腫瘤發生後使細胞過 度繁殖。我們篩選了一系列的肝癌細胞 株，發現其中 HuH-7 及 HepG2 產生較大量 的 II，想利用反意寡核酸來探討 IGF-II 在這些肝癌細胞株中的重要性。 反意寡核酸（長度在 20 個核 酸上下） 為可以進入活細胞內與 mRNA 結合進而 降低蛋白質產量的物質，一個蛋白質在細 胞內扮演的角色，可以利用這種方式使蛋 白質量減少，看細胞會有何反應。肝癌細 胞的過度生長如果與 II 有關，當 IGF-II 量減少，則細胞的生長會受到抑制。 三、結果與討論 我 們 培 養 四 株 人 類 肝 癌 細 胞 株

（HepG2, HuH7, HA22T 及 Hep3B）及三株 大白鼠肝癌細胞株（GN6TF, GP7TB 及 GP10TA）測定它們 IGF-II 的產生能力，發 現其中 HepG2 及 HuH-7 這兩株細胞內的含 量大約為每 100µg 蛋白質中有 30ng，約為 其他細胞株的 5 倍之多，所有的細胞培養 液中均測不到 IGF-II，顯示 IGF-II 在這些 細胞中均為內分泌型（intracrine）的生長 激素。

先 利 用 In vitro transcription couple translation 的方法篩選出有效的 ATON（圖 1.），28T 及 28D 的抑制效果相當明顯，被 用來進行下面的實驗，用於這兩株細胞中 降低 IGF-II 的產生量，發現這兩株細胞的 生長會受抑制。而其他 IGF-II 含量低的細 胞株則不受影響。細胞生長的抑制主要歸 因於細胞增殖活性的降低與細胞凋亡無 關。這些結果顯示過度表現 IGF-II 的細胞

圖 1. Transcription couple Translation assay.

22KDa 為重組載體做出的 IGF-II 蛋白質。P 為 positive control 組，N 為 negative control 組（即 未加 IGF-II 的 DNA，Luc 為添加 luciferase 的 positive control。123, 28T, 28D, 125 及 SP 均為寡核酸 之編號。

3 株的生長與 IGF-II 確實有關，使用反意寡 核酸可以降低 IGF-II 的量，進而選擇性的 抑制 IGF-II 過度表現的細胞生長。進一步 將 HepG2 細胞接種於 SCID 老鼠的皮下， 再注射反意寡核酸，結果顯示確實可以使 腫瘤的生長減緩一半以上（如圖 2.）。這些 結果顯示 IGF-II 的反意寡核酸可以抑制 IGF-II 過度表現的細胞的生長，值得進一 步探討其作用分子機制。在這些肝癌細胞 內，應該還有其他分子與細胞生長有關， 我們還在以相同策略挖掘其他分子。針對 多個目標蛋白，相信可更有效控制腫瘤生 長。 四、計劃成果自評 原計劃預計要以反寡核酸抑制 IGF-II 及 VEGF ( Vascular endothelial growth factor )。IGF-II 的部份順利達成。然而在 VEGF 方面的實驗因為未找到表現 VEGF 的細胞株，故研究後半年集中在 IGF-II 的 探討。本研究結果部份已發表(Lin et. al., 1997)。動物實驗部份尚未發表，我們將針

對 IGF-II 及其他目標蛋白 (PKC-α) 一起 抑制評估其效果。

五、參考文獻

1. Fiorentino, M., Griginoni, W.F., Baccarini, P., Derrico, A., Demitri, M.S., Pisi, E., and Mancini, A.M. (1994) Different in situ

expression of insulin-like growth factor type II in hepatocellular carcinoma: an in situ hybridization and

immuno-histo-chemical study. Diagn. Mol. Pathol. 3, 59-65

2. Schirmacger, P., Held, W., Yang, D., ChisariF., Rustum, y., and Rogler, C. E. (1992) Reactivation of insulin-like growth factor II during hepatocarcinogenesis in transgenic mice suggests a role in malignant growth. Cancer Res. 52, 2549-2556

3. Hemming R., Langlais J., Falcone T., Granger L., Miron P., and Guyda H. (1992) Human embryos produce

圖 2. 在 SCID 小鼠皮下，腫瘤的生長情形

8-12 週大的 SCID 小鼠在其腹側皮下注射 5×106_個細胞

懸浮液，體積為 100µl。大約 30 ~ 40 天後，腫瘤長出 開始施藥。每週打一次。每次打 100µg，觀察腫瘤生長 情形並以尺測量腫瘤大小。

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transforming growth factor α activity and insulin-like growth factor II. Fertility and Sterility 58, 101-104

4. Humbel, R.E. (1990) Insulin-like growth factors I and II. Eur. J. Biochem. 190, 445-462

5. Lin, S.B., Hsieh, S.H., Hsu, H.L., Lai, M.Y., Kan, L.S., and Au, L.C. (1997) Antisense oligonucleotide of IGF-II selectively inhibit growth of human hepatoma cells overproducing IGF-II. J. Biochem. 122, 717-722

6. Su, Q., Liu, Y., Zang, S.X., Li, D.F., and Yang, J.J. (1994) Expression of insulin-like growth factor II in hepatitis B cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatology 19, 788-799