建構一個可藉由細菌細胞壁胜肽調控的基因表現系統

國 立 交 通 大 學

生物科技學院

生化工程研究所

碩士論文

建構一個可藉由細菌細胞壁胜肽調控的基因表現系統

Construction of a muropeptide regulatory expression system

研究生：楊上知

指導教授：廖光文 博士

I 目錄 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧I 圖表‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧II 附錄‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧III 中文摘要 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧1 英文摘要 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧3 第一章 緒論‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧5 第一節 利用誘發性轉錄因子所建構的基因調控系統 ‧‧‧8 一、 熱感應驅動 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧8 二、 輻射感應驅動 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧9 三、 藥物感應驅動‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧11 3-1 ： 雙 體 藥 物 驅 動 模 式 dimerization on switch‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧11 3-2：利用異體的基因調控來關閉基因表現的系統模式

allosteric off system‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧14 3-3：利用異體的基因調控來開啟基因表現的系統模式 allosteric on switch‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧16 3-3-1：mifepristone （RU486）調控型 ‧‧‧16 3-3-2 : ecdysone systems‧‧‧‧‧‧‧‧‧18 3-3-3 : reverse tet 調控系統‧‧‧‧‧‧‧19

第二節 抗生素與抗藥性基因的調控 （β-lactamase）的調控機制‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧21 第二章 實驗策略與流程‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧23 第ㄧ節、用β-lactamase 的基因調控系統來作為調控型啟動 子的設計基礎‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧23 第二節、用 VP16 的修飾來作為真核轉錄系統的應用‧‧‧24 第三節、建構雙質體的 muropeptide 誘導基因表現的調控系 統‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧24 第四節、實驗流程‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧25 第三章 實驗材料與方法‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧27 第一節、ampR 基因的取得‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧27 一、 Morganella morganii subsp .morganii DNA 的 取

得 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧27 1-1：菌種的取得與培養 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧27 1-2：抽取 Morganella morganii subsp .morganii DNA 27 二、 聚合脢連鎖反應以增福 ampR‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧28 2-1：ampR 引子的設計 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧28 2-2：聚合脢連鎖反應 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧29 三、 洋菜膠電泳分析‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧30

四、 PCR 產物純化‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧30 第二節、表現型（expression）與反應型(response)質體的 構築 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧31 一、 表現型質體構築‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧31 1-1 表現 ampR-VP16 質體的建構‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧31 1-1-1：ampR 片段黏合 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧31 1-1-2：質體轉型 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧32 1-1-3：菌液 PCR‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧33 1-1-4：質體小量 DNA 分離 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧33 1-1-5：限制脢切割 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧34 1-1-6：DNA 定序及比對‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧35 1-1-7：質體 DNA 大量分離 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧35 1-1-8︰VP16 的引子設計與聚合脢連鎖反應 ‧‧‧‧36 1-1-9：接合 VP16 於 POST-I-ampR 中‧‧‧‧‧‧‧37 1-1-10：linker 的引子設計‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧38 1-1-11：接合 linker 於 ampR-VP16 中間‧‧‧‧‧‧39 1-1-12: 設計新引子,利用聚合酶連鎖反應將 ampR-linker-VP16 增幅出來‧‧‧‧‧‧‧39 1-1-13：接合 ampR-linker-VP16 於 PC3.1 骨架質體‧40

1-2：ampR 表現型質體的構築 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧41 二、反應型質體的建構‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧42 2-1：SV40-ARE-hrGFP 的構築‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧42 2-1-1：SV40 的接合‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧42 2-1-2：接合 SV40 到 POST-I 上 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧43 2-1-3：hrGFP 基因的取得 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧43 2-1-4：接合 hrGFP 至 SV40 之後‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧44 2-1-5：ARE 的引子設計 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧45 2-1-6：接合 ARE 於 SV40-hrGFP 之間‧‧‧‧‧‧‧‧45 2-2：ARE-hrGFP 質體的構築 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧46 2-2-1：新 ARE 的引子設計 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧46 2-2-2：接合新 ARE 序列至 PC3.1-hrGFP 上 ‧‧‧‧‧47 第三節：質體轉染‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧47 3-1：seeding cells‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧47 3-2:質體轉染‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧48 第四節：微脂體包覆 muropeptide 的複合體準備 ‧‧‧‧‧‧49 4-1：muropeptide 的取得‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧49 4-2：自製微脂體包覆 muropeptide 複合體的準備‧‧‧‧‧49 第五節：ampR-VP16 蛋白質表現與 DNA 結合作用試驗 ‧‧‧‧49

第六節：流式細胞分析儀 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧50 6-1:FACS 開機之前置作業‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧50 6-2:分析檢品之模式檔案使用程序 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧51 6-3:FACS 關機及清洗程序‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧54 第七節：TNF-α及 IL-1β之 ELISA 測試‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧55 7-1：TNF-α‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧55 7-2：IL-1β‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧56 第八節 統計分析‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧57 第四章 實驗結果 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧58 一、 Morganella morganii sudsp morganii DNA 與 ampR

基因的取得 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧58 二、 表現型 （expression）與反應型 (response)質體的 構築 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧59 三、 ampR-VP16 質體功能性測試 （蛋白質表現測試）‧63 四、 ampR，ampR-VP16，SV40-ARE-hrGFP，ARE-hrGFP 質體 經共同轉染後交互作用測試結果 ‧‧‧‧‧‧‧‧64 五、 Muropepetides (inducer)對於質體共同轉染影響的 測試 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧65 六、 Muropepetides (inducer)的免疫性測試 ‧‧‧‧67

第五章 實驗討論 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧68 第六章 參考文獻 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧73

II 圖一、利用穩定及常態性表現型的啟動子調控基因表現。其基因表現 量與表現時間的關係‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧76 圖二、利用可調控型的啟動子調控基因表現。其基因表現量與表現時 間的關係‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧76 圖三、dimerization on switch 的調控模式 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧77 圖四、Rapamycin 的調控模式‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧77 圖五、Tetracycline turn-off 的調控模式‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧78 圖六、RU486 調控系統模式‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧78 圖七、Tetracycline turn-on 的調控模式 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧79 圖八、β-lactamase 基因活化的調控機制 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧80 圖九、利用 muropeptide 活化 ampR 後與 ARE 的相互作用，以開啟下 游報導基因‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧81 圖十、利用 VP16 來修飾原本 ampR 的原核生物轉錄因子，以達到於真 核生物中應用的目的‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧81 圖十一、利用共同轉染 1.表現型質體，2.反應型質體至真核細胞中， 測試在此雙質體的建構系統下，加入誘導物後使得報導基因開啟的現 象‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧82 圖十二、建構雙質體基因調控系統所需要的質體類型‧‧‧‧‧‧83 圖十三、本實驗的建構及測試實驗流程‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧83

圖十四、ampR 聚合脢連鎖反應電泳圖 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧84 圖十五、ampR 在兩種菌株 （pp19 與 B172）中的胺基酸序列比較 85 圖十六、經由限制脢切割反應後得到 ampR 的 DNA 片段 ‧‧‧‧‧86 圖十七、經由聚合脢反應後得到 VP16 的 DNA 片段 ‧‧‧‧‧‧‧86 圖十八、經由限制脢切割反應後得到 VP16 的 DNA 片段 ‧‧‧‧‧87 圖十九、經由限制脢切割反應後確認 CMV-ampR-linker-VP16 及 CMV-ampR 兩種表現型質體 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧88 圖二十、經由聚合脢連鎖反應後得到的 SV40 DNA 片段 ‧‧‧‧‧89 圖二十一、經由限制脢切割反應後得到 SV40 的 DNA 片段 ‧‧‧‧89 圖二十二、經由限制脢切割反應後得到 hrGFP 的 DNA 片段‧‧‧‧90 圖二十三、經由限制脢切割反應後得到正接 hrGFP 的 DNA 片段‧‧90 圖二十四、經由限制脢 （MluI 及 XhoI）切割反應後確認 ARE 接合於 SV40-ARE-hrGFP 上 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧91 圖二十五、經由限制脢 （SpeI 及 XhoI）切割反應後確認 ARE 接合於 -hrGFP 上 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧92 圖二十六、利用微粒小體與 ARE 的複合體測試表現型質體的功能 性‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧93 圖二十七、ampR-VP16 與 SV40-ARE-hrGFP 共同轉染結果 ‧‧‧‧94 圖二十八、ampR-VP16 與 ARE-hrGFP 共同轉染結果‧‧‧‧‧‧‧95

圖二十九、ampR 與 SV40-ARE-hrGFP 共同轉染結果‧‧‧‧‧‧‧96 圖三十、ampR 與 ARE-hrGFP 共同轉染結果 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧97 圖三十一、ampR-VP16 與 SV40-ARE-hrGFP 共同轉染並加入

muropeptide 的結果‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧98 圖三十二、ampR-VP16 與 ARE-hrGFP 共同轉染並加入 muropeptide 的 結果‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧99 圖三十三、ampR 與 SV40-ARE-hrGFP 共同轉染並加入 muropeptide 的 結果‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 100 圖三十四、ampR 與 ARE-hrGFP 共同轉染並加入 muropeptide 的結 果‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 101 圖三十五、ampR-VP16 與 SV40-hrGFP 及 SV40-ARE-hrGFP 共同轉 染‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 102 圖三十六、ampR-VP16 與-hrGFP 及 ARE-hrGFP 共同轉染的結果‧ 103 圖三十七、ampR 與 SV40-hrGFP 及 SV40-ARE-hrGFP 共同轉染結果 104 圖三十八、ampR 與-hrGFP 及 ARE-hrGFP 共同轉染並的結果 ‧‧ 105 圖三十九、muropeptide 及微脂體對於 P338/D1 細胞產生 TNF-α表現 量的影響‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 106 圖四十、誘導物及微脂體對於 P338/D1 細胞產生 IL-1β表現量的影 響‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 107

III

附錄 1：CMV-ampR-linker-VP16‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧108 附錄 2：CMV-ampR‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧115 附錄 3：SV40-ARE-hrGFP‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧121 附錄 4：ARE-hrGFP ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧126 附錄 5 ampR gene (strain B172)‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧132

建構一個可藉由細菌細胞壁胜肽調控的基因表現系統 學生：楊上知 指導教授：廖光文 博士 國立交通大學 生化工程研究所 碩士班 中文摘要： 在近來的基因治療發展中，許多研究報導發現表現基因應受到調 控，以避免副作用的產生或是加強其療效。因此，一個有效率而且受 外在因子調控的啟動子，對於基因治療上的應用是很重要的。在本論 文的研究目的便是建構出一個可受外在因子調控的啟動子。在一些抗 盤尼西林類的菌種中，具有抗藥相關的轉錄因子-ampR 已經被發現， 而細菌的細胞壁胜肽 (muropeptide)是此抗藥機制的誘導物。我們以 這個抗藥性機制做為調控基因表現的基礎模式。這個基因調控系統有 2 大種類的質體，一種是常態性表現以 ampR 為主體的轉錄因子，另一種 主要是帶有 ampR 結合位置 (ARE)及報導基因 （hrGFP）。在這個建構 下，我們將兩種質體同時轉染進入細胞後，在沒有加入 muropeptide 時，發現報導基因具有一定表現量。而在加入 muropeptide 後，在報 導基因的表現上有兩種情況：1.以 ampR 為系統的主要轉錄因子，則報 導基因的表現量降低。2.以 ampR-VP16 為系統的主要轉錄因子，則報 導基因的表現量增加。從這個實驗結果中可以知道這個新建構的系

統，可以應用於開啟或是關閉下游基因表現的基因調控。再者，因為 muropeptide 是構成細菌細胞壁的單元物，若將來應用於生物體時，可 能會引起類似菌血症的發炎反應，所以針對 muropeptide 進行了發炎 反應的測試。在 TNF-α，及 IL-1β的測試結果中發現，muropeptide 不會引起 TNF-α及 IL-1β產生。經由這些實驗測試我們所建構的 muropeptide 基因調控系統後，我們確定可以利用 muropeptide 來調控 基因的表現。將來，如果將我們所建構的 muropeptide 調控系統修是 的更理想的時候，我們可以將此系統與一些其它已經發表且市售化的 基因調控系統作個結合，設計出一個多方調控基因表現的基因治療療 程。

Construction of a muropeptide regulatory expression system Students: Shang chih Yang adviser : Dr Kuang Wun

Liao

College of Biological Science and Technology National Chiao Tung University

Abstract:

A lot of reports in recent years have pointed out that the gene expression should be regulated to avoid it from being

uncontrollable and to improve its efficacy. The purpose of our research is to construct a promoter which can be regulated by an external factor.

Some kinds of bacteria have already been found to be resistant to penicillin. The mechanism of the drug resistance is associated with a transcription factor, ampR, and an inducer, the

muropeptide. Based on this mechanism, we designed a regulatory gene expression system in which one plasmid containing ampR or ampR-VP16 is constantly expressed whereas the other containing

ampR response element (ARE) and a reporter gene, hrGFP, is inducible. After co-transfection, hrGFP was constantly expressed without muropeptide. But with the addition of

muropeptide, two situations were observed. In the system of ampR as the main transcription factor, the expression of hrGFP was low. However, in the system of ampR-VP16 as the main

transcription factor, the expression of hrGFP was enhanced.

Moreover, because muropeptide is a unit that forms the cell wall of a bacterium, we carried out some in vitro tests to rule out the possibility of an immune response. TNF-α and IL-1β were not enhanced in our assay, indicating that muropeptide will not elicit an immune response. As a result, the regulatory system we have constructed is applicable to turn on and off a gene by muropeptide.

第一章 緒論

在人類文明與科技的發展過程中，『醫療』一直是一個我們無法忽 視的重要環節，因為疾病的發生往往造成了我們物質與精神上的損 耗，更甚者，奪取了我們的生命。而至目前為止，治療疾病最常使用 的方式就是口服、注射藥物或是外科手術。但是，這些方式是否已經 足夠用來治療至目前為止已知的疾病呢？答案顯然是否定的。因為現 在醫學技術的研究發展已經到了分子層次，使得我們瞭解到一些疾病 產生的原因，是由於基因的損壞或是缺陷，例如：癌症，遺傳性疾病… 等等。因此，如果我們能夠修補或是替換這些不正常的基因，這些疾 病或許就能夠被我們所控制以及治療。 『基因治療』，便是在這個理念下所產生的新療法，而許許多多的 科學家也致力於研究及發展一個安全、有效的基因治療的療程。在 1990 年 美 國 Blaese 博 士 及 其 團 隊 成 功 地 將 正 常 的 ADA (adenosine deaminase) 基因殖入病人 （先天性免疫不全症）的淋巴球，完成基 因治療第一個成功的案例 (Blaese 1993)。雖然，這樣看起來好像基 因治療是個可行的醫療方式，但是也有許多不成功的案例告訴我們， 對於這個新穎的醫療領域，還有許多的問題需要我們去發現及解決。 在基因治療技術的研究中，比較被重視的一個方向，是傳送治療 基因的方式。因為將治療基因以高效率、高安定性的方式傳送到目標

細胞或是組織，是基因治療的必要條件。但是，近年來的研究發現到， 除了傳送治療基因的方式需要改進，到了目標細胞或是組織後，內在 的基因調控也是非常重要的一個環節，因為有了良好的基因表現方 式，除了可以有效的表現出治療基因外，也不會引起身體太大的副作 用。一般而言，利用啟動子調控基因的方式有 2 種：1.利用穩定及常態 性表現的啟動子 (promoter) 調控，2.利用可調控性的啟動子調控 (Clackson 2000)。這兩種形式的調控方式所達到的治療目的各有不同， 我們可以從以下的圖解中瞭解到各自的特色 (圖一，圖二)。 利用穩定及常態性表現的啟動子調控，可以知道這種方式可以使 得基因產物穩定的表現出來，雖然表現的量有高有低 （取決於啟動子 的能力），但是只要是選擇適當的啟動子，就可以使表現量在基因治療 所需的範圍內。但是，這種方式不能夠停止這個治療基因的表現，有 可能造成過多的基因產物，而使身體產生不良的反應。 利用可調控的啟動子，我們可以控制治療基因表現的時間，在投 以誘導物之後，會使得該啟動子表現下游基因，而使此基因產物達到 治療用的量。而當我們完成了治療後，就可以停止投以誘導物，這樣 會使得啟動子不再表現下游的治療基因。這樣一來，就可以避免身體 大量累積治療基因的產物。 由此比較後，可以知道，可調控性的啟動子在基因治療的應用上

是很有幫助的。所以，我們便想要設計一個可以受到誘導物調控的啟 動子，作為將來基因治療可以使用的一個原件。

在生物體中，由遺傳基因轉錄成 mRNA 進而轉譯成蛋白質的過程是 一個複雜而且具有多方調控的步驟。在這個基因表現的過程中，最基 本的步驟就是基因 DNA 經由酵素 （RNA polymerase）作用產生一條互 補的 RNA 片段，簡言之就是將 DNA 上的遺傳密碼傳遞給 RNA。這個過程 便稱為『轉錄』。 一般而言，轉錄的過程可以分成 3 個階段：1. 轉錄起始：RNA polymerase 藉由一些轉錄因子的幫助座落於該基因的啟動子上。2. 核 醣核酸延展：RNA polymerase 將核醣核酸依 5＇往 3＇端方向以共價鍵 結合。3. 轉錄終止：當 RNA polymerase 辨識到一些代表轉錄終止的 基因序列時，便會離開，轉錄作用亦即停止。由此可知，轉錄因子與 啟動子或是上游的強化子 (enhancer)相互結合作用是控制著轉錄起 始的一個重要步驟。針對基因調控的相關研究中，有一種藉由外加四 環黴素 (tetracycline)來控制基因的表現與否的系統已經被發展出 來 (Gossen and Bujard 1992)。這個研究結果可以給我們兩個想法： 第一，原核生物的轉錄因子經過加入 VP16 轉錄活化區的修飾後，可以 應用在真核生物的基因調控上。第二，原核生物的抗藥性基因表現與 抗 生 素 調 控 的 作 用 機 制 ， 例 如 盤 尼 西 林 與 抗 藥 性 基 因 ampC ( β

-lactamase)的相互作用關係 (Poirel, Guibert et al. 1999)可以作 為一個基因調控的系統架構。參考並結合這兩種研究成果，或許是我 們設計一個新的基因調控系統的重要資訊來源。關於這些研究發現以 及其相關的背景，接下來的文章便逐一介紹之。 第一節 利用誘發性轉錄因子所建構的基因表現系統 在基因調控系統的建構上，一般是利用特殊的轉錄因子作為調控 系統的應用。此種轉錄因子都有因為外來因子 （誘導物）的影響而對 下游基因的轉錄動作有促進或是抑制的特性。以下的內容就針對現在 已經被發展出來的調控型基因表現系統做個間單的分類與介紹。 一、 熱感應驅動 在生物體的基因調控中，有一類的基因表現模式是藉由溫度上的 變化而開啟基因產物的轉錄，而這種調控類型的啟動子便稱之為熱感 應啟動子 （Heat-sensitive promoters）。在相關的文獻報導中，其 中一種啟動子的設計便是由熱休克蛋白 70 （Heat-shock protein 70） 的啟動子所構成 (Vekris, Maurange et al. 2000)。在細胞實驗中經 由此段啟動子所驅動的下游報導基因綠色螢光基因 （GFP），會在加 熱至 43℃後的 20 至 30 分鐘到達最大表現量。在動物體實驗中，將區

域性部位升溫 5 至 8℃，而熱休克蛋白 70 的啟動子也會在這個時期開 啟了轉錄動作 (Madio, van Gelderen et al. 1998)。所以藉由對於 溫度變化有反應的啟動子，可以設計出由溫度調控的基因表現系統。 不過，藉由溫度的變化來達到基因調控的效果，在應用上及控制基因 表現的效果，都不是很理想的一種基因調控方式，所以還有其它類型 的基因調控系統被發展出來，接下來介紹的是第二種：經由輻射驅動 基因表現的調控模式。 二、輻射感應驅動 在癌症的治療方式中，有一部份的治療法是利用放射線照射癌細 胞使其死亡而達到治療的目的。因應這種治療方式，一些研究者希望 能夠藉由輻射感應驅動的啟動子，來表現治療基因以輔助放射線治療 的療效。在相關的研究報導中發現，當細胞暴露在游離輻射下，生長 相關一號基因 （Egr-1，growth response 1 gene）的轉錄會有活化 的現象。此外也有研究者發現，當細胞接受輻射照射後，會促進細胞 核因子κB （Nuclaer Factor-κB）的表現以及其與DNA的結合能力 (Weichselbaum, Hallahan et al. 1991; Weichselbaum, Hallahan et al. 1994)。藉由這些研究報告，基因治療的研究者建立了藉由輻射驅 動的啟動子。其中一種設計是利用早期生長相關基因 （Egr-1 ; 例如

Ziff/288）的啟動子與其特定DNA結合序列CC [ A / T ]6 GG (CArG)建

構而成 (Datta, Rubin et al. 1992)。Weichselbaum等研究者利用 Egr-1 的啟動子表現一種輻射敏感的細胞素：腫瘤壞死因子-α （Tumor necrosis factor–α）。在細胞實驗中，利用輻射線照射帶有此段輻 射調控表現載體的造血細胞株HL525，在接受輻射照射後，發現TNF-α 的表現量是原始細胞株的 2.4 倍 (Weichselbaum, Hallahan et al. 1994)。而在輔助放射線治療為目的的基因治療設計中，有研究者這將 治療用基因HSVtk藉由Egr-1 啟動子表現，發現帶有此輻射調控治療基 因片段的細胞對於ganciclovir的敏感度比起原始細胞更加敏感。所以 藉由輻射調控基因表現的系統，可以在活體外及活體內的實驗中被證 實具有基因調控的效果。不過，使用輻射線當作誘導物的方式並不是 一般人可以接受的一種治療方式，主要是因為輻射線本身對於正常細 胞一樣具有強的殺傷力。所以，除了使用放射線治療的病患之外，此 種基因調控方式並不理想。所以，接下來要介紹的第三種系統是利用 外加藥物的方式來調控基因表現。除了在調控方式上是比較能讓大部 分人接受外，還有在調控基因表現上的便利性。

三、 藥物感應驅動

在基因表現方式的研究中，有一種調控的系統是藉由一些小分子 與其相對應的轉錄因子作用，使得下游基因進行轉錄或是停止轉錄。 而這種模式的基因調控，大致上可以分為三類：1. 雙體藥物驅動模式 （dimerization on switch），2. 利用異體的基因調控來關閉基因表 現的系統模式 （allosteric off system），3. 利用異體的基因調控 來開啟基因表現的系統模式 （allosteric on system）。藉由這三大 類型的藥物調控系統，做為表現基因上的應用。接下來就逐段介紹這 3 大類的調控系統。 3-1：雙體藥物驅動模式 （dimerization on switch） 此種調控系統的概念，主要是應用了轉錄因子的主要特色：區域 獨立性。一般來說，轉錄因子的結構組成都含有兩個主要的區域，一 個是辨識啟動子上的特殊 DNA 序列進而座落於上的 DNA 結合區域。另 一個則是可與其它轉錄因子共同作用而使得轉錄啟始的活化區域。這 兩個區域除了可以獨立存在，而且也可以在分離的狀況下還能保有各 自原有的功能性。但是轉錄的啟始必須要兩個功能性區域同時存在才 可以啟動，缺一不行。所以有一種研究蛋白質相互作用關係的方式： 酵母菌雙結合系統 (yeast two-hybrid system)便是利用轉錄因子的

這種特性建構而成。同樣的，dimerization on switch 的建構方式便 是在特殊轉錄因子的這兩個功能性區域分別加入雙體藥物結合區域， 藉由添加的雙體藥物來使得兩個功能性區域結合在一起，轉錄便得以 進行。利用此種調控方式可以利用添加藥物的形式來達到開啟或是關 閉啟動子的作用。意指，如果想要使該啟動子開啟下游基因的表現時， 便加入完整的雙體藥物，使得轉錄因子的 DNA 結合區域跟活化區域可 以結合在一起而啟動了轉錄進行。而想要停止該基因表現時，便可以 加入過量的單體藥物，使得兩個區域的藥物結合區都達到飽和，因為 結合位內的都是單體藥物，所以兩個區域便無法相結合使得轉錄停止 (Ho, Biggar et al. 1996)。其作用機制如 （圖三）所示。

由於一些免疫抑制藥物便是屬於異構雙體 (heterodimerizers)，這

或許是個可以拿來利用於建構雙體藥物驅動的啟動子 (Belshaw, Ho et al. 1996)。一些研究者如 Rivera 等等 (Rivera, Clackson et al. 1996)利用 Rapamycin 驅動的基因調控便是屬於這種雙體藥物驅動的系 統。Rapamycin 調控系統主要是利用 Rapamycin 可以與 FKBP （FK506 binding protein 12），還有其相似蛋白質脂質磷酸激脢 FRAP

（FKBP-rapamycin-associated protein）相互結合的反應作為雙體藥 物調控的基礎。其中 FRAP 加上了與 Rapamycin 結合區域的修飾稱為 FRB。所以，利用 FKBP 結合轉錄因子的 DNA 結合區域和 FRAP 結合轉錄

因子的活化區域，由此構成 Rapamycin 驅動的基因調控系統。其建構 模式如下 （圖四）所示。 利用 Rapamycin 的調控系統中，對於報導基因的表現，其背 景值是相當低的，而當加入雙體藥物時，其表現量的增加顯著 （大約 10,000 倍）。為了測試其在基因治療上的應用性，有相關的文獻是利用 經實驗修飾後能穩定表現此調控系統的細胞 （其報導基因為人類生長

賀爾蒙 human growth hormone, hGH），將這群細胞移植到裸鼠的身上，

再經由靜脈注射 Rapamycin 之後 （劑量為 0.3-10mg/kg），發現在裸鼠

的血清中偵測到 hGH 的表現。同樣的，在沒有施打 Rapamycin 時，在 其血清中所偵測到的 hGH 是幾乎可忽略的 (Magari, Rivera et al. 1997)。所以，由以上這些實驗來看，這種模式的調控系統是個很好的 選擇。不過，因為 Rapamycin 以及其它相關的雙體藥物，會造成抑制 生物體免疫系統的現象，因為他們和原本生物體內的 FKBP 以及 FRAP 也會相互作用，雖然有些研究者經由修飾後的 Rapamycin 來解決這個 缺失，不過，還有其它種類的調控模式是可以再開發測試的，以下的 文章便介紹第二種模式。

3-2：利用異體的基因調控來關閉基因表現的系統模式 allosteric off system

最早被應用於這種調控模式的系統是由 Gossen 和 Bujard 所建構 的 Tetracycline (tet)基因關閉系統 (Gossen and Bujard 1992)。在 這個系統中，是利用了大腸桿菌的 tet repressor （TetR）接合皰疹 病毒的 VP16 活化區域作為真核轉錄因子的活化區。這個經由修飾後的 TetR 便稱為 tTA (transactivator)。此 tTA 會經由 TetR 的 DNA 結合 區域辨識 tet operator （tetO）中的特定序列後座落於上。在這個設 計下，在沒有加入 tetracycline 或是其衍生物時，tTA 會座落於 tetO 上，經由後方的 VP16 轉錄活化區，使得真核細胞的轉錄系統啟動，進 而開啟下游的基因。當加入了 tetracycline 或是其衍生物之後，便使 得其 DNA 結合區域產生構形上的改變而不再結合於 tetO 之上。因此， 原本開啟的基因轉錄，便隨著 tTA 的離開而停止。其調控模式如 （圖 五）所示。 在生物體的實驗中，因為 tetracycline 與其衍生物對於真核細胞 的毒性較低，所以可以經由加入動物飲用的水中來控制該實驗動物體 中的 tet-off 基因調控系統。對於這個系統的相關應用，不論生物體 外，或是生物體內的實驗，都有相當多的研究文獻已經被發表出來。 例 如 利 用 此 調 控 系 統 來 研 究 細 胞 週 期 調 控 蛋 白 的 作 用 (Lukas,

Petersen et al. 1996; Fan and Bertino 1997)，或是病毒蛋白質的 研究 (Floettmann, Ward et al. 1996; Cooke, Coates et al. 1997)。 在此調控系統建立後，有許多形式的修飾都被發展出來。例如：利用 組織特異性的啟動子來表現 tTA，使得此調控系統可以在特定的組織中 表現 (Yu, Redfern et al. 1996)。還有載體的多樣性建構，像是單 一質體 （single plasmid）(Schultze, Burki et al. 1996)，反轉 錄病毒質體 ( retrovirus plasmid) (Hofmann, Nolan et al. 1996)， 腺相關病毒質體 （adeno-associated virus plasmid） (Bertran, Miller et al. 1996)…等等。

雖然，這種形式的跨物種基因調控系統已經被許多研究者所修飾 改良。不過，這個系統仍然有一些不理想的缺失在應用於基因治療上。 1. 這個系統的『關閉』模式，並不是很適合於基因治療的應用。2. 這 個系統的高背景值也是一個很大的問題，高背景值的缺點會讓這個系 統 失 去 安 全 性 以 及 調 控 嚴 謹 性 的 基 本 要 求 (Gossen and Bujard 1992)。所以，還有最後一種調控模式是基於這樣的不適用性改良而 來，以下文章便加以介紹之。

3-3：利用異體的基因調控來開啟基因表現的系統模式 allosteric on system 在基因治療的應用上，利用藥物停止基因表現的模式是不理想 的，因為要停止治療基因的表現，就必須一直給予藥物，這樣子轉錄 才能夠停止。但是，要是利用這種調控系統而必須持續服用藥物，可 以想見的，這樣一定會對生物體的正常生理造成影響。所以，開發出 相反的調控機制 （意旨：投以藥物後，會使得下游基因表現出來，而 在停止給予藥物後則下游基因停止表現。）會是一個更能應用於往後 基因治療的基因調控模式。基於這個理念之下，一些研究者開發出幾 種不同的調控系統，例如：利用 mifepristone (RU486) (Burcin, Schiedner et al. 1999)，ecdysone systems (No, Yao et al. 1996)， 與 reverse tet (Deuschle, Meyer et al. 1995)藥物調控系統。以下， 就針對這三種已發展的調控系統分別介紹之。 3-3-1：mifepristone （RU486）調控型 這個基因調控系統的發展主要是因為研究黃體脂酮受體而來的。一 些研究者利用消除式突變法 (deletion mutation)將人類的黃體脂酮 受體 （proesterone receptor）突變掉。經過這個修飾之後，會使得 黃體脂酮受體不再與人體內的黃體脂酮或是其它內生性類固醇結合，

反而會與黃體脂酮的競爭藥物 RU486 結合 (Baulieu 1989)。這個意外 的發現，讓建構基因調控的研究者有了利用 RU486 做為基因調控誘導 物的構想。在這個系統中的人造轉錄因子是由酵母菌的轉錄因子 Gal4 的 DNA 結合區加上經由修改過的黃體脂酮受體 RU486 結合區，和皰疹 病毒的 VP16 活化區所建構而成 (Tsai, O'Malley et al. 1998)。其 作用的模式如 （圖六）所示。

利用這個基因調控系統的相關應用研究例如：利用轉殖基因小鼠 含有在肝臟區域性表現 （利用組織特異性的啟動子）RU486 調控系統， 經由此系統來表現人類生長賀爾蒙 (hGH)的基因 (Wang, DeMayo et al. 1997)。實驗結果也是如預期的，在沒有誘導物 RU486 的時候，在小鼠 血清中的 hGH 濃度相當低，但是在加入 RU486 之後，hGH 在血清中的濃 度便有顯著的增加。經由這些實驗的驗證，看來這個系統是個可以穩 定表現而且有效誘導的調控式基因表現系統。不過，RU486 是個會影響 類固醇類賀爾蒙調控生理現象的藥物，在啟動這個基因調控系統的同 時，也影響了該生物體的正常生理運行。所以，還是可以基於這個理 念來發展新的調控系統，但是得避免使用的誘導物會對於生物體產生 不良影響。接下來要介紹的便是基於這個想法下所產生的改良式建構。

3-3-2 ecdysone systems 在生物體內的基因調控中，有一種方式是利用類固醇類賀爾蒙與其 受 體 經 由 交 互 作 用 後 可 開 啟 或 是 關 閉 特 殊 基 因 的 轉 錄 動 作 (Yarranton 1992)。所以，如果經由上文所介紹的 RU486 來做為調控 基因的誘導物，那一定會影響著許多經由類固醇類賀爾蒙所控制的基 因調控。為了改善這個缺點，有一些研究者改用果蠅體內的類固醇 ecdysone 與其細胞核受體 （EcR）當作基因調控的部分。受體接合 ecdysone 的區域稱為 Ec-binding doman，將這個區域與其它轉錄因子 的 DNA 接合區，例如：大腸桿菌的 lexA 以及轉錄因子活化區，皰疹病 毒 的 VP16 融 合 在 一 起 而 成 為 一 個 新 的 人 造 調 控 型 轉 錄 因 子 (Christopherson, Mark et al. 1992)。也有一些改良過的轉錄因子 被發表出來，像是原本使用 lexA 的 DNA 結合區改成直接使用 EcR 做為 DNA 結合區。對於這個系統的生物體外實驗測試，也是具有低背景值以 及顯著的誘發基因轉錄的效果 （大約是 10,000 倍於背景直的表現量） (No, Yao et al. 1996)。不過，關於這個系統的動物體實驗就比較少 有研究來驗證這個系統應用於基因治療的效果以及可能的缺點。

3-3-3 reverse tet 調控系統

這個調控系統是根據原本的 Tet-off 系統所改良而來的。一些研 究者希望能夠藉由一些修改的方式，使得原本加入 tetracycline 的關 閉基因機制，變成開啟基因的模式。而主要的修改有兩種：第一種是 將 TetR 與強力的轉錄抑制區域結合在一起，例如：人類 Kox1 鋅指蛋 白 （zinc finger protein）的 Kruppel-associated box （KRAB）區 域』，使得這個新的融合蛋白會座落於基因上游約幾千個鹼基對左右 的位置，進而抑制了該基因的轉錄動作，在加入 tetracycline 之後則 會去除這個抑制的活性，恢復原始的轉錄。這種形式的調控最多可以 使得基因表現在開啟轉錄後是 50 倍於抑制時的基因表現量 (Deuschle, Meyer et al. 1995)。 第二種方式則是利用化學突變的方法對原始的 TetR 進行突變，從 突 變 的 TetR 中 篩 選 出 新 的 TetR ， 其 篩 選 的 條 件 是 只 有 加 入 Tetracycline 時，這個新的 TetR 才會座落於 tetO 中特定的結合區域 (Gossen, Freundlieb et al. 1995)。而利用這個新的 TetR，再將其 與 VP16 的 活 化 區 融 合 在 一 起 成 為 一 個 轉 錄 活 化 因 子 （transactivator）取名為 rtTA (reverse transactivator)。其作用 的模式如 （圖七）所示。

的，具有低背景值與高誘發的特性 （在加入 Tetracycline 後大約是 1,000 倍的報導基因表現量）。後來，有研究者發現到利用 tetracycline 的衍生物 doxycycline 誘導的基因表現狀況，在這個系統下更勝於原 本 tetracycline 誘導基因表現的能力。而在動物實驗方面，有研究者 將 此 調 控 系 統 放 入 小 鼠 中 成 為 基 因 轉 殖 小 鼠 ， 利 用 其 報 導 基 因 (luciferase)的表現來測試這個系統在活體中的基因調控性。而誘導 物則是使用了 doxycycline 取代原本的 tetracycline。加入誘導物的 方式是將 doxycycline 放入小鼠的飲用水中，經由小鼠飲用後來誘導 其調控系統的表現 (Kistner, Gossen et al. 1996)。實驗結果發現， 在 轉 殖 基 因 小 鼠 的 胰 臟 中 ， 其 報 導 基 因 的 表 現 量 在 有 誘 導 物 (doxycycline)存在的時候最多有 10,000 倍的增加。可以說是相當顯 著的調控性基因表現。另外也有研究者利用了 rtTA 這個基因調控系統 控制著分泌型的治療用蛋白質 (erythropoietin , EPO)。因為在小鼠 模型中，EPO 刺激了紅血球的生成 (Bohl, Naffakh et al. 1997)。在 這個實驗中作者利用了兩種不同的反轉錄病毒將這個調控系統與報導 基因放入小鼠體內，其中一種是帶有骨骼肌專一性表現的啟動子 （skeletal-muscle-specific promoter）用以表現 rtTA。另一種是帶 有報導基因 EPO，接在 tetO 的後方。也是如之前實驗所得到的結果， 在加入 doxycycline 之後，其報導基因的表現量有了 70 倍以上的增

加。此外，在這個實驗中也發現到，單獨一個質體 （tetO-EPO）存在 的時候，還是有基礎的報導基因表現，所以推論出 tetO 有基本的基因 表現量，對於這個有背景基礎值表現的缺點，有許多研究者也針對這 個部分做相關的修飾，希望能達到更低的背景值，以達到一個理想的 基因調控系統。 第二節 抗生素與抗藥性基因的調控 (β-lactamase 的調控機制) 在介紹完基因調控的系統後，我們可以知道有一種類型的基因調 控系統是藉由原核生物產生抗藥性所使用的基因調控機制而衍生出來 的。所以，我們也可以利用這個設計理念來建構我們的調控系統。其 中一種抗盤尼西林類抗生素的抗藥性機制，是被研究多年的一種抗藥 性機制，以下就針對這種類型的抗藥性調控機制做個介紹。 在各式各樣的抗藥性的菌種中，有一類是會對抗盤尼西林類抗生 素 的 家 族 (

Enterobacteriaceae

) 包 括

Citrobacter freunduii

，

Enterobacter cloacae

，

Morganella morganii

，

Serratia marcescens

， 還有

Yersinia enterocolitica

(Poirel, Guibert et al. 1999)

。

而 他們的抗藥性是源自於會產生β-lactamase 這種抗藥性蛋白質的因 素。有一些研究者的研究發現，這種抗藥性基因的表現，與該細菌的 細胞壁成分 muropeptide 有關係 (Jacobs, Huang et al. 1994)。根

據這些文獻的資料，盤尼西林類的抗生素會與細菌細胞膜上之盤尼西 林結合蛋白 (penicillin-binding proteins)結合，抑制了其原本的 功能而產生破壞細菌生長的能力。主要是因為細菌細胞壁之主要成分 為 peptidoglycan，主要的骨架由 peptidoglycan 聚合體以鏈狀交錯而 成。在這個鏈狀交錯的步驟中，需要盤尼西林結合蛋白作為胜肽轉移 酶 (transpeptidase)。故此蛋白被抑制則會影響細菌細胞壁之生成， 使其產生弱點。有的細菌因內部張力很大，會自行破裂。而乙內醯胺 與盤尼西林結合蛋白結合時也會使某些細菌產生自體溶解作用，而使 細菌死亡。而在細菌細胞壁弱化的過程中，會產生大量的細胞壁單元 體 muropeptide，這些單元體經由傳輸蛋白運進細菌體內後，會與調控 β -lactamase 表 現 相 關 的 轉 錄 因 子 ampR 作 用 。 ampR 在 沒 有 與 muropeptide 結合時，是以抑制子的型態抑制 ampC (β-lactamase)的 表現。當 muropepetid 與 ampR 結合時，便會使得 ampR 由原來的抑制 子型態轉變成活化子型態，此時 ampC 基因的轉錄才得以開始且使其活 化 ampC （β-lactamase）的基因轉錄。其作用模式如 （圖八）所示。 所以，這種抗盤尼西林類的菌種，是藉由 muropeptide 及調控型轉錄 因子 ampR 的相互作用來調控抗藥性基因 ampC (β-lactamase)的基因 表現狀況。

第二章：實驗策略與流程

第一節：利用β-lactamase 的基因調控機制來作為調控型啟動 子的基礎設計。 在β-lactamase 的基因調控研究中，經由之前的研究者的研究成 果，已經知道表現出β-lactamase 的基因是 ampC。在相關的研究中， 發現與調控 ampC 表現有關的轉錄因子是命名為 ampR 的調控蛋白，而 且這個轉錄因子會受到 muropeptide 這個誘導物的出現而有開啟基因 轉錄的作用。所以，我們便想利用 ampR 這個調控型的轉錄因子當作我 們製作調控型啟動子的主要調控原件。所以，我們從一些文獻中找到 ampR 的基因與 ampR 結合的 DNA 特殊序列 （我們稱之為 ARE，ampR response element） (Poirel, Guibert et al. 1999)。利用這參考 資料中所提供的兩樣原件，我們便可以設計一個調控型的啟動子原 型。其概念如 （圖九）所示。 雖然，我們可以利用這個在原核生物中的調控型轉錄因子來當作 我們調控型啟動子的原件。不過，我們的設計理念是希望這個調控系 統能夠應用於真核生物的轉錄系統中，所以，我們必須再加上其它的 原件使得這個系統可以在真核生物中表現應用。

第二節：利用 VP16 的修飾來作為真核轉錄系統的應用 在之前的研究者所建構的 Tetracycline 基因調控系統中，也是利 用了原核生物的轉錄因子 （TetR）來做為基因調控的主要原件，而他 們同樣的必須要把這個原核的轉錄系統轉換到真核生物的體內中作應 用 ， 所 以 當 時 他 們 使 用 了 皰 疹 病 毒 的 VP16 蛋 白 (Triezenberg, Kingsbury et al. 1988)，因為這個蛋白質具有真核生物的轉錄活化 區。所以，如果將這個部分與原本的 ampR 接和在一起的話，應該就可 以達到跨物種的目的。因此，我們便想修飾一下原本的設計，接合 VP16 於 ampR 的後方。其概念如 （圖十）所示。 利用這個修飾，相信可以將我們想利用的 ampR 調控型轉錄因子， 使用於真核生物的轉錄系統中。 第三節：建構雙質體的 muropeptide 誘導基因表現的調控系統 在 tetracycline 的調控系統建構中，建構者利用了雙質體的方 式，分別是一個帶有常態性表現調控型轉錄因子 （rtTA or tTA）的 質體，與一個帶有此調控型轉錄因子結合位置與報導基因的質體。經 由共同轉染後便可以在生物體外或是生物體內的實驗中測試調控系統 的功能性與誘發性。根據這個雙質體的建構已經被實驗證明是可行且 有效的測試該基因調控系統 (Gossen and Bujard 1992)，我們便想要

參考這個雙質體的模式，來建構我們所想建構的 muropeptide-ampR 的 基因調控系統。在我們建構的雙質體中，其一是藉由常態性表現型的 啟動子來表現調控型轉錄因子，另一個則是帶有轉錄因子結合位和報 導基因的質體。將這兩個質體共同轉染進入細胞中，其後加入誘導物 (muropeptide)來使得報導基因表現。實驗策略圖如 （圖十一）所示。 第四節：實驗流程 本實驗主要是要建構與測試利用 muropeptide-ampR 調控型轉錄因 子來作為基因調控的啟動子的可行性。如前所述，我們想用雙質體的 模式來建構這個調控型的啟動子。所以，我們首先要構築我們所要利 用的質體，含有以下五種類型 （圖十二）。 在構築完成這五個質體，經過定序確定序列無誤後，我們便準備 要進行活體外細胞轉染實驗。接下來的實驗便分為三個部分進行。第 一、將經由轉染常態型表現 ampR-VP16 質體的細胞經過抽取蛋白質的 步驟後，做以下的分析 1.測試此蛋白質表現的情況。2.測試此蛋白質 在誘導物的出現與否和其 DNA 結合位置的作用關係。第二、經由兩兩 質體配對後共同轉染，測試其共同細胞轉染造成的報導基因表現情 況。第三、在重複第二部份的共同細胞轉染後，加入誘導物來測試誘 導物對於這個調控系統的影響。此外，因為我們所使用的誘導物為細

菌細胞壁的成分，所以將來如果要應用於生物體時必須考慮其引起免 疫反應 （菌血症）的可能性。為此，我們在測試完誘導物對於調控系 統的影響後，也測試了此誘導物的免疫性反應。整個實驗架構流程簡 圖如 （圖十三）所示。

第三章 實驗材料與方法

第一節 ampR 基因的取得

一、 Morganella morganii subsp .morganii DNA 的取得 1-1：菌種的取得與培養

菌 種 的 選 擇 是 根 據 參 考 文 獻 中 所 應 用 的 菌 種 Morganella morganii subsp .morganii (Poirel, Guibert et al. 1999)，由財 團 法 人 食 品 工 業 發 展 研 究 所 生 物 資 源 保 存 及 研 究 中 心 （http://www.bcrc.firdi.org.tw）購買其菌株名為 B172 的菌株。培 養方式是利用 LB medium (10g Tryptone , 5g yeast extract , 10g Nacl / 1L)。

1-2：抽取 Morganella morganii subsp .morganii 的 DNA 首先，將原始菌種置入 5 ml的LB在 37℃搖菌培養箱中培養 18 小 時，過程中利用ampicillin (50μg/ml) 5μl加入其中以篩選具有抗 藥性的原始菌種。將 5ml的菌液分次以 13000rpm的速度離心於 1.5ml 的離心管中。去除上清液後以 467μl的ddH2O重新懸浮細菌，加入 30 μl 10％SDS及 3μl 20mg/ml proteinase K。混和均勻後，放在 37℃ 的水浴槽 1 小時。依次加入各 250μl的phenol與chloroform。蓋緊蓋 子後，上下搖晃使內容物均勻混和。將此混和物以 13000rpm的速度離

心 2 分鐘。將離心完的上清液移至新的 1.5ml的離心管中，再依次加入 各 250μl的phenol與chloroform。蓋緊蓋子，再次上下搖晃以混和均 勻。以 13000rpm的速度離心 2 分鐘。將上清液移至新的 1.5ml離心管 中，加入 1/10 體積的 3M sodium acetate。加入 3M sodium acetate 後再加入 0.6 倍體積的isopropanol，並輕輕混和內容物。將此混和物 在 4℃下以 12000rpm的速度離心 30 分鐘。移除上清液，加入 1ml 70 ％的酒精，再次於 4℃下以 12000rpm的速度離心 5 分鐘。移除上清液， 確定管內無 70％酒精殘留後以 100μl的無菌水將DNA溶解。 二、聚合酶連鎖反應以增幅 ampR 2-1：ampR 引子的設計

ampR 的序列尋找是藉由 NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov） 網站中搜尋 (Nucleotide 中搜尋 ampR 基因)而得到。我們尋找到的 ampR 基因其 accession number 為 AJ620115，基因序列由起始密碼開 始，而終於停止密碼。由此設計一對引子以增幅全長為 876 個鹼基對 的 ampR 基因。

引子序列如下表所示：

名稱 序列 TM

ampR 5＇

ampR 3＇

5＇- atcg ctgcag cgc cgc cgc cgt att cag-3＇55

2-2：聚合酶連鎖反應

將已抽好的Morganii DNA取約 1μg置入 0.2 ml的PCR專用微量離

心管中，接下來依次將 5＇ampR引子 （10uM），3＇ampR引子 （10uM），

10xBuffer，2.5mM dNTP，Taq polymerase，ddH2O加入其中。其總反應

內容物及使用量如下表所示：

Template 5＇primer 3＇premer 10xbuffer 2.5mMdNTP Taq ddH2O Total

3μl 1μl 1μl 5μl 4μl 1μl 35μl 50μl

將上述配製好的 0.2ml 微量離心管置入 PCR 反應機中以下列的反 應條件開始聚合酶連鎖反應：

三、洋菜膠電泳分析

洋菜膠電泳分析是以 0.8～1.5％之洋菜膠、1 倍 TAE buffer 電泳 液，置入水平電泳槽中。使用 100 伏特開始電泳 50 分鐘，電泳結束後 將洋菜膠浸泡於 0.5μg/ml 之 ethidium bromide 溶液中，染色 10-15 分鐘，再於蒸餾水中退染 10 分鐘。最後將洋菜膠取出，使用 Uni-photo gel image system (EZ lab)照相系統，在波長 365 nm 之紫外光下觀 察增幅產物，利用 marker 觀測產物大小，並照相及存檔。

四、PCR 產物純化 我們使用 （Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit）來純化我們 經由PCR反應後的產物。首先先取binding buffer，其取用量依照該PCR 產物體積的 5 倍量加入欲純化的PCR產物中。混和均勻後將此混和液移 至kit所附的spin column-collection tube中 （先將spin column與

collection tube結合在一起）。以 12000～14000rpm的速度離心 30 秒

鐘～1 分鐘。將離心至collection tube中的混和液移除，重新裝回spin column後加入 700μl washing solution，加完之後以 12000～14000rpm 的速度離心 1 分鐘。將離心至collection tube中的washing solution 移除，重新裝回spin column後再次離心。離心也是以 12000～14000rpm 的速度離心 3 分鐘來移除殘留的washing solution。移除collection

tube，將spin column換至新的 1.5 ml離心管中。加入 30μl～50μl 的ddH2O。以 12000～14000rpm的速度離心 1 分鐘將已溶好PCR產物的 ddH2O離心至 1.5ml的離心管中。完成之產物以洋菜膠電泳分析其DNA片 段和測試此產物的吸光值 （OD260）以定DNA的濃度。 第二節：表現型 （expression）與反應型 (response)質體構築 一、表現型質體構築 1-1：表現 ampR-VP16 質體的建構

利用商品化實驗套組 POST-I TA cloning Kit 將 ampR 接合至 POST-I 的質體上經由 taq 這個聚合酶所完成的聚合酶連鎖反應物，在 其末端會隨機的加上核甘酸，尤其以加上 A 的機率最高。利用這個特 性，便有特殊的質體 （POST-I）可將我們已經經由 taq 增幅後的 ampR 基因，接合在其設計好的 T 端。

1-1-1：ampR 片段黏合

取一 500μl的微量離心管，分別將 10mM的ATP，2xBuffer，T4

ligase，ddH2O，還有POST-I質體與ampR純化後的產物依 1：3 的比例置

入其中以進行DNA黏合反應。其總反應內容物及使用量如下表所示：

POST-I ampR 2x Buffer 10mM ATP T4 ligase ddH2O Total

10μl

完成反應物後，將此 500μl 的微量離心管放置於 16℃低溫水域槽中約 12～16 小時後進行質體轉型。

1-1-2：質體轉型

取出 DNA 黏合後的產物約 3~5μl 加入 POST-I Kit 中所附之 competent cell 中 （competent cell 先由-80℃冰箱中拿出後置於冰 盒上退冰，待 competent cell 由固態變成溶融態後才進行實驗），用 手指輕彈管壁使質體與細胞混合均勻。放置在冰上作用 30 分鐘，而後 將此含有此質體與 competent cell 之微量離心管置於 42℃水浴加熱器 中進行 Heat shock 30 秒鐘，等待 30 秒鐘到後馬上將之取出，放回冰 上靜置 2 分鐘。加入 250μl 不含 Kanamycin 之 LB medium，在 37℃之 震盪保溫器中震盪 1 小時。將 1 個含 50μg/ml Kanamycin 之 LB 培養 基先放在 37℃之震盪保溫器中回溫 30 分鐘。1 小時後取出震盪完成之 菌液，加入 100μl 於事先回溫之培養基中，將菌液塗抹均勻後培養 17-20 小時。隔日再進行挑菌即可。

隔日在培養基挑選數個菌落置於 3 ml含Kanamycin （濃度 30μ

g/ml）之LB medium中，於 37℃震盪保溫器中進行震盪 （200rpm），培

養 17-20 小時後收取菌液。每一管菌液取 0.1μl作為模板，之後再依 次加入SP6 及T7 的primer各 1μl，dNTP, Taq buffer, ddH2O，以及Taq

（反應總體積為 50μl）進行PCR反應，其反應循環順序為：94℃ 10 分鐘 （用以打破細菌之細胞壁，使其基因外露），94℃ 1 分鐘，50℃ 0.5 分鐘，72℃ 1 分鐘，進行 34 個循環增幅，最後以 72℃ 5 分鐘將未完 成之序列完成。完成之產物進行洋菜膠體電泳，在此進行PCR可幫助我 們初步確認目標基因是否成功插入載體中。 1-1-4：質體 DNA 之小量分離法

用Gene-spinTM _{Miniprep purification kit （波仕特，台灣，中}

華民國）。取經PCR確認的 2.5 ml隔夜培養之菌液置於 1.5 ml之微量離 心管中，分次以高速離心機離心 13000 rpm在 4℃下各離 1.5 分鐘。移 除上清液。取 200μl Solution I懸浮沈澱之菌塊。加入 200μl Solution II，翻轉微量離心管 6-8 次，而後置於室溫 5 分鐘。加入 200 μl Solution III，同樣翻轉微量離心管 6-8 次，而後置於冰上作用 5 分鐘。以 13000 rpm的速度在 4℃下離心 5 分鐘。將套組中所附之膠體 管柱安插入 1.5 ml之收集管中，將離心後所得之上清液小心加入管柱

中，以 13000 rpm的速度在 4℃下離心 1 分鐘。將收集管中之廢液丟棄， 再重新和膠體管柱組合。加入 700μl之Wash solution，以 13000 rpm 的速度在 4℃下離心 1 分鐘以清洗管柱。移除廢液後再將此膠體管柱與 收集管之組合體，以 13000 rpm的速度在 4℃下離心 3 分鐘，以將管柱 中多餘的水分一併移除。事先將已滅菌之ddH2O加溫至 60-70℃，將膠 體管柱移至一新的 1.5 ml微量離心管中，加入 20-50μl之加溫ddH2O， 以 13000 rpm的速度在 4℃下離心 1 分鐘，以分離出質體DNA。利用OD260 測試其DNA濃度。此小量之質體DNA用以供作後續限制酶切割作用及定 序之用。 1-1-5：限制酶切割 使用限制酶切割反應進一步確認基因是否已插入載體中。取一 0.5ml微量離心管，加入 1μg之質體DNA，50 mg/ml之BSA 0.2μl，2.0 μl之 10X buffer，再加入 0.5μl (5U)之限制酶EcoR I，及PST I

（Promega, Madison, USA），反應總體積為 20μl，不足的量則以滅菌

之ddH2O補齊。短暫離心後置於 37℃之水浴加熱器中作用 3 小時。該反

應產物以 1.5％洋菜膠體電泳進行分析。

將經過 PCR 及限制酶切割反應初步確認構築完成之質體，從其中 挑選出 3 個交與波仕特公司進行定序之工作 （台灣，中華民國）。完 成後將存成電腦檔「筆記本」形式之基因序列複製。利用 AlignX 軟體 （vector NTI 中序列比對工具軟件），將定序後的結果與原先在 NCBI 搜尋到的序列做比對。

1-1-7：質體 DNA 之大量分離法

使用 Nucleobond AX 大量質體 DNA 分離套組 （Macherey-Nagel,

Oensingen, Switzerland），將隔夜培養之 100ml 菌液 （已經經由定 序確認後）加入高速離心管中。於 4℃下以 8000 rpm 的速度離心 15 分鐘，而後倒掉上清液。將離心後所得之菌塊以 S1 buffer 4ml 懸浮 完全 （S1 buffer 在使用前需先加入套組中所附之冷凍乾燥 RNase， 加入 RNase 之 S1 buffer 需存放於 4℃冰箱保存）。加入 4ml 之 S2 buffer，立刻上下翻轉高速離心管 6～8 次，然後靜置在室溫中 5 分鐘, 再加入 4ml S3 buffer，翻轉離心管 6～8 次，靜置於冰上 5 分鐘。在 4℃下以 12000 rpm 的速度離心 30 分鐘。在開始離心步驟後，開始將 N2 buffer 2.5ml 加到膠體管柱中用以平衡，而後將離心完成之上清液 全部加入膠體管柱中，任其自然通過管柱。以 N3 buffer 10ml 流洗管 柱，並再重複此動作一次。將流洗完全之膠體管柱以套組中之圓形膠

環固定於新的 50 ml 離心管內，加入 5 ml 之 N5 buffer 將管柱中之質 體 DNA 流洗出來。將流洗出之質體 DNA 分裝至 1.5 ml 之微量離心管內， 每管放 0.83 ml，總計 6 小管，加入 0.7-0.8 體積之 Isopropanol （Sigma,

Steinheim, Germany），在 4℃下以 13000 rpm 的速度離心 30 分鐘。在

Laminar flow 中將 Isopropanol 倒掉，此時應可見沈澱於管底之 DNA 團塊，之後每管加入 1ml 之 70％無菌酒精懸浮質體 DNA。再次在 4℃下 以 13000 rpm 的速度離心 10 分鐘。在 Laminar flow 中將上層酒精液 丟棄，倒放微量離心管令其靜置 5 分鐘以風乾質體 DNA。之後以 20μl 之無菌二次蒸餾水溶解 DNA，而後取 1μl 溶解完全之質體 DNA 稀釋 60 倍，以分光光度計 （Eppendorf, Hamburg, Germany）測其濃度。分 離完成之質體 DNA 置於-20℃冰箱中保存。

1-1-8︰VP16 的引子設計與聚合酶連鎖反應

VP16 的 轉 錄 活 化 區 的 模 板 序 列 是 由 市 售 商 品 化 的 質 體 pRevTet-On™ Vector （BD Biosciences）所得到。引子設計也是藉由 此質體的序列資料所得到。

名稱 序列 TM VP16 5＇ 5＇-ATCGCTGCAG TCC GCG TAC AGC CGC GCG-3＇ 57 VP16 3＇ 5＇-ATCGCTCGAG CTA CCC ACC GTA CTC GTC AA-3＇ 55

藉由聚合酶連鎖反應將 VP16 的基因片段增幅出來。其反應流程 為 94℃ 45 秒，55℃ 45 秒，72℃ 1 分鐘，進行 34 個循環增幅，最後 以 72℃ 5 分鐘將未完成之序列完成。最後將 PCR 所得到的產物用 1.5 ％洋菜膠進行電泳分析。 1-1-9：接合 VP16 於 POST-I-ampR 中 利用Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化好VP16 的PCR產物 後，再經由 1.5％洋菜膠進行電泳分析其DNA片段及測試OD260 以確定 其DNA濃度。將已經確認好之純化後的VP16 產物，還有已經經由大量DNA 分離後的POST-I-ampR產物進行限制酶切割，以 0.5μl (5U)之限制酶 切割 1μg DNA的比例進行反應。在此所利用的限制酶為PstI及XhoI。 在限制酶反應完成後分別以 1.5％，0.8％洋菜膠電泳分析進行DNA片段 確認。確認完成後再以Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化此DNA 產物。經由測試其OD260 來確定DNA的濃度。接下來要進行DNA接合的動 作。將經由限制酶切割並純化後的POST-I-ampR，及VP16 DNA片段以 1： 3 的比例進行DNA接合的反應。將配製好的反應物置於 16℃低溫水域槽 中約 12～16 小時後進行質體轉型。接下來經由菌液PCR，小量質體DNA

分離，限制酶切割確認後送定序以確認接合的狀況與序列的正確性。 完成確認的步驟後，將此質體以大量質體DNA分離的方式保存於-20℃ 冰箱之中。 1-1-10：linker 的引子設計 在完成 POST-I-ampR-VP16 的質體後，為了增加 ampR 與 VP16 之間 的自由度，避免 VP16 轉錄活化區因為 ampR 的結構影響了其原本的活 性。所以在 ampR 與 VP16 之間設計一個可使結構自由度變高的片段 （linker）。此 linker 的設計是由 3 個 Gly 與一個 Ser 重複三次所組 成的片段所構成，其結構如下所示：

Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser 根據這個片段的構成，轉寫成 DNA 序列以設計成引子。 引子序列如下所示：

名稱 序列 TM

linker 5＇ 5＇-ggATATC ggA ggT ggg TCA ggT ggA ggC TCg ggC ggg ggT TCC CtgCA-3＇

76.4 linker 3＇ 5'- ACg TCC TAT AgC CTC CAC CCA gTC CAC CTC CgA gCC

CgC CCC CAA ggg-3＇

76.4

將兩種引子以 1：1 的比例混合後，加熱至 95℃10 分鐘。其後置 於室溫下使其回到室溫。在完成這個步驟後，這兩股引子便可以成為 一段雙股 DNA。

將已經經由大量DNA分離後的POST-I-ampR-VP16 產物進行限制酶切 割，以 0.5μl (5U)之限制酶切割 1μg DNA的比例進行反應。在此所 利用的限制酶為PstI。在限制酶反應完成後以 0.8％洋菜膠電泳分析進

行DNA片段確認。確認完成後再以Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit 純化此DNA產物。經由測試其OD260 來確定DNA的濃度。接下來要進行DNA 接合的動作。將經由限制酶切割並純化後的POST-I-ampR-VP16，及 linker DNA片段以 1：3 的比例進行DNA接合的反應，將配製好的反應 物置於 16℃低溫水域槽中約 12～16 小時後進行質體轉型。接下來經由 菌液PCR，小量質體DNA分離，限制酶切割確認後送定序以確認接合的 狀況與序列的正確性。完成確認的步驟後，將此質體以大量質體DNA分 離的方式保存於-20℃冰箱之中。 1-1-12：設計新引子,利用聚合酶連鎖反應將 ampR-linker-VP16 增 幅出來 完成 ampR-linker-VP16 的序列後，要利用 CMV promoter 將此段 基因在真核細胞表現出來。因此，設計了新的 ampR 5＇端引子 （kpnI） 限制酶切位。 名稱 序列 TM

AmpR KpnI 5＇ 5＇-ATC ggg TAC CAT ggT Cag Acg TTA TCT CCC-3＇ 69.5 利用此段引子與 VP16 3＇端引子的搭配，經由聚合酶連鎖反應將 ampR-linker-VP16 增幅出來。其反應流程為 94℃ 45 秒，55℃ 45 秒， 72℃ 3 分鐘，進行 34 個循環增幅，最後以 72℃ 5 分鐘將未完成之序 列完成。最後將 PCR 所得到的產物用 1.5％洋菜膠進行電泳分析。 1-1-13：接合 ampR-linker-VP16 於 PC3.1 骨架質體上 利用Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化好

ampR-linker-VP16 的PCR產物後，再經由 1.5％洋菜膠進行電泳分析其 DNA片段及測試OD 260 以確定其DNA濃度。將已經確認好之純化後的 ampR-linker-VP16 產物，還有已經經由大量DNA分離後的PC3.1 產物進 行限制酶切割，以 0.5μl (5U)之限制酶切割 1μg DNA的比例進行反 應。在此所利用的限制酶為KpnI及XhoI。在限制酶反應完成後分別以 1.5％，0.8％洋菜膠電泳分析進行DNA片段確認。確認完成後再以 Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化此DNA產物。經由測試其OD 260 來確定DNA的濃度。接下來要進行DNA接合的動作。將經由限制酶切 割並純化後的PC3.1，及ampR-linker-VP16 DNA片段以 1：3 的比例進 行DNA接合的反應，將配製好的反應物置於 16℃低溫水域槽中約 12～ 16 小時後進行質體轉型。接下來經由菌液PCR，小量質體DNA分離，限

制酶切割確認後送定序以確認接合的狀況與序列的正確性。完成確認 的步驟後，將此質體以大量質體DNA分離的方式保存於-20℃冰箱之中。

1-2：ampR 表現型質體的構築

利用設計好的ampR引子 (ampR KpnI 5＇,ampR 3＇)利用PC3.1 ampR-linker-VP16 質體為模板進行聚合酶連鎖反應將ampR增幅出來。 其反應流程為 94℃ 45 秒，55℃ 45 秒，72℃ 2 分鐘，進行 34 個循環 增幅，最後以 72℃ 5 分鐘將未完成之序列完成。最後將PCR所得到的

產物用 1.5％洋菜膠進行電泳分析。在確認過後,利用Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化好ampR的PCR產物，再經由 1.5％洋菜膠進行電 泳分析其DNA片段及測試OD 260 以確定其DNA濃度。將已經確認好之純 化後的ampR產物，還有已經經由大量DNA分離後的PC3.1 產物進行限制 酶切割，以 0.5μl (5U)之限制酶切割 1μg DNA的比例進行反應。在 此所利用的限制酶為KpnI及XhoI。在限制酶反應完成後分別以 1.5％，

0.8％洋菜膠電泳分析進行DNA片段確認。確認完成後再以Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化此DNA產物。經由測試其OD 260 來確定 DNA的濃度。接下來要進行DNA接合的動作。將經由限制酶切割並純化 後的PC3.1，及ampR DNA片段以 1：3 的比例進行DNA接合的反應，將配 製好的反應物置於 16℃低溫水域槽中約 12～16 小時後進行質體轉

型。接下來經由菌液PCR，小量質體DNA分離，限制酶切割確認後送定 序以確認接合的狀況與序列的正確性。完成確認的步驟後，將此質體 以大量質體DNA分離的方式保存於-20℃冰箱之中。 二、反應型質體的建構 2-1：SV40-ARE-hrGFP 的構築 2-1-1：SV40 的引子設計與聚合酶連鎖反應 利用 pAsRed-N1 的質體序列資料設計 SV40 的引子。 名稱 序列 TM

SV ori 5＇ 5＇-ATC GCT CGA GG TGT GGA AAG TCC CCA GG-3＇ 67.9 Sv ori 3＇ 5＇-ATC GAC TAG TGG CCT CCA AAA AAG CCT CCT-3＇ 64.2

將質體 pAsRed-N1 當作模板，藉由聚合酶連鎖反應將 SV40 的基因 片段增幅出來。其反應流程為 94℃ 45 秒，55℃ 45 秒，72℃ 1 分鐘， 進行 34 個循環增幅，最後以 72℃ 5 分鐘將未完成之序列完成。最後 將 PCR 所得到的產物用 1.5％洋菜膠進行電泳分析。完成反應後將 PCR 產物進行純化的動作。 2-1-2：接合 SV40 到 POST-I 上

利用Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化好SV40 的PCR產物 後，再經由 1.5％洋菜膠進行電泳分析其DNA片段及測試OD 260 以確定 其DNA濃度。將已經確認好之純化後的SV40 產物，還有已經經由大量DNA 分離後的POST-I產物進行限制酶切割，以 0.5μl (5U)之限制酶切割 1 μg DNA的比例進行反應。在此所利用的限制酶為Hind III及SpeI。在 限制酶反應完成後分別以 0.8％洋菜膠電泳分析進行DNA片段確認。確 認完成後再以Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化此DNA產物。 經由測試其OD 260 來確定DNA的濃度。接下來要進行DNA接合的動作。 將經由限制酶切割並純化後的POST-I，及SV40 DNA片段以 1：3 的比例 進行DNA接合的反應，將配製好的反應物置於 16℃低溫水域槽中約 12 ～16 小時後進行質體轉型。接下來經由菌液PCR，小量質體DNA分離， 限制酶切割確認後送定序以確認接合的狀況與序列的正確性。完成確 認的步驟後，將此質體以大量質體DNA分離的方式保存於-20℃冰箱之 中。 2-1-3：hrGFP 基因的取得 首先利用其它已經含有 hrGFP 的質體 （NF-κB-hrGFP），利用限 制脢 (XbaI)切割後，利用洋菜膠確認切割狀況及 DNA 片段大小，此 hrGFP DNA 片段經由切膠回收後 （QIAquick GelExtraction Kit）最

後將此純化後所得到的產物用 1.5％洋菜膠進行電泳分析。 2-1-4：接合 hrGFP 至 SV40 之後 將已經確認好之純化後的hrGFP產物，還有已經經由大量質體DNA 分離後的POST-I-SV40 產物進行限制酶切割，以 0.5μl (5U)之限制酶 切割 1μg DNA的比例進行反應。在此所利用的限制酶為XbaI。在限制 酶反應完成後分別以 0.8％洋菜膠電泳分析進行DNA片段確認。確認完 成後再以Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化此DNA產物。經由 測試其OD 260 來確定DNA的濃度。接下來要進行DNA接合的動作。將經 由限制酶切割並純化後的POST-I-SV40，及hrGFP DNA片段以 1：3 的比 例進行DNA接合的反應，將配製好的反應物置於 16℃低溫水域槽中約 12～16 小時後進行質體轉型。接下來經由菌液PCR，小量質體DNA分離， 限制酶切割確認後送定序以確認接合的狀況與序列的正確性。完成確 認的步驟後，將此質體以大量質體DNA分離的方式保存於-20℃冰箱之 中。 2-1-5：ARE 的引子設計

利用參考文獻(Poirel, Guibert et al. 1999)的資料設計 ARE 的 互補引子。

名稱 序列 TM

ARE 5＇ 5＇-ATC GAA TTC CCT GTA AGT TTT TCT TTA GGC TCT TGT TAT AAT TAA CCG ACG CGT GAA TTC ATC-3＇

69.2

ARE 3＇ 5＇-GAT GAA TTC ACG CGT CGG TTA ATT ATA ACA AGA GCC TAA AGA AAA ACT TAC AGG GAA TTC GAT-3＇

69.2 將兩種引子以 1：1 的比例混合後，加熱至 95℃10 分鐘。其後置 於室溫下使其回到室溫。在完成這個步驟後，這兩股引子便可以成為 一段雙股 DNA。 2-1-6：接合 ARE 於 SV40-hrGFP 之間 將已經經由大量DNA分離後的POST-I-SV40-hrGFP產物及ARE DNA片 段進行限制酶切割，以 0.5μl (5U)之限制酶切割 1μg DNA的比例進 行反應。在此所利用的限制酶為EcoRI。在限制酶反應完成後分別以 0.8 ％洋菜膠電泳分析進行DNA片段確認。確認完成後再以Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化此DNA產物。經由測試其OD 260 來確定 DNA的濃度。接下來要進行DNA接合的動作。將經由限制酶切割並純化 後的POST-I-SV40-hrGFP，及ARE DNA片段以 1：3 的比例進行DNA接合 的反應，將配製好的反應物置於 16℃低溫水域槽中約 12～16 小時後進

行質體轉型。接下來經由菌液PCR，小量質體DNA分離，利用限制酶 （MluI及XhoI）切割來確認ARE接合的狀況。完成後送定序確認其序列 無誤。完成確認的步驟後，將此質體以大量質體DNA分離的方式保存於 -20℃冰箱之中。 2-2：ARE-hrGFP 質體的構築 2-2-1：新 ARE 的引子設計 利用已經帶有 hrGFP 的骨架質體 POST-I-hrGFP，找尋可用的限制 酶切割位來設計 ARE 的引子 (HindIII，BglII)。 名稱 序列 TM

5＇-bglII 1copy 5＇-gAT CTT CgA CTA gTC CTg TAA gTT TTT CTT TAg gCT CTT gTT ATA ATT AAC CgA-3＇

71.69

3＇-bglII 1copy 5＇-AgC TTC ggT TAA TTA TAA CAA gAg CCT AAA gAA AAA CTT ACA ggA CTA gTC gAA-3＇

71.69

將兩種引子以 1：1 的比例混合後，加熱至 95℃10 分鐘。其後置 於室溫下使其回到室溫。在完成這個步驟後，這兩股引子便可以成為 一段雙股 DNA。

將已經經由大量質體DNA分離後的PC3.1-hrGFP產物及ARE DNA片段 進行限制酶切割，以 0.5μl (5U)之限制酶切割 1μg DNA的比例進行 反應。在此所利用的限制酶為HindIII及BglII。在限制酶反應完成後 分別以 0.8％及 1.5％的洋菜膠電泳分析進行DNA片段確認。確認完成 後再以Gene-SpinTM

1-4-3 DNA Extration Kit純化此DNA產物。經由測 試其OD 260 來確定DNA的濃度。接下來要進行DNA接合的動作。將經由 限制酶切割並純化後的PC3.1-hrGFP，及ARE DNA片段以 1：3 的比例進 行DNA接合的反應，將配製好的反應物置於 16℃低溫水域槽中約 12～ 16 小時後進行質體轉型。接下來經由菌液PCR，小量質體DNA分離，其 後利用限制脢SpeI及XhoI進行確認接合的狀況。完成後送定序確認其 序列無誤。完成確認的步驟後，將此質體以大量質體DNA分離的方式保 存於-20℃冰箱之中。 第三節：質體轉染 3-1：seeding cells 本 實 驗 所 欲 進 行 轉 染 （ Transfection ） 的 哺 乳 類 細 胞 株 為 BALB/3T3 （ATCC No.CCL-163）。先將 25T flask 中之BALB/3T3 的細 胞培養液 （含 10％FBS之DMEM）倒掉，加入 3 ml之 1 X PBS潤洗細胞