以臭氧降解靈芝幾丁質製備幾丁寡醣之研究

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告

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※ 以臭氧降解靈芝幾丁質製備幾丁寡醣之研究

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計畫類別：■個別型計畫

□整合型計畫

計畫編號：NSC 90－2214－E－002－035－

執行期間：

90 年

8 月 1 日至 91 年

7 月

31 日

計畫主持人：葉安義

共同主持人：

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

執行單位：國立台灣大學食品科技研究所

中

華

民

國

91 年

10 月

29 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

以臭氧降解靈芝幾丁質製備幾丁寡醣之研究

Preparation of chito-oligosaccharides by degrading

Ganoderma

chitin using ozone

計畫編號：NSC 90-2214-E-002-035

執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日

主持人：葉安義 教授 國立台灣大學 食品科技研究所

一、中文摘要 本研究是以臭氧降解幾丁聚醣製備幾丁寡 醣，以最具生理活性的幾丁寡醣（DP＝6）產率為 指標，探討降解反應條件（溫度、臭氧劑量）對 水解率的影響，於實驗中監測 pH 值，檢測產物是 否有羧基的產生。並進一步探討以臭氧降解靈芝 殘渣，生產幾丁寡醣之可行性，期能提高其價值。 高溫（80℃）下，以不同臭氧劑量（65.1 mg/min、 78.3 mg/min、104.8 mg/min）降解靈芝殘渣，結 果顯示臭氧可降解靈芝殘渣，但靈芝殘渣成分複 雜，臭氧降解靈芝殘渣之生成物則需進一步鑑定。 關鍵詞：臭氧、靈芝殘渣、幾丁聚醣、 幾丁寡醣、氧化降解 Abstr act:

This study was to investigate the method of degrading chitosan using ozone to produce

chitooligosaccharides. The yield of

chitooligosaccharides (DP=6) was used as the index for adjusting reaction conditions. Effects of reaction temperature and ozone dose on the yield of chitooligosaccharides (DP=6) were evaluated. The formation of carboxylic group was observed as the drop in pH during experiments. In this study, the feasibility of degrading Ganoderma residue by

ozone to produce chitooligosaccharides was also evaluated. Commercial Ganoderma residue was

reacted with ozone (65.1 mg/min,78.3 mg/min,104.8 mg/min) at high temperature (80 ℃ ). The data showed that it was possible to degrade Ganoderma

residue by using ozone. The identification of the degraded products needs further studies.

Keywor ds: ozone, Ganoderma residue,

chitosan, chitooligosaccharides, oxidative degradation 二、緣由與目的 幾丁質(chitin)和幾丁聚醣(chitosan)廣 泛分布於甲殼類與真菌細胞壁中，如蝦、蟹等 的外殼，魷魚軟骨，以及靈芝等，是自然界中， 含量僅次於纖維素(cellulose) 的多醣類。幾 丁聚醣可由幾丁質經去乙醯化而獲得，許多文 獻指出，其具有許多特殊之生理特性，如增加 免疫能力及抗菌性[1]_{，可應用於食品、農業、醫} 療及廢水的處理上，但幾丁質與幾丁聚醣不溶 於水，因此應用上受到限制。 甲殼類（如蝦、蟹等）之外殼，容易取得 且價格低廉，是目前幾丁質的主要來源。近年 來，真菌產品市場持續成長，所產生的廢棄菌 體也增加，廢棄的菌體細胞壁結構較蝦殼鬆 軟，且含有豐富的幾丁質或幾丁聚醣，而蛋白 質含量低，不易腐敗，衛生條件較佳，可於較 溫和的條件（較少量的酸液、鹼液，較低的溫 度）下製備幾丁質或幾丁聚醣，有助於環保， 且可生產具生理活性的產品，所以自靈芝殘渣 製備幾丁質應是可行的方法。 N-乙醯幾丁寡醣和幾丁寡醣是幾丁質或幾 丁聚醣經水解所得聚合度(DP)為 2-10 之寡醣 類，其分子量小，溶於水，作為免疫治療藥劑 時，無水溶性的問題。寡醣具有多項生理活性， 如活化吞噬細胞及抑菌性，其中，又以 DP 為 6-7 之寡醣最具生理活性，具有高附加價值[2]_。製備 方法則是業界與學者關切之焦點，常用的化學

法是利用高濃度的強酸水解，但難以控制寡醣 種類，所得產品多是 DP 為 2-3 的寡醣，且高濃 度強酸溶液的使用，產生廢液處理問題；酵素 具有較高的選擇性，但由於產率太低[3]，目前尚 無法商業化，低廢液、高產率的水解方法是獲 得 N-乙醯幾丁寡醣和幾丁寡醣的理想途徑。 臭氧是一種強氧化劑[4]，能打斷一些共價 鍵，產生降解的功能，且廢液量少，目前常用 於水及空氣之消毒、淨化工程及廢水處理，以 及有機物之氧化降解。靈芝殘渣不但是幾丁質 的良好來源，且含有益健康的β-1,3 glucan， 目前被視為廢棄物，實在是一種浪費，應可作 為生產幾丁寡醣的原料，以臭氧降解有機物是 環保工業中常用的技術，如何利用該技術，以 生產高附加價值的幾丁寡醣是本研究的目的。 本研究擬以一年的時間，建立以靈芝殘渣製備 幾丁質的經濟方法，並探討反應溫度與 pH 值對 臭氧降解幾丁質的影響，由臭氧的消耗量與幾 丁寡醣的產生量探討反應的型態，並由幾丁寡 醣的產率評估臭氧降解的可行性，以供業界參 考。 三、材料與方法 首先以幾丁聚醣替代靈芝殘渣，觀察臭氧 (SG-01A 臭氧產生機，購自日本住友精密工業公 司)降解成效，秤取 40 g 幾丁聚醣(購自挪威 Primex 公司，分子量：10 萬至 30 萬，其去乙醯 度經膠態滴定法[5]_{測定為大於 99％。購買規格：1} ％市售蝦殼幾丁聚醣溶於 1％醋酸溶液，在 25℃ 30rpms 下，溶解度>99.9％)，溶於 4000 mL 的 1 ％(v/v)醋酸(購自台灣皓峰公司)水溶液中，在不 同臭氧劑量及不同溫度下進行臭氧降解反應，反 應溫度設定為 10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、 70 ℃ 、 80 ℃ 、 90 ℃ 與 加 入 不 同 臭 氧 劑 量 9.27 mg/min 、 15.6 mg/min 、 42.1 mg/min 、 55.3 mg/min、65.1 mg/min、78.3 mg/min、104.8 mg/min 分別於不同時間（0 6 小時）取樣，測定降解產 物之 pH 值、黏度、顏色變化及還原醣量，經透析 （透析膜孔徑 Mw100），加壓過濾（過濾膜孔徑 Mw3000），濾餅烘乾秤重，濾液減壓濃縮，經 HPLC(acetonitrile：H2O＝60:40)測定幾丁寡醣 的生成量與聚合度的分佈。確定臭氧可氧化降解 幾丁聚醣後，秤取 40 g 靈芝殘渣(由台糖公司提 供)溶於 4000 mL 的 1％(v/v)醋酸水溶液中，在 80℃下以臭氧劑量 65.1 mg/min、78.3 mg/min、 104.8 mg/min 進行臭氧降解反應，分別於不同時 間（0 6 小時）取樣，測定降解產物之 pH 值，經 透析（透析膜孔徑 Mw100），加壓過濾（過濾膜 孔徑 Mw3000），濾餅烘乾秤重，濾液減壓濃縮， 經 HPLC(acetonitrile：H2O＝70:30)測定幾丁寡 醣的生成量與聚合度的分佈。 四、結果與討論 1. 低溫下臭氧降解幾丁聚醣 a.為避免臭氧溶解度的問題，將反應溫度設定為 10℃，20℃，30℃，40℃，50℃。此五種不同 溫度在高臭氧劑量(101.8mg/min)下，以較低反 應溫度(10℃，20℃)的產糖量較高，各寡糖量 及總產糖量皆隨著時間的增加而增加（圖一）。 b. pH 值的變化可視為臭氧氧化降解時劇烈的程 度，也可視作羧基生成的指標。因為在臭氧的 氧化降解中，無外來的酸源可使 pH 值下降，只 有氧化反應物而得的羧基是 pH 值下降的主 因。所以在收集降解生成物的同時，監測其 pH 值，藉由 pH 值反推其羧基生成的情形。圖二是 臭氧氧化降解反應後溶液 pH 值的變化情形，其 結果顯示，除了低臭氧劑量(9.27mg/min)實驗 組外，其餘實驗組反應後的 pH 值都有明顯下降 的趨勢，可知，隨著臭氧氧化降解反應的進行， 反 應 物 會 有 酸 的 產 生 ， 且 以 較 高 臭 氧 劑 量 (101.8mg/min)實驗組反應後的 pH 值下降最 劇，反應 12 小時後，1％(w/v)幾丁聚醣醋酸溶 液的 pH 值由 4.05 降至 2.37。不同反應溫度實 驗組反應後，pH 值亦都有下降的趨勢。由於實 驗的目的是產生具高價值的幾丁寡醣，故需更 進一步研究鑑定產生的酸種類，並探討避免小 分子酸或羧基等副產物產生的方法。 2. 高溫下臭氧降解幾丁聚醣 臭氧不溶於 60℃以上的水中，就高於 60℃環 境下進行氧化降解反應，將使臭氧以分子的型式 直接氧化降解反應物幾丁聚醣，應可有效抑制自 由基生成，以達減少羧基生成的目的，可預測的

是氧化降解的速率將因無自由基參與而減緩，但 臭氧反應速率卻又因高溫下反應速率加快，使得 降解速率並無減慢。於是在高溫下加以不同劑量 的臭氧，觀察在高溫的臭氧氧化降解是否有何不 同。 a.為避免臭氧氧化降解過程中產生不需要的羧基 問題，以及期望臭氧直接氧化降解而非藉由自 由基型式裂解，將反應溫度設定為 70℃、80℃、 90℃（皆高於 60℃），臭氧氧化降解幾丁聚醣 溫度愈高，所得的葡萄糖胺及幾丁寡醣（DP＝2 ∼6）總產量也有愈高的趨勢（圖三)。 b.70℃、90℃時 pH 值比之 80℃時 pH 值有明顯下 降的趨勢（圖四）。90℃時，葡萄糖胺及幾丁 寡醣（DP＝2∼6）總產量高，臭氧氧化劇烈， 羧基生成也跟著多，致 pH 值下降。70℃葡萄糖 胺及幾丁寡醣（DP＝2∼6）總產量並無較 80℃ 時多，但 pH 值確有下降，是因為 70℃離臭氧 不溶於水的臨界點 60℃較近，仍可能有些微臭 氧溶於水中，自解產生自由基，以致寡醣雖產 量不高，卻已有酸產生。 c.綜合以上兩點顯示臭氧氧化降解反應中，會有 一個適中的反應條件（例：溫度、臭氧劑量）， 使得整個降解反應在產生較高量的葡萄糖胺及 幾丁寡醣（DP＝2∼6），同時羧基卻只有少量 生成。 3. 比較高低溫幾丁六醣產量 將高、低溫實驗中幾丁六醣產量較高的反應 條件挑出做比較，可得知 80℃【O3】78.3mg/min 此組在反應一小時後即可得到 248.45ppm 的幾丁 六醣，同時 pH 值並無明顯的改變，是一較佳反應 條件（圖五）。 4. 以臭氧降解靈芝殘渣 選出臭氧降解幾丁聚醣之中葡萄糖胺與幾丁 寡醣（DP＝2∼6）總產量較高的三組反應條件臭 氧劑量 65.1 mg/min、78.3 mg/min、104.8 mg/min， 反應溫度 80℃進行降解靈芝殘渣反應。 a.圖六為各取樣時間之 pH 值，可以觀察到一開始 pH 值會下降，表示臭氧氧化降解正在進行，到 了 3、4 小時候就停止，成水平狀，表示反應溶 液中可被臭氧降解產生羧基的物質幾乎全都降 解完了，另臭氧劑量 65.1mg/min 此反應條件， 到最後 6 小時為何 pH 值有升高的現象，目前尚 未清楚，亦值得探討。 b.另一項靈芝殘渣被臭氧降解更有力的證明為測 取樣時，尚有多少物質其分子量仍在 3000 以上 （圖七），若 Mw3000 以上愈來愈少，表示臭氧 氧化降解正在進行，圖三十三反應條件 80℃ 104.8mg/min 可看出 Mw3000 以上的量在 0.33 至 4 小時都在減少，但 5、6 小時呈平緩，表示 反應至 4 小時後，可受臭氧降解的物質已趨近 於無，另兩反應條件也一如上述。 c.最後將生成物經前處理以 HPLC 分析，發現有未 知物被降解出與標準品時間相近，但難以判斷 為 何 物 ， 故 無 法 得 知 N-acetylchitooligosaccharides 產量。 五、計畫成果自評 本計畫之完成有助於瞭解臭氧氧化幾丁聚醣 之機制，但對靈芝殘渣氧化物解析則困難度較 高。檢討原因有二：一為之前實驗樣品為幾丁聚 醣，而靈芝殘渣所含為帶乙醯基的幾丁質，臭氧 在降解兩物時，應有差別。二則是靈芝殘渣為混 合物，內含β-1,3 鍵結者應可被臭氧降解，導致 生成物內含較雜物種，以致 HPLC 難以分離、判別。 五、參考文獻

[1] Suzuki, K., Tokoro, A.,Okawa, Y., Suzuki, S., and Suzuki, M. 1985. Enhancing effects of N-acetyl-chito-oligosaccharides on active oxygen generating and microbicidal activities of peritoneal exudates cell in mice. Chem. Pharm. Bull. 33:886-888.

[2] Kendra, D.F., and Hadwiger, L.A. 1984.

Characterization of the smallest chitosan oligomer that is maximally antifungal to Fusarium solani and elicits pisatin formation in Pisum sativum. Exp. Mycol. 8:276-281.

[3] Aiba, S. I. 1994b. Preparation of N-acetylchitooligosaccharides by hydrolysis of chitosan with chitinase followed by N-acetylation. Carbohydr. Res. 265: 323- 328.

[4] Assembly of Life Science (US) Committee on Medical and Biological Effects of Environmental Pollutants. 1977. Ozone and other photochemical oxidants. National Academy of Sciences, Washington, D.C.

[5] Tôei, K., and Kohara, T. 1976. A conductometric method for colloid titration. Analytica Chimica Acta. 83:59-65.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0.33 0.66 1 2 3 4 5 6 Reaction time(hr) A mo un t o f g lu co sa min e a nd ch it oo li go sa cc ha ri de s( pp m ) 70℃ 80℃ 90℃ 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0 0.33 0.66 1 2 3 4 5 6 Reaction time(hr) pH v al ue 70℃ 80℃ 90℃ 0 50 100 150 200 250 300 350 0.33 0.67 1 2 3 4 5 6 Reaction time(hr) C h ito he x os e(p p m) 20℃101.8mg/min 80℃78.3mg/min 2 3 4 5 0.33 0.67 1 2 3 4 5 6 Reaction time(hr) pH 【O3】= 65.1mg/min 【O3】= 78.3mg/min 【O3】=104.8mg/min Reaction time(min) 0 200 400 600 800 pH 值 2 3 4 5 101.8 mg/min 40.9 mg/min 9.27 mg/min Reaction time(min) 0 100 200 300 400 A mou nt o f glu c o s a mine a nd c h itoo lig o s a c c h a rid e s (p p m) 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 10oC 20oC 30oC 40oC 50oC 圖一、以臭氧劑量 101.8mg/min 及低溫的反 應溫度對葡萄糖胺及幾丁寡醣總產量 之影響 圖二、不同臭氧劑量反應後反應產物 pH 值變化情形 圖三、在 65.1mg/min 臭氧劑量下，溫度 對葡萄糖胺及幾丁寡醣（DP＝2∼ 6）總產量之影響 圖四、在臭氧劑量 65.1mg/min 下，以 70 ℃、80℃、90℃降解之產物 pH 值變 化情形 pH3.89 pH4.07 圖五、溫度與臭氧劑量對幾丁六醣產量之 影響 圖六、80℃下臭氧降解靈芝殘渣產物 pH 值之 變化

0 10 20 30 40 50 0 0.33 0.67 1 2 3 4 5 6 Reaction time(hr) W (g ) 【O3】= 65.1mg/min 【O3】= 78.3mg/min 【O3】=104.8mg/min 圖七、80℃下臭氧降解靈芝殘渣產物分子量 3000 以上重量之比較