行政院國家科學委員會
專題研究計畫成果報告
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
※ 計畫中文名稱：雙叉乳酸桿菌之抗氧化性及在克弗爾※
※ 發酵乳之應用研究 ※
※ 計畫英文名稱：Antioxidative activity of bifidobacteria ※
※ and its application in kefir fermentation ※
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
計畫類別：個別型計畫
計畫編號：NSC89-2313-B-002-251-執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
計畫主持人：游 若 萩 教 授
計畫參與人員：周 延 芳 碩士班研究生
執行單位：國立臺灣大學食品科技研究所
中 華 民 國 九十 年 十二 月
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計畫中文名稱：雙叉乳酸桿菌之抗氧化性及在克弗爾發酵乳之應用研究
計畫英文名稱：Antioxidative activity of bifidobacteria and their application in
kefir fermentation
計畫編號：NSC89-2313-B-002-251-執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
主持人：游若萩教授 國立臺灣大學食品科技研究所
電子信箱：
yurc@ccms.ntu.edu.tw 一、中文摘要 本研究探討以雙叉桿菌與克弗爾粒為菌 元所生產之克弗爾發酵乳，在克弗爾發酵期 間雙叉桿菌、乳酸球菌、白色念珠菌及酵母 菌的生長，及雙叉桿菌對克弗爾品質與抗氧 化能力之影響。結果顯示雙叉桿菌可與克弗 爾粒在 21℃下共同發酵，雙叉桿菌菌數可 達 107 ~108 CFU/ml，其中以B. longum 及 B. adolescentis 菌數為最高。B. longum 不會影 響克弗爾粒中之菌相及酒精產量。此外，接 種雙叉桿菌之處理組較控制組可縮短發酵時 間，其最終可滴定酸度為 1.6-1.7%，可揮發 性酸度為 0.038-0.047%。雙叉桿菌在 30 及 37℃生長雖較佳，但因其快速生長導致克弗 爾發酵乳產生不良風味且在 pH4.7 即造成乳 清分層現象。 克弗爾菌體之胞內萃出物具有抑制抗壞 血酸自氧化作用、螯合亞鐵、銅離子及清除 羥自由基之能力。接種雙叉桿菌製備之萃出 物雖無法抑制抗壞血酸自氧化作用，但可增 加克弗爾螯合亞鐵、銅離子及清除羥自由基 能力。接種雙叉桿菌之牛乳發酵液普遍較 MRS 發酵液之抗氧化力高，兩者皆在抑制 抗壞血酸自氧化作用、螯合銅離子及清除羥 自由基能力方面顯示具有抗氧化能力。在螯 合亞鐵離子方面，以 MRS 培養液培養之發 酵液，沒有螯合亞鐵離子之能力，但牛奶之 發酵液則有螯合亞鐵離子能力。 關鍵詞：克弗爾、抗氧化、雙叉乳酸桿 菌 Abstr actThis study was conducted to investigate the growth of bifidobacteria, lactococci,
leuconostocs and yeast during kefir fermentation, using bifidobacteria and kefir grain as starters. The influence of bifidobacteria to the quality and the antioxidative property of kefir were also investigated.
Results indicated that bifidobacteria could co-cultivate with kefir grain at 21℃ and their cells numbers were from 107~108 CFU/ml, B. longum and B. adolescentis gave the highest
cell numbers. B. longum did not affect the
original microbial flora and ethanol content of kefir. Furthermore, the fermentation time of bifidobacteria treatments were shorter than control, titratable acidity of final fermentation broth were from 1.6 to 1.7%, volatile acidity were from 0.038 to 0.047%. Bifidobacteria grew rapidly at 30 and 37℃; however, the higher growth rate caused off-flavor and whey separation of kefir when fermentation pH reached to 4.7.
Antioxidative property of kefir indicated that intracellular extracts of kefir flora could inhibit ascorbate autooxidation, metal ion chelation for Fe+2 and Cu+2, and scavenge of free hydroxyl radical. Bifidobacteria inoculation could increase chelation ability for Fe+2 and Cu+2, hydroxyl radical scavenging ability, but couldn’t increase the inhibition to ascorbate autooxidation. Milk fermentation broth inoculation with bifidobacteria showed higher antioxidative property than MRS broth. Inhibition rates of ascorbate autooxidation, Cu+2 chelation and hydroxyl radical scavenge were also found in milk and MRS fermentation broth. The supernatant obtained from MRS broth didn’t show Fe+2 chelating ability.
Keywor ds: kefir, antioxidative property, bifidobacteria
二、緣由與目的 傳統發酵乳飲料—克弗爾(kefir)，源於 西元 1300 年之北高加索區，為著名的酒精 發酵乳，主要由乳酸菌與酵母菌發酵牛乳製 成，除具有一般發酵乳的風味外，更含有微 量酒精與二氧化碳所產生之獨特口感。其具 有預防病原菌感染、抑制腸內有害菌、促進 腸的蠕動、促進胃液分泌、提高肝功能、降 低膽固醇、溶解血拴、緩和精神壓力及抑制 癌細胞等功效，因而於日常生活中被廣泛飲 用。 隨著現代人飲食習慣改變，尤其是對於 脂肪的攝取量逐日遽增，造成體內自由基過 多，引起老化與慢性病的發生。近年來則發 現許多乳酸菌具有抗氧化功能，而克弗爾是 由乳酸菌與酵母菌共同發酵製成，有關其抗 氧化之功效值得研究。乳酸菌中又以雙叉桿 菌的抗氧化效果較顯著，且其為人體之益生 菌，所以本研究嘗試將其與克弗爾粒(kefir grain)共同發酵，以期增強克弗爾之抗氧化 及健康功效。此外，雙叉桿菌發酵過程中會 產生醋酸(乳酸：醋酸﹦2：3)，使發酵產品 產生不良風味，因此如將雙叉桿菌與其他乳 酸菌共同發酵當可減少風味不佳之問題。 本研究目的在探討接種雙叉桿菌於克弗 爾發酵期間，雙叉桿菌與其他克弗爾中菌叢 間的消長與存活情形，雙叉桿菌對克弗爾品 質及抗氧化性質的影響。 三、結果與討論 一、測定接種雙叉桿菌於克弗爾發酵期間之 微生物菌數 本實驗探討雙叉桿菌與克弗爾粒共同發 酵對克弗爾微生物菌數的影響。結果顯示雙 叉桿菌在 30 及 37℃生長最佳，在 21℃則生 長較差。在 30 及 37℃下，B. adolescentis、 B. infantis 及 B. longum 最終菌數為最高，B. bifidum 則 最 低 ，但其菌數皆到達 107-108 CFU/ml 左右。在 21℃則雙叉桿菌普遍生長 不佳，但以 B. longum 菌數最高，達 108
CFU/ml 左右; B. adolescentis、B. infantis 次
之，菌數在 107 -108 CFU/ml 左右; B. bifidum 則最低，為 107 CFU/ml 左右。37℃及 30℃ 分別在第 20 小時及第 25 小時菌數達到最大 值，21℃則在第 30 小時菌數才達到最大 值。而在 21、30 及 37℃的培養下，雙叉桿 菌在 30℃及 37℃的最終菌數較高，在 21℃ 的最終菌數則較低。 二. 克弗爾品質之測定 本實驗探討以雙叉桿菌與克弗爾粒為菌 元對克弗爾品質的影響。在 21℃下，控制 組之 pH 值較接種雙叉桿菌的處理組為高， 可滴定酸度則較低。在可滴定酸度方面，處 理組之最終可滴定酸度大約為 1.6-1.7%，B. longum 的 酸 度 最 高 ， B. bifidum 、 B. adolescentis 與 B. infantis 則較低。在 30 及 37℃下，克弗爾之產酸趨勢大致上與 21℃ 相同，控制組之 pH 值皆較接種有雙叉桿菌 的處理組為高，可滴定酸度則較低。但在 30 及 37℃下，雙叉桿菌產酸的能力似乎較 21℃強，此乃因雙叉桿菌在 30 及 37℃生長 較好所致。在 30℃下，接種不同雙叉桿菌 之處理組 pH 值無明顯差異，最終 pH 值為 4.5-4.6; 但在可滴定酸度方面則以B. longum 及 B. bifidum 的酸度較高，其最終酸度為 1.2%及 1.1%。在 37℃下，pH 值較低的為 B. longum 及 B. bifidum，最終 pH 值為 4.3; 但 酸度則以 B. infantis 1.5%較高，B. longum 及 B. bifidum 為 1.4%次之，B. adolescentis 則 最低為 1.1%。由此可知，溫度越高隨著菌 之生長越快產酸能力也越快，此外也發現 30 及 37℃之克弗爾不管有無雙叉桿菌參與 發酵其皆會產生不良的風味，使克弗爾品質 下降。 比較在 21、30 及 37℃下，雙叉桿菌與 克弗爾粒共同發酵之處理組，其產酸會較控 制組快。其可能原因有二，一為酸是由雙叉 桿菌產生的；另一原因為處理組之起始菌數 與控制組不同，這是因為處理組接種雙叉桿 菌 105 -106 CFU/ml 的關係，使得處理組的發 酵時間縮短較快到達發酵終點 pH4.5-4.6， 而控制組則仍未到達發酵終點所致。此外也 發現克弗爾在 30 及 37℃發酵時，在 pH4.7 左右就有乳清分層的現象，且溫度越高分層 現象越嚴重。 酒精為克弗爾風味之一，因其可產生微 量酒精，本試驗因而探討接種雙叉桿菌後對 克 弗 爾 酒 精 產 量 之 影 響 。 結 果 顯 示 B. longum 的接種並不會影響酵母菌的生長， 最初控制組之酵母菌長得較處理組快，但最 終酵母菌菌數則無差異，其最終菌數約為
106-107CFU/ml 左右。 克弗爾中之酒精主要是由酵母菌生產， 雖然 leuconostocs 利用乳糖時也會產生酒 精 ， 但 在 共 同 代 謝 乳 糖 與 檸 檬 酸 下 ， leuconostocs 無法產生酒精。在本實驗中發 現接種 B. longum，對克弗爾的酒精產量並 不會造成影響，其最終酒精含量為 2.7g/L 左 右。又本實驗中也發現隨著酵母菌的生長， 克弗爾的酒精產量亦隨之增加，尤其是在發 酵末期酒精含量增加較快。 三.抗氧化活性 (1)抑制抗壞血酸自氧化能力 本實驗則利用抗壞血酸自氧化(ascorbate autooxidation)系統進行抗氧化測試。結果顯 示以牛乳培養的菌體胞內萃出物對抗壞血酸 自氧化抑制力(16.5-18.2%)明顯較以 MRS 培 養液培養者(28.3-30.8%)為低，接種不同雙 叉桿菌之處理組間則不具顯著性差異。有可 能是因為以牛乳培養的樣品其沈澱物為凝 乳，而所萃出的胞內菌體萃出物則是將此凝 乳以超音波振碎所製成的，造成萃出物內有 許多微小懸浮物而影響實驗值。所以，為了 去 除 牛 乳 中 凝 乳 所 造 成 的 誤 差 ， 另 外 以 MRS 培養液培養，以確認菌體是否真的具 有抑制抗壞血酸自氧化能力。結果顯示克弗 爾(控制組)本身即具有抑制抗壞血酸自氧化 能力(28.3%)，另外接種雙叉桿菌之處理組 實驗值與控制組無顯著性差異，但接種 B. adolescentis 之處理組其抑制抗壞血酸之自氧 化作用明顯為所有樣品中之最高者，其抑制 力達 30.8%。 在測定克弗爾發酵液抑制抗壞血酸自氧 化能力方面，則是以牛乳發酵液的抑制能力 較高(16.0~20.1%)，這是因為其含有許多蛋 白質或其他物質具有抗氧化能力所致。而以 MRS 培養液的樣品中，證實雖然克弗爾本 身具有抑制抗壞血酸自氧化能力(7.12%)， 但雙叉桿菌的接種可明顯提高其發酵液的抗 氧 化 活 性 ， 其 中 以 B. adolescentis 及 B. bifidum 能力最高分別為 11.4%及 11.1%，B. infantis 次之，B. longum 則與控制組無顯著 差異。此外，不管有無接種雙叉桿菌，克弗 爾皆表現出抑制能力，而根據上述實驗條件 推論，其抑制能力的表現應是克弗爾菌體胞 內萃出物及發酵液具有清除或降低溶液中溶 氧而抑制抗壞血酸自氧化的進行。 (2)金屬離子螯合能力 研究指出雖有多種金屬離子可促進氧化 反應但其中以鐵、銅離子最具代表性，因此 在金屬離子螯合能力的測試以此二者為研究 材料。 本試驗首先針對亞鐵離子螯合力進行測 試，在菌體胞內萃出物中，以牛乳培養之樣 品螯合亞鐵離子能力明顯高於 MRS 培養液 者。這是因為牛乳中含有各式各樣的蛋白 質 ， 其 中 一 種 為 人 熟 知 的 乳 鐵 蛋 白 (lactoferrin)是種運鐵蛋白(transferrin)，具有 鐵離子結合能力的醣蛋白。乳鐵蛋白為人體 攝食後可在小腸腔中藉由結合鐵離子的能 力，幫助腸細胞吸收鐵離子，同時也可排除 因催化自由基反應生成的多餘鐵離子，所以 造成以牛乳培養者測出的數值較高之原因。 此外，克弗爾菌體胞內萃出物本身亦具有螯 合亞鐵離子能力，而接種雙叉桿菌可大幅提 高 其 螯 合 亞 鐵 離 子 能 力 ， 其 中 又 以 B.
adolescentis、B. infantis 及 B. longum 能力最
強。Kot(1995)發現雙叉桿菌可將亞鐵離子轉 至細胞內，並經由胞內鐵氧化 (ferroxidase) 轉成 Fe(OH)3，以保持細胞內的亞鐵離子濃 度較低而有利於細胞外亞鐵離子進入細胞 內。至於克弗爾發酵液對亞鐵離子的螯合能 力方面，則以 MRS 培養液者並未測得有此 能力，但在以牛乳培養者則有測得，且接種 雙 叉 桿 菌 之 處 理 組 (60-82.0ppm) 與 控 制 組 (58.4ppm)有顯著差異。 銅離子螯合能力試驗結果，不管是在菌 體胞內萃出物或發酵液方面，牛乳培養者與 MRS 培養液培養者並無顯著差異，所以， 牛乳以此方法測試，可能並不含銅離子螯合 物質。其主要可能是來自菌體內部，或菌體 代謝物所具有的能力。以 MRS 培養液培養 之菌體胞內萃出物及發酵液處理組中，可發 現雙叉桿菌可提高克弗爾的螯合銅離子能 力，其中在萃出物以 B. adolescentis 及 B. longum 能 力 較 強 ， 發 酵 液 則 是 以 B. adolescentis、B. bifidum 及 B. infantis 較強。
(3)對羥自由基之清除能力
克弗爾對羥自由基的清除能力以同樣具 有清除能力的尿酸作為標準物質表示，以牛 乳培養者胞內萃出物清除能力較高(4.23-4.57 mM) ， MRS 培 養 液 培 養 的 較 低 (0.93-2.02
mM)。在發酵液方面也有相同的結果，牛乳 發 酵 液之清除能力範圍由 2.1-3.63 mM， MRS 培養液發酵液則為 0.38-0.45 mM。這 可能是因為牛乳內許多蛋白質具有抗氧化能 力所致。接種雙叉桿菌於克弗爾中，不管是 以牛乳或 MRS 培養液培養及胞內萃出物或 發 酵 液 方 面 ， 大 致 上 B. longum 及 B. adolescentis 處理組的羥自由基的清除能力均 為較高者，且與控制組有明顯差異。而胞內 萃出物及發酵液為一混合物，無法得知何種 物質發揮捕捉羥自由基的能力。 (4)還原力 菌體胞內萃出物及發酵液之還原力的測 定以半胱胺酸(cysteine)為標準物，實驗結果 發現在胞內萃出物方面，以牛乳為基質者所 測出的值較 MRS 培養液者為高，其範圍分 別為 89.3-114 μΜ及 57.6-89.4 μΜ。這有 可能是因為牛乳中的許多胺基酸、 及蛋 白質具有還原力的關係。胞內萃出物之還原 力中又以 B. longum、B. adolescentis 及 B. infantis 為較高，且可明顯的提高克弗爾的 還原力，而克弗爾本身亦具還原力。 在發酵液方面則是以 MRS 培養液之還 原力較牛乳者高，但接種不同雙叉桿菌之處 理組間卻無明顯差異。所以對未發酵新鮮之 MRS 培養液的還原力進行探討，結果發現 其測值高達 586 μΜ，這有可能是 MRS 培 養液本身即具有還原力，而至於 MRS 培養 液的還原力到底是不是克弗爾菌體所產生的 就無法得知，因為 MRS 培養液本身的測值 即太高，易造成測出的吸光值產生誤差，即 使克弗爾菌體所產生的物質具有還原力也不 易測出。在牛乳方面也具有相同情形，但礙 於所使用的方法無法對原有牛乳進行檢測， 因為未發酵牛乳呈混濁狀，易造成實驗誤 差，所以在此沒有進一步做探討。雖然克弗 爾菌體所產生的物質到底具不具有還原力在 此無法測出，但可以肯定的是克弗爾牛乳發 酵液具有還原力。 同其他生物體一般，克弗爾菌體胞內物 及發酵液含有多種抗氧化劑。實驗結果指 出，克弗爾菌體胞內萃出物及發酵液均表現 出還原力的存在，而此種還原力的表現應是 體內抗氧化劑及蛋白等綜合表現的結果。 四、計畫成果自評 本研究計畫成果報告內容與原申請研究 計畫書內容相符，並達成預期目標。 研究成果具學術及應用價值，適合在學 術期刊發表。 五、參考文獻 1. 林慶文。1998。農業推廣手冊 44—克弗 爾與健康 p.9。國立台灣大學農學院農 業推廣委員會印行。台北，台灣。 2. Shiomo, M. K., Sasaki, K., Murofushi, M.
and Aibara, K. 1982. Antitumor activity in mice of orally administered polysaccharide from kefir grain. Japan. J. Med. Sci. Biol. 35:75-80.
3. Lin, M. Y. and Yen, C. L.1999. Antioxidative ability of lactic acid bacteria. J. Agric. Food Chem. 47:1460-1466.
4. 黃建 榕。 1997。Bifidobacterium 屬乳酸
菌試製酸酪乳之研究一(Ø )酸酪乳風味 成 分 之 分 析(1)。 畜 產 研 究 。30﹙2﹚:
135-141。
5. Clark, P. A. and Martin, J. H. 1994. Selection of bifidobacteria for use as dietary adjuncts in cultured dairy foods: Ⅲ -Tolerance to simulated bile concentrations of human small intestines. Cult. Dairy Prod. J. 29(3): 18-21.
6. Mishra, O. P. and Kovachich, G. B. 1984. Inhibition of the autooxidation of ascorbate and norepinephrine by extracts of Clostridium butyrium, Megasphaera elsdenii, and Escherichia coli. Life
Sci.35:849-854.
7. Yamauchi, R., Goto, Y., Kato, K. and Ueno, Y. 1984. Prooxidant effect of dihydroxyacetone and reducing sugars on the autoxidation of methyl emulsions. Agric. Biol. Chem. 48:843-848.
8. Oyaizu, M. 1986. Antioxidative activity of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi. 35: 771-775.
9. Tabatabaie, T. and Floyd, R. A. 1994. Susceptibility of glutathione peroxidase and glutathione reductase to oxidative damage and the protective effect of spin trapping agents. Arch. Biochem. Biophys. 314:112-119.
10. Gutteridge, J. M. C. 1987. Ferrous-salt-promoted damage to deoxyribose and
benzoate. Biochem. J. 243:709-714.
11. 沈明來。1993。試驗設計學。九州圖書 公司。台北市，台灣。
12. Wanasundrara, U., Amarowicz, R. and Shahidi F. 1994. Isolation and identification of an antioxidative component in canola meal. J. Agric. Food Chem. 420:1285-1290.
13. Benkerroum, N., Misbah, M., Sandine,W. E. and Elaraki, A. T. 1993. Development and use of a selective medium for isolation of Leuconostoc spp.
from vegetables and dairy products. Appl. Environ. Microbiol. 59(2):607-609.
14. Husain, S. R., Gllard, J. and Gllard, P. 1987. α -Tocopherol prooxidant effect and malondialdehyde production. JAOCS. 64:109-111.
15. Rashid, M. H., Kato, F., Murata, A. and Kondo, W. 1993. Purification and characterization of the antioxidative substance produced by Aspergillus sojae
K. Biosci. Biotech. Biochem. 57:935-939. 16. Buettner, G. R. 1990. Use of ascorbate as
test for catalytic metals in sample buffers. Methods Enzymol. 186:125-127.
17. Halliwell, B. and Chirico, S. 1993. Lipid peroxidation : its mechanism, measurement, and significance. Am. J. Clin. Nutr. 57: 715S-725S.
18. Halliwell, B. 1994. Free radicals and antioxidant : a personal view. Nutrition Reviews. 52: 253-265.
19. Halliwell, B. and Gutteridge, J. M. C. 1984. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem. J. 219:1-4.
20. Halliwell, B. and Gutteridge, J. M. C. 1989. Free radicals in biology and medicine. 2nd ed. Clarendon Press, Inc. Oxford, England p50.
21. Halliwell, B., Murcia, H. A., Chirco, S. and Aruoma, O. I. 1995. Free radicals and antioxidants in food and in vivo : what
they do and how they work. CRC Crit Rev in Food Sci. Nutr. 35: 7-20.
22. Pokorny, J. 1991. Natural antioxidants for food use. Trends Food Sci. Technol. 2: 223-227.
23. Kot, E., Furmanov, S. and Bezkorovainy, A. 1995.Accumulation of Iron in Lactic acid Bacteria and Bifidobacteria. J. Food Sci.
60(3): 547-550.
24. Gutteridge, J. M. C. Richmond, R. and Halliwell, B. 1979.Inhibition of the iron-catalysed formation of hydroxyl radicals from superoxide of lipid peroxidation by desferrioxamine. Biochem. J. 184:469-472. 25. Garnder, H. W. 1995. Decomposition of linoleic acid hydroperoxides. Enzymic reactions compared with nonenzymic. J. Agric. Food Chem. 23:129-136.
