蜂毒抗菌胜肽之抗菌效能及協力作用 研究摘要

中華民國第五十屆中小學科學展覽會 作品說明書

科別：生活與應用科學 組別：高中組

作品名稱：蜂毒抗菌胜肽之抗菌效能及協力作用 關鍵詞：蜂毒、抗菌胜肽、協力作用

編號：

蜂毒抗菌胜肽之抗菌效能及協力作用 研究摘要

在 2005 年的一篇論文中曾指出澳大利亞雨蛙上取得的抗菌胜肽與多種抗生素搭配具有殺 菌作用，證明了抗菌胜肽能和抗生素產生協力作用，本研究就是想測試蜂毒中的抗菌胜肽與 抗生素是否在殺菌方面具有協力作用。

選取二株大腸桿菌（

Escherichia coli

），分別為 BL21、JM109；以分光光度計測量吸光值後 繪出其生長曲線，取活化後十七個小時為最佳實驗時數。

進行抗菌活性測試選用四種藥品，分別為蜂毒抗菌胜肽 Mastoparan-VA、Ampicillin、

Kanamycin、Chloramphenicol，其中 Mastoparan-VA 為蜂毒中分離出之抗菌胜肽。因各菌液的濃 度有所差異，將其稀釋為相同濃度後測定最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC) 接著再進行協力作用測試。

經協力作用得試驗後，發現 Mastoparan-VA 與 Ampicillin、Kanamycin、Chloramphenicol 三 種抗生素在某些特定濃度下雖然無法達到協同的效果，但能達到相加的抗菌效果。

壹、 研究動機

自抗生素發現至現在這 50 年稱為所謂的傳統抗生素時期（classical antibiotic era），抗生 素在醫療上的確有極大的貢獻。然而，抗藥性的問題也日益嚴重，政府在近幾年來推動許多 政策來減緩抗藥性問題，例如在國家衛生研究院監測計畫中顯示，門診病人尿液分離出大腸 桿菌之抗藥性由 1998-2000 年的 77%，降低至 2002-2004 年的 70%；流行性感冒嗜血桿菌對 ampicillin 之抗藥性由 1999-2000 年的大於 65﹪，降低至 2002-2004 年之 59%。雖然第一線抗生 素的使用及細菌抗藥性獲得改善，但住院病人抗生素使用卻有增加的趨勢。因此在尋找新的 殺菌物質上仍然還須努力。

在許多生物的體內中都可以發現由小段的胺基酸所組成的殺菌物質被稱之為抗菌胜肽，

當生物受到病原菌的侵害時，抗菌胜肽就是首先產生的抗菌機制。近年來更有報導指出抗菌 胜肽具有抑制癌細胞的功能。但因為抗菌胜肽的取得成本頗高，為使抗菌胜肽在使用上更加 有經濟效益，所以本研究想測試是否能以少量的蜂毒抗菌胜肽與抗生素是否能達到協力作用 的效果以達到降低成本的目的。(下表為本實驗所使用的抗生素與抗菌胜肽的作用機制)

（表一）驗所使用的抗生素與抗菌胜肽的作用機制

貳、

研究目的

一、檢驗蜂毒中的抗菌胜肽及抗生素對

E. coli

之抗菌效能。

二、探討蜂毒抗菌胜肽與抗生素對

E. coli

之協力作用。

參、

研究設備及器材

高溫高壓滅菌釜 一台 -20℃冰箱 一台 無菌操作檯 一台 電腦 一台 分光光度計 一台 實驗室必備實驗用品(註一) 恆溫培養箱 一台

恆溫震盪培養箱 一台

Tryptic Soy Broth medium (TSB 培養液)(註二) 數升

名稱 作用機制

Kanamycin 康黴素 康黴素同其他的氨基糖苷類藥物一

樣，能結合細菌核糖體的 30S 亞基上的 16S rRNA，干擾 formyl-methionyl-tRNA 與 30SrRNA 的連接，阻斷細菌蛋白質 的合成。

Ampicillin 安比西林 其抗菌作用機制與青黴素相同，主要通 過與細菌主要青黴素結合蛋白（PBPs）

結合，干擾細菌細胞壁的合成而起殺菌 作用。

Chloramphenicol 氯黴素 抑制菌的蛋白質合成

Mastoparan-VA 帶陽離子的抗菌蛋白易與細胞膜上之

陰離子結合，破壞細胞膜穩固的結構，

一般抗菌蛋白與細胞膜結合後會鑲嵌 於膜上，待抗菌蛋白濃度足夠便會造成 細胞膜穿孔或磷脂質的被破壞，造成細 菌的死亡；但抗菌蛋白抑制格蘭氏陽性 細菌生長的機制目前仍不清楚，一般認 為同樣是造成細胞膜的破壞。

抗 菌 活 性 試 驗 TSA 固態培養基(註三)

Phenol Red Broth 培養液 (添加 1% 葡萄糖)(註四) 數升

註一 實驗室必備實驗器材：本生燈、白金接種環、微量滴管、96 孔盤、15 ml 細菌培養管等用品。

註二 TSB 培養液：取 30 g Tryptic Soy Broth powder 回溶於 ddH2O 至 1 公升。

註三 TSA 固態培養基：分別取 30 g Tryptic Soy Broth powder 及 Agar 20 g，回溶於 ddH2O 至 1 公升。

註四 Phenol Red Broth 培養液(添加 1%葡萄糖)：分別取 15 g Phenol Red Brorh Base 及 10 g 葡萄糖，回溶 於 ddH2O 至 1 公升。

肆、

實驗流程

試驗菌株為大腸桿菌，分別為

E.coli

JM109、

E.coli

BL21

↓

測量二株菌之生長曲線

↓

測量菌株濃度(Colony forming unit, CFU)

↓

測定最低抑菌濃度測試(Minimum inhibitory concentration, MIC)

↓

協力作用（Fractional inhibitory concentration）

伍、

研究方法與結果

一、分別挑選單一菌落於 TSB 培養液，於 37℃恆溫培養箱進行培養。

二、分別測量二株菌之生長曲線

(一) 目的：繪出其生長曲線，並藉此得知菌體活性最佳之培養時間。

(二) 方法：

1. 將前一天已培養 12 小時之菌液，取 1 ml 培養 12 小時之菌液與 99 ml TSB medium 於錐形 瓶混合均勻，置於 37℃恆溫振盪培養箱內培養。

2. 每隔 20 分鐘取出培養液，於波長 600 nm，以分光光度計測量其吸光值。

※每株做三重複

(三) 結果：依生長曲線圖選出最佳培養時間為 16~17 小時(如圖一)。

(圖一)

E.coli

JM109、

E.coli

BL21 之生長曲線圖

生長曲線圖

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

20mi n

40m in 60mi

n 80mi

n 100m

in 120m

in 140mi

n 160m

in 180m

in 200m

in 220m

in 240mi

n 260m

in 280m

in

OD值

JM109 BL21

已先培養12小時活化

生長曲線圖

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

20mi n

40m in 60mi

n 80mi

n 100m

in 120m

in 140mi

n 160m

in 180m

in 200m

in 220m

in 240mi

n 260m

in 280m

in

OD值

JM109 BL21

生長曲線圖

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

20mi n

40m in 60mi

n 80mi

n 100m

in 120m

in 140mi

n 160m

in 180m

in 200m

in 220m

in 240mi

n 260m

in 280m

in

OD值

JM109 BL21

已先培養12小時活化

三、抗菌活性試驗

(一) 測量菌落數量

1. 目的：可得知在培養 17 小時後為生長取線的高峰，各株菌大約之菌數，以便在做 MIC 時可固定用藥對象的數目。

2. 方法：利用 10 倍序列稀釋的方式將已培養 17 小時的菌液用 0.85％等張的 NaCl 溶液稀釋 至原菌液的 10^-10倍(下圖二為示意圖)，將稀釋至 10^-7、10^-8、10^-9倍的菌液吸取 100μl 放入 培養基中以 L 型玻棒均勻塗抹，再置於培養箱中培養 12~20 小時後，找到菌落數為 30~300 的培養基，再推算原菌液的菌數。

3. 推算公式：菌落數×1/稀釋倍數×10＝原菌數(CFU/ml)。

(圖二)菌液之 10 倍序列稀釋示意圖

菌

液 10

^-1

10

^-7

10

^-8

10

^-9

10

^-10

10倍序列稀釋

菌

液 10

^-1

10

^-7

10

^-8

10

^-9

10

^-10

菌

液 10

^-1

10

^-7

10

^-8

10

^-9

10

^-10

10倍序列稀釋

4. 結論：由下數據顯示

E.coli

JM109、需稀釋 100 倍 才可達到約為 10⁷ CFU/ml

E.coli

BL21BL21 需稀釋 10 倍

（表二）

E.coli

JM109 培養 17 小時後菌液濃度 稀釋濃度

次數

JM109-1 JM109-2 JM109-3 JM109-4 平均(CFU/ml) 標準差

10^-6 1.87×10⁹ CFU/ml

5.91×10⁹ CFU/ml

6.93×10⁹ CFU/ml

1.4×10⁹ CFU/ml

4.028×10⁹ CFU/ml

±2.8×10⁹

10^-7 2.01×10⁹ CFU/ml

6×10⁹ CFU/ml

7.6×10⁹ CFU/ml

1×10⁹ CFU/ml

4.153×10⁹ CFU/ml

±3.15×10⁹

10^-8 4×10⁹ CFU/ml

4.63×10⁹ CFU/ml

5×10⁹ CFU/ml

2×10⁹ CFU/ml

3.908×10⁹ CFU/ml

±1.33×10⁹

(表三)

E.coli

BL21 培養 17 小時後菌液濃度 稀釋濃度

次數

BL21-1 BL21-2 BL21-3 BL21-4 平均(CFU/ml) 標準差

10^-6 4.6×10⁸ CFU/ml

1.54×10⁸ CFU/ml

2.7×10⁸ CFU/ml

4.48×10⁸ CFU/ml

3.33×10⁸ CFU/ml

±1.48×10⁸

10^-7 3.9×10⁸ CFU/ml

1.9×10⁸ CFU/ml

6.2×10⁸ CFU/ml

4.5×10⁸ CFU/ml

4.125×10⁸ CFU/ml

±1.77×10⁸

10^-8 4×10⁸ CFU/ml

8×10⁸ CFU/ml

3×10⁸ CFU/ml

2×10⁸ CFU/ml

3.75×10⁸ CFU/ml

±2.63×10⁸

(二) 最低抑菌濃度測定

1. 目的：測出各抗生素和蜂毒胜肽的最低抑菌濃度 2. 藥品使用濃度：

(1) Mastoparan-VA：256μg/ml (2) Kanamycin：512μg/ml (3) Ampicillin：512μg/ml (4) Chloramphenicol：512μg/ml

3. 細菌之代謝產物呈酸性，可使 Phenol Red Broth(添加 1％Glucose)變黃色，因此藉由顏色 變化，可得知細菌生長是否受到抑制，而 Phenol Red Broth(Glucose)顏色未改變之最低 濃度即為 MIC。

4. 方法：圖三為 96 孔盤示意圖

(圖三)最低抑菌濃度測定示意圖

註：●negative control：TSB 加 Phenol Red Broth(添加 1％Glucose)

●實驗組：先加入藥品與 Phenol Red Broth(添加 1％Glucose)進行序列稀釋，再加菌液。

●positive control：菌液加 Phenol Red Broth(添加 1％Glucose)，檢驗菌液是否有效。

(1) 分別於每一孔洞內加入 100 μl 的 Phenol Red Broth。

(2) 在 Negative control 及 Positive control 的地方在分別加入 100 μl 的 TSB 和 100 μl 菌液。

(3) 吸取 100 μl 的藥品到實驗組的第一格後，作 2 倍序列稀釋(同一藥品進行兩重複)。

(4) 於每一孔洞內分別加入 100 μl 菌液。

(5) 置於 37℃恆溫培養箱培養 18 小時等待結果。

(6) 18 小時後觀察，藉顏色改變與否，進一步判讀最低抑菌濃度。

※種藥品對每株菌的最低抑菌濃度測定需重覆四次(每盤兩排，重複兩盤，共計四次)

5. 結論：

(1)各抗生素和蜂毒對 JM109 之 MIC 結果如下：

(圖四)各藥品對

E.coli

JM109-1 之 MIC 結果

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

JM109-1

M-VA濃度 (μg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

抗生素濃度

(μg/ml)

^{128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25}

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

JM109-1

M-VA濃度 (μg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

抗生素濃度

(μg/ml)

^{128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25}

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

JM109-1

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

JM109-1

M-VA濃度 (μg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

抗生素濃度

(μg/ml)

^{128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25}

(圖五)各藥品對

E.coli

JM109-2 之 MIC 結果

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

JM109-2

M-VA濃度 (μg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

抗生素濃度

(μg/ml)

^{128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25}

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

JM109-2

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

JM109-2

M-VA濃度 (μg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

抗生素濃度

(μg/ml)

^{128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25}

(表四)各藥品對

E.coli

JM109 之 MIC 結果

JM109 1 2 3 4 MIC

MP-VA 8μg/ml 32μg/ml 8μg/ml 32μg/ml 8-32 μg/ml Amp 128μg/ml 128μg/ml 128μg/ml 128μg/ml 128μg/ml

Kan 8μg/ml 8μg/ml 8μg/ml 8μg/ml 8μg/ml Chlo 16μg/ml 8μg/ml 16μg/ml 16μg/ml 16μg/ml

(2)各抗生素和蜂毒對 BL21 之 MIC 測試結果：

(圖六)各藥品對

E.coli

BL21-1 之 MIC 結果

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

BL21-1

M-VA濃度 (μg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

抗生素濃度

(μg/ml) ^{128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25}

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

BL21-1

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

BL21-1

M-VA濃度 (μg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

抗生素濃度

(μg/ml) ^{128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25}

(圖七)各藥品對

E.coli

BL21-2 之 MIC 結果

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

BL21-2

M-VA濃度 (μg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

抗生素濃度

(μg/ml)

^{128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25}

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

BL21-2

－ ＋

M-VA

Amp Kan

Chlo

BL21-2

M-VA濃度 (μg/ml)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

抗生素濃度

(μg/ml)

^{128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25}

(表五)各藥品對

E.coli

BL21 之 MIC 結果

E. coli

BL21 1 2 3 4 MIC

MP-VA 16μg/ml 16μg/ml 16μg/ml 16μg/ml 16 μg/ml Amp 64μg/ml 64μg/ml 32μg/ml 32μg/ml 32-64

μg/ml Kan 16μg/ml 16μg/ml 16μg/ml 16μg/ml 16 μg/ml Chlo 1μg/ml 1μg/ml 2μg/ml 2μg/ml 1-2 μg/ml

四、協力作用（Fractional inhibitory concentration）

(一) 目的：探討抗生素與蜂毒抗菌胜肽的共同作用下對菌株生長所造成的抑制程 度，並藉以評估抗生素與蜂毒抗菌胜肽搭配使用是否具協力作用。

(二) 使用藥品濃度：

1. Mastoparan-VA：256μg/ml 2. Kanamycin：512μg/ml 3. Ampicillin：512μg/ml 4. Chloramphenicol：512μg/ml

(三) 方法：方法與 MIC 相似，圖八為 96 孔盤之示意圖 (圖八) 協力作用測試示意圖

2倍序列稀釋（加入抗生素濃度：512μg/ml）

已稀釋好的抗菌蛋白濃度(256μg/ml)

64

蜂毒抗菌胜肽濃度(μg/ml) (加入後稀釋的濃度)

32

16 8 4

2

1

0.5

抗生素濃度(μg/ml)(加入後稀釋的濃度)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

128

2倍序列稀釋（加入抗生素濃度：512μg/ml）

已稀釋好的抗菌蛋白濃度(256μg/ml)

64

蜂毒抗菌胜肽濃度(μg/ml) (加入後稀釋的濃度)

32

16 8 4

2

1

0.5

抗生素濃度(μg/ml)(加入後稀釋的濃度)

64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

128

註：●Negative control：TSB 加 Phenol Red Broth(添加 1％Glucose)

實驗組：先加入 Phenol Red Broth(添加 1％Glucose)後，加入藥品由左至右作序 列稀釋，再加入蜂毒抗菌胜肽，最後加入菌液。

●positive control：菌液加 Phenol Red Broth(添加 1％Glucose)，檢驗菌液是否有效。

1. 先在 Negative control 及 Positive control 的地方加入 50 μl 的 Phenol Red Broth。

2. 在 Negative control 及 Positive control 的地方在分別加入 100 μl 的 TSB 和 100 μl 菌液。

3. 於實驗組的每一孔洞中加入 50 μl 的 Phenol Red Broth。

4. 取 50 μl 抗生素至實驗組的第一個由左至右作 2 倍序列稀釋。

5. 再由第二排第一欄開始加入 50 μl 固定濃度的蜂毒抗菌胜肽(起始濃度為 256 μg/ml)。

6. 最後再加入 100 μl 菌液。

7. 置於 37℃恆溫培養箱培養中 18 小時後，若菌液呈現紅色表示抑制菌株之生長；若呈現 黃色則否。

8. 是否具協力作用評估方式如下：

FIC index＝ ( A/MIC A ) ＋ ( B/MIC B ) ＝FIC A＋FIC B

A：此項試驗中 A 之 MIC。 MIC A：A 對該菌株之 MIC。

B：此項試驗中 B 之 MIC。 MIC B：B 對該菌株之 MIC。

FIC A：A 之 FIC。 FIC B：B 之 FIC。

根據下表 FIC 數值結果即可知是否具有協力作用：

FIC≦0.5 協同(synergism) 0.5＜FIC＜1 相加(additive) 1≦FIC≦4 沒有差別

(indifferent) FIC＞4 拮抗(antagonism)

(四) 結論：

1.

E. coli

JM109 協力作用結果：

(圖九) Ampicillin 與 Mastoparan-VA 對

E. coli

JM109 之協力作用結果

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Amp濃度 (μg/ml)

JM109

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Amp濃度 (μg/ml)

JM109

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

(1)若固定 Amp 濃度來討論：

(表六) Ampicillin 與 Mastoparan-VA 對

E. coli

JM109 之協力作用結果分析

Amp 濃度（μg/ml） 分析結果

128 根據上圖，並無法看出此濃度的 MIC。

64 同上，雖無法看出 MIC，但可知能降低 Amp 及 MP-VA 的劑量。

32 16 8 4 2 1

若與先前所做的 MIC 比較，原本在 16 μg/ml 可殺菌的 MP-VA 只能在 32 μg/ml 有些微作用，故這些濃度下對 MP-VA 可能有抑制效果。

(2)取兩個特殊濃度比例帶入公式：

a、用最低濃度 MP-VA 配合較高濃度的抗生素(最符合經濟效益，因為蜂毒較貴)：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Amp＝0.5：64，代入公式，Amp 之 FIC index

＝ ( 0.5/16 ) ＋ ( 64/128 )≒ 0.53→→→相加

※MP-VA 濃度在 0.5μg/ml 與 Amp 濃度在 64μg/ml 有相加的效果。

b、用最高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Amp＝64：0.25，代入公式，Amp 之 FIC index

＝ ( 64/16 ) ＋ ( 0.25/128 )≒ 4.00→→→沒有差別

※MP-VA 濃度在 64μg/ml 與 Amp 濃度在 0.25μg/ml 為沒有差別。

(圖十) Kanamycin 與 Mastoparan-VA 對

E. coli

JM109 之協力作用結果

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Kan濃度 (μg/ml)

JM109

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Kan濃度 (μg/ml)

JM109

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

(3) 若固定 Kan 濃度來討論：

(表七) Kanamycin 與 Mastoparan-VA 對

E. coli

JM109 之協力作用結果分析

Kan 濃度（μg/ml） 分析結果

128 根據上圖，並無法看出此濃度的 MIC。

64 根據上圖，並無法看出此濃度的 MIC。

32 16 8

同樣的，與先前的 MIC 比較 Kan 在 8μg/ml 應為有效且 MP-VA 在 16μg/ml 以上亦應為有效，但由上圖的結果 知，MP-VA 與 Kan 不但沒有協力反而有明顯的拮抗作 用。

4 2 1

除 MP-VA 在高濃度時有效外，其餘皆無效。

(4) 取兩個特殊濃度比例帶入公式：

a、使用最低濃度 MP-VA 配合較高濃度的抗生素(最符合經濟效益，因為蜂毒較貴)：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Kan＝0.5：64，代入公式，Kan 之 FIC index

＝ ( 0.5/16 ) ＋ ( 64/8 )≒ 8.03→→→拮抗

※MP-VA 濃度在 0.5μg/ml 與 Kan 濃度在 64μg/ml 有拮抗的效果。

b、使用最高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Kan＝64：0.25，代入公式，Kan 之 FIC index

＝ ( 64/16 ) ＋ ( 0.25/8 )≒ 4.03→→→拮抗

※MP-VA 濃度在 64μg/ml 與 Kan 濃度在 0.25μg/ml 有拮抗的效果。

(圖十一) Chloramphenicol 與 Mastoparan-VA 對

E. coli

JM109 之協力作用結果

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Chlo濃度 (μg/ml)

JM109

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Chlo濃度 (μg/ml)

JM109

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

(5) 若固定 Chlo 濃度來討論：

(表八) Chloramphenicol 與 Mastoparan-VA 對

E. coli

JM109 之協力作用結果分析

Chlo 濃度（μg/ml） 分析結果

128 根據上圖，並無法看出此濃度的 MIC。

64 根據上圖，並無法看出此濃度的 MIC。

32 16

同樣的，與先前的 MIC 比較 Chlo 在 16μg/ml 應為有效 且 MP-VA 在 16μg/ml 以上亦應為有效，但由上圖的結 果知，MP-VA 與 Chlo 不但沒有協力反而有明顯的拮抗 作用。

8 4 2 1

除 MP-VA 在高濃度時有效外，其餘皆無效。

(6) 取三個特殊濃度比例帶入公式：

a、使用最低濃度 MP-VA 配合較高濃度的抗生素(最符合經濟效益，因為蜂毒較貴)：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Chlo＝0.5：64，代入公式，Chlo 之 FIC index

＝ ( 0.5/16 ) ＋ ( 64/16 )≒ 4.03125→→→拮抗

※MP-VA 濃度在 0.5μg/ml 與 Chlo 濃度在 64μg/ml 有拮抗的效果。

b、使用最高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Chlo＝64：0.25，代入公式，Chlo 之 FIC index

＝ ( 64/16 ) ＋ ( 0.25/16 ) ≒ 4.01→→→拮抗

MP-VA 濃度在 64μg/ml 與 Chlo 濃度在 0.25μg/ml 有拮抗的效果。

c、使用次高濃度 MP-VA 和次低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Chlo＝32：0.5，代入公式，Chlo 之 FIC index

＝ (32/16 ) ＋ ( 0.5/16 ) ≒ 2.03→→→沒有差別

※MP-VA 濃度在 32μg/ml 與 Chlo 濃度在 0.5μg/ml 為沒有差別。

2.

E. coli

BL21 協力作用結果：

(圖十二) Ampicillin 與 Mastoparan-VA 對

E.coli

BL21 之協力作用結果

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Amp濃度 (μg/ml)

BL21

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Amp濃度 (μg/ml)

BL21

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

(1) 若固定 Amp 濃度來討論：

(表九) Ampicillin 與 Mastoparan-VA 對

E.coli

BL21 之協力作用結果分析

Amp 濃度（μg/ml） 分析結果

128 根據上圖，並無法看出此濃度的 MIC。

64 同上，雖無法看出 MIC，但能降低 Amp 及 MV-A 的劑 量。

32 16 8 4 2 1

除 MP-VA 在高濃度時有效外，其餘皆無效。

(2) 取三個特殊濃度比例帶入公式：

a、使用最低濃度 MP-VA 配合較高濃度的抗生素(最符合經濟效益，因為蜂毒較貴)：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Amp＝0.5：64，代入公式，Amp 之 FIC index

＝ ( 0.5/16 ) ＋ ( 64/48 ) ≒ 1.33→→→沒有差別

※MP-VA 濃度在 0.5μg/ml 與 Amp 濃度在 64μg/ml 為沒有差別。

b、使用最高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Amp＝64：0.25，代入公式，Amp 之 FIC index

＝ ( 64/16 ) ＋ ( 0.25/48 ) ≒ 4.01→→→拮抗

※MP-VA 濃度在 64μg/ml 與 Amp 濃度在 0.25μg/ml 有拮抗的效果。

c、使用第三高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Amp＝16：0.25，代入公式，Amp 之 FIC index

＝ ( 16/16 ) ＋ ( 0.25/48 ) ≒ 1.01→→→相加

※MP-VA 濃度在 16μg/ml 與 Amp 濃度在 0.25μg/ml 有相加的效果。

(圖十三) Kanamycin 與 Mastoparan-VA 對

E.coli

BL21 之協力作用結果

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Kan濃度 (μg/ml)

BL21

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Kan濃度 (μg/ml)

BL21

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

64

32

0.5 16

8

4

2

1

(3) 若固定 Kan 濃度來討論：

(表十) Kanamycin 與 Mastoparan-VA 對

E.coli

BL21 之協力作用結果分析

Kan 濃度（μg/ml） 分析結果

128 根據上圖，並無法看出此濃度的 MIC。

64 與先前的 MIC 比較，MP-VA 在 16μg/ml 有效，而 Kan 在大約 16μg/ml 時有效，雖然能降低 MP-VA 的濃度，

但卻需提高 Kan 的濃度，因此並沒有達到預期的協力作 用。

32 16

MP-VA 的濃度只有少量降低並沒有明顯效果，且大都 需提高 Kan 的濃度。

8 4 2 1

MP-VA 與 Kan 的濃度只有少量降低並沒有明顯的協力 效果。

(4) 取五個特殊濃度比例帶入公式：

a、使用最低濃度 MP-VA 配合最高濃度的抗生素(最符合經濟效益，因為蜂毒較貴)：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Kan＝0.5：128，代入公式，Kan 之 FIC index

＝ ( 0.5/16 ) ＋ ( 128/16 )≒ 8.03→→→拮抗

※MP-VA 濃度在 0.5μg/ml 與 Kan 濃度在 128μg/ml 有拮抗的效果。

b、使用最高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Kan＝64：0.25，代入公式，Kan 之 FIC index

＝ ( 64/16 ) ＋ ( 0.25/16 )≒ 4.02→→→拮抗

※MP-VA 濃度在 64μg/ml 與 Kan 濃度在 0.25μg/ml 有拮抗的效果。

c、使用第三高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Kan＝16：0.25，代入公式，Kan 之 FIC index

＝ ( 16/16 ) ＋ (0.25/16 )≒ 1.02→→→沒有差別

※MP-VA 濃度在 16μg/ml 與 Kan 濃度在 0.25μg/ml 為沒有差別。

d、使用第四高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Kan＝8：0.25，代入公式，Kan 之 FIC index

＝ (8/16 ) ＋ (0.25/16 )≒ 0.52→→→相加

※MP-VA 濃度在 8μg/ml 與 Kan 濃度在 0.25μg/ml 有相加的效果。

e、特殊點(MP-VA：Kan＝4：64)：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Kan＝4：64，代入公式，Kan 之 FIC index＝ ( 4/16 )

＋ ( 64/16 )≒ 4.25→→→拮抗

※MP-VA 濃度在 4μg/ml 與 Amp 濃度在 64μg/ml 有相加的效果。

(圖十四) Chloramphenicol 與 Mastoparan-VA 對

E.coli

BL21 之協力作用結果

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Chlo濃度 (μg/ml)

BL21

128

64

64

32

32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

0.5 16

8

4

2

1

－ ＋

M-VA濃度(μg/ml) Chlo濃度 (μg/ml)

BL21

128

64

64

32

32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

0.5 16

8

4

2

1

(5) 若固定 Chlo 濃度來討論：

(表十一) Chloramphenicol 與 Mastoparan-VA 對

E.coli

BL21 之協力作用結果分析

Chlo 濃度（μg/ml） 分析結果

128 a、 根據上圖，並無法看出此濃度的 MIC。

b、 雖能抑制菌株生長，但似乎與 Chlo 的濃度沒有關 聯。

64 32

與先前的 MIC 比較，MP-VA 在 16μg/ml 有效，而 Chlo 在大約 1.5μg/ml 時有效，雖然能降低 MP-VA 的濃度，

但卻需提高 Chlo 的濃度，因此並沒有達到預期的協力 作用。

16 8 4 2 1

MP-VA 的劑量只有少量降低並沒有明顯效果，且大都 需提高 Chlo 的濃度

(6) 取三個特殊濃度比例帶入公式：

a、使用最低濃度 MP-VA 配合較高濃度的抗生素(最符合經濟效益，因為蜂毒較貴)：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Chlo＝0.5：128，代入公式，Chlo 之 FIC index

＝ ( 0.5/16 ) ＋ ( 128/1.5 )≒ 85.364→→→拮抗

※MP-VA 濃度在 0.5μg/ml 與 Chlo 濃度在 128μg/ml 有拮抗的效果。

b、使用最高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Chlo＝64：0.25，代入公式，Chlo 之 FIC index

＝ ( 64/16 ) ＋ (0.25/1.5 )≒ 4.17→→→拮抗

※MP-VA 濃度在 64μg/ml 與 Chlo 濃度在 0.25μg/ml 有拮抗的效果。

c、使用第四高濃度 MP-VA 和最低濃度抗生素：

MP-VA：抗生素(μg/ml)＝MP-VA：Chlo＝8：0.25，代入公式，Chlo 之 FIC index

＝ (8/16 ) ＋ ( 0.25/1.5 )≒ 0.67→→→相加

※MP-VA 濃度在 8μg/ml 與 Chlo 濃度在 0.25μg/ml 有相加的效果。

陸、 討論

一、雖然有找出能使抗菌胜肽與 Ampicillin、Kanamycin、Chloramphenicol 在某些濃度下 能達到相加的效果，在應用上仍有許多困難，例如：抗菌胜肽是由蛋白質所組成的，

在消化道作用時可能會被消化酵素分解，若能克服此類的問題，抗菌胜肽在使用上 能有更進一步的發展。

二、根據文獻指出，細菌是不易對抗菌胜肽產生抗性，因為抗菌胜肽對細菌的作用多是 在細胞膜上。但在實驗過程中有發現對 MP-VA 具抗性的抗菌品系---JM-109Amp (此實驗數據並本報告未呈現)，此種現象值得繼續研究探討其相關機制。

三、MP-VA 對 E. coli JM-109Amp^R無效的可能原因改變其細胞壁為細菌對抗抗生素的方 法之一，而 Amp 的作用機制為：

(一) 細菌細胞壁合成的過程中，glycopeptide transpeptidase 會將獨立的 peptidylglycan 交 互連結起來；而β-lactam 抗生素會與 glycopeptide transpeptidase 產生不可逆的結 合，而中斷細胞壁的合成。

(二) 抗性菌株可能因此改變了細胞壁的結構，而抗菌胜肽主要是藉著抗菌胜肽與細菌 的細胞膜作用來殺死微生，細胞壁的改變，可能變的可以阻絕抗菌胜肽，造成其失 效。

(三) 對革蘭氏陰性菌而言，可以改變外膜的通透性，使抗生素不易進入細胞，減少對 細胞的傷害。而抗性菌株外膜的改變，可能與一般細菌不同，以產生更好的抗性，

這點可能會使對細胞膜作用的抗菌胜肽失去其效能。

四、MP-VA 與 Kan 產生拮抗的可能原因：

當抗菌胜肽在接近細菌表面時，會形成特殊的二級結構，然後就像鑽頭一樣在細菌 細胞膜上形成孔洞，刺破細胞膜使膜內水分子失去平衡，膜內過高的滲透壓導致細 胞漿質的外洩，最而後致使細菌死亡。

另外一種殺菌膜式為抗菌胜肽通過細菌細胞膜後，雖然不破壞細胞膜的構造，但卻 與細菌內的核酸及蛋白質結合，干擾這些核酸與蛋白質的合成與代謝而康黴素

（kanamycin）屬於胺基糖甘類（aminoglycoside）的一種，胺基糖藉由醣甘鍵相連 組成，其殺菌機制是干擾細菌 tRNA 結合至 30S 核糖體次單位，沒有生太鍵形成，

也不會有聚合醣體（polysome），因此抑制細菌的蛋白質合成。由此判斷，兩種藥 品可能會產生負面影響，而抗菌胜肽是由 15-34 個胺基酸所組成，且具帶正電之特 性，兩種藥物甚至可能互相破壞。

五、MP-VA 與 Chlo 產生拮抗的可能原因：

Chlo 的抗菌機制為抑制細菌的蛋白質合成，而這種酶通常是由 cat 基因所產生的蛋 白，而抗菌胜肽的另外一種殺菌膜式為其通過細菌細胞膜後，與細菌內的核酸及蛋 白質結合，干擾這些核酸與蛋白質的合成與代謝這可能使 MP-VA 與 Chlo 的蛋白結 合，使其失去作用。

六、曾經有報告顯示蜂毒與抗生素(如^Penicilin)有協力的殺菌效果，但由於蜂毒為混合 物，至今還尚未確定與抗生素產生協力作用的是何種物質，也可能另為 MP-VA 以外 的物質，在協力作用上是比抗菌胜肽還有效的，因此在這方面得研究仍值得去探討。

七、對於抗菌胜肽與抗生素產生抗藥性的原因目前只能做初步的推測，未來若能進行深 入研究，或許可找到更有效的抗生素種類與 MP-VA 的搭配組合。

八、未來還可再針對抗菌胜肽 MP-VA 與多種其他抗生素搭配使用，研究是否具協力作用 之效能。

九、根據統計，台灣住院病人第三代抗生素使用量持續增加，也造成多重性抗藥菌的院 內感染率之上升，以抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant

Staphylococcus aureus，MRSA）為例，佔台灣住院病人金黃色葡萄球菌感染之一半，

在加護病房更高達 71%，成為目前多重性抗藥菌最大隱憂之一，未來也可針對有抗 藥性的菌種或金黃色葡萄球菌進行實驗。

十、有文獻指出抗菌胜肽已經可以過基因轉殖細菌的方式產生。本實驗雖未觀察到 MP-VA 與他種抗生素間有協力作用的關係。但是未來也可以研究是否可以透過基因

轉殖微生物大量生成 MP-VA，以達到降低使用成本的目的。

柒、

結論

一、單獨使用抗菌胜肽能達到殺菌的效果，但協力作用的效果並不是那麼的有效。

二、由 MIC 試驗可知屬於第一代抗生素的 Ampicillin 在對菌株的抑制效果並不是很好，

需要使用較高濃度才能達到抑菌效果，更遑論具多重抗藥性的細菌亦具 Ampicillin 產生抗性，更凸顯出抗藥性問題的嚴重性。

三、雖然協力作用的效果並不是那麼的有效，但在某些特定濃度下還是可見其相加效 果，例如：比例 MP-VA：Amp＝0.5：64 、MP-VA：Amp＝16：0.25、MP-VA：Kan

＝8：0.25、MP-VA：Chlo＝8：0.252，甚至幾近協力的抗菌效果，因此在這些濃度仍 有其發展價值。

四、對於抗菌胜肽與抗生素產生抗藥性的原因目前只能做出部的推測。

捌、 參考資料及其他

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