卡德蘭膠架接聚乙烯醇並添加絲瓜纖維作體
外培養的組織工程應用
In vitro cultivation of curdlan-grafted poly(vinyl alcohol)
with luffa aegyptiaca fiber for tissue engineering
研究生 :許家齊撰
指導教授 : 謝文權博士
義守大學
生物科技學系碩士班
碩士論文
A Thesis Submitted toDepartment of Biological Science and Technology I-Shou University
in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Engineering
in Biological Science & Technology
June, 2015
Kaohsiung, Taiwan, Republic of China
I
謝誌
一開始先滿懷著感激的心，感謝指導教授謝文權副教授/系主任四年以 來的指導，不管是在課程上，還是專題實驗上，也對不起因為我不是聰 明和積極的學生，讓老師傷透腦筋。因為從小有身體上的殘缺導致自己 不是那麼的完美，在大二聽到謝文權老師介紹的生醫材料的特色及優 點，讓我下定決心的想要進謝老師的實驗室，為了能夠使自己的身體能 夠完整，和幫助跟我有一樣困擾的人們進行的細胞支架的研究。 論文的完成要感謝老師不斷的指導、修正，才能夠有完成的一天，而 在實驗方面，畢業的學長們給我一些論文上的建議和想法，而學弟妹們， 從旁給我一些建議和儀器上的使用，甚至是在我忙於課業的時候幫助我 實驗後的收拾和善後。在實驗室的生活從大學二年級開始，到現在三年 多的時間裡和大家的相處有喜有悲，不論是學術上的研究還是有人沒掃 地所以請大家喝飲料，這些日子是真實並且充實的，因為有實驗室各位 的陪伴，我的研究生生活才能夠這麼的有趣和精彩。 感謝廖俊嘉、林亙昱學長，在畢業之後不時的關心我的論文和課業， 並且適時的給予我一些幫助和意見。也謝謝從大學到碩士的同學佳軍和 承業，在日常生活的陪伴，謝謝他們陪伴這樣的我，也謝謝他們課業上 的叮嚀、教導。謝謝學弟妹，侑昇、靜樺、毓翔，實驗上的協助，也謝 謝因為沒掃地所以請喝的飲料。II 也感謝義守大學生物科技學系的同學和老師們，謝謝老師們這 5 年來 的教導，謝謝畢業的學長們和學弟妹的陪伴，陪著我走過這些有歡樂、 有傷心、有憤怒的這些日子。 最後，我最感謝的還是我的雙親、兄弟姊妹和祖父母，感謝你們一輩 子的照顧，我不是個聰明的小孩，從小到大也是不斷的讓你們替我煩惱， 哥哥、姊姊在我每次悲觀自怨自艾的時候，總是鼓勵著我和安慰我，而 雖然祖父母提早離開了我，但是我永遠忘不了你們對我的苛護和照顧， 謝謝你們。 義守大學生物科技學系碩士班 許家齊 中華民國一零三年六月
III
縮寫表
PVA-Curdlan poly(vinyl alcohol)- Curdlan PVA poly(vinyl alcohol)
PBS Phosphate Buffered Saline SEM Scanning Electron Microscopy
FT-IR Fourier transform infrared spectroscopy EDS Energy Dispersive X-ray spectroscopy
IV
卡德蘭膠架接聚乙烯醇並添加絲瓜纖維作體外培養的
組織工程應用
中文摘要
本實驗使用聚乙烯醇(PVA)、卡德蘭膠(Curdlan)經由化學交聯製作出吸 水性好，生物相容性佳，結構穩定的多孔性 3D 細胞支架，之後在 3D 細 胞支架中添加絲瓜(luffa aegyptiaca fiber)用來增加細胞支架其機械強度。 本實驗以不同的卡德蘭膠重量，其餘的溶劑、PVA 皆為固定的條件之下 進行製作，製備四組 3D 細胞支架，並由卡德蘭膠濃度高至低將樣品名稱 取為 S(sample)1、S2、S3、S4。 製作出的 3D 細胞支架經由傅立葉紅外線光譜儀(FT-IR)的分析後可以 得知，這兩種物質可以透過化學交聯方式形成共聚合物。PVA-Curdlan 3D 細胞支架其吸水性最高可以達到 300%，藉由壓縮試驗也可知道，隨著混 合卡德蘭膠的濃度增加，3D 細胞支架的抗壓強度也會有所增加，而在 3D 細胞支架中添加絲瓜，也會增加其抗壓強度。 PVA-Curdlan 3D 細胞支架經由電子顯微鏡(SEM)觀察可知，以一定轉 速製作出的 3D 細胞支架可以得到大量的孔洞。而在模擬人體環境的酵素 分解實驗中，3D 細胞支架在兩種酵素的分解作用之下，在 28 天之後其 分解率可以達到 25-40%左右。最後的體外培養實驗中可以知道細胞可以V 在 3D 細胞支架中增殖、生長，經過五天的培養之後，從原本的 5000 細 胞增加到了 2 x 105 顆左右。利用能量散射光譜儀(EDS)分析，可以得之 3D 細胞支架中擁有細胞的一些基本元素，進一步的證明細胞是能夠生長 在 PVA-Curdlan 3D 細胞支架之中。最後由以上結果可以得知，此 3D 細 胞支架能夠運用在再生醫療這方面。 關鍵字: 聚乙烯醇，卡德蘭膠，絲瓜，3D 細胞支架，生物降解高分子，體 外培養
VI
In vitro cultivation of curdlan-grafted poly(vinyl alcohol)
with luffa aegyptiaca fiber for tissue engineering
Abstract
Curdlan and luffa aegyptiaca fibers were grafted to poly(vinyl alcohol) (PVA) to form a porous scaffold. The grafted PVA-Curdlan 3D scaffold was then observed by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Grafting increased the water absorbency of the scaffold by 280%. Scanning electron microscopic (SEM) observations of the material revealed that the 3D scaffold was highly porous when formed using a homogenizer at 100 rpm. Compression testing revealed that, increasing the amount of Curdlan and adding luffa aegyptiaca fiber increased the strength of the 3Dscaffold to 15-35 × 10-3 MPa. Over 28 days, the 3D scaffold was degraded by various enzymes with a weight loss of up to 20-40%. In vitro tests revealed favorable cell proliferation and growth in a 3D scaffold.
Keywords: Polyvinyl alcohol(PVA), Curdlan, luffa aegyptiaca fiber, 3D cell scaffold, biodegradable polymer, in vitro cultivation
VII
目錄
謝誌 ... Ⅰ 縮寫表 ... III 中文摘要 ... IV Abstract ... VI 目錄 ... VII 圖目錄 ... X 第一章 緒論 ... 1 1-1 前言 ... 1 1-2 研究背景 ... 2 1-2-1 生物可降解材料的發展 ... 2 1-2-2 生物可降解性高分子材料分類 ... 3 1-2-3 生物可降解性高分子材料分解的機轉 ... 4 1-2-4 生物可降解性高分子的分解途徑 ... 5 1-2-5 組織工程的發展 ... 5 1-2-6 3D 細胞支架簡介 ... 7 1-2-7 細胞支架的製作方法 ... 8 1-2-8 化學交聯應用的目的 ... 10VIII 1-2-9 聚乙烯醇簡介 ... 11 1-2-10 卡德蘭膠簡介 ... 13 1-2-11 絲瓜簡介 ... 14 1-3 結語 ... .15 1-4 研究動機及目的 ... 15 第二章 原理 ... 17 2-1 交聯原理 ... 17 2-2 細胞貼附原理 ... 20 第三章 實驗 ... 21 3-1 實驗流程 ... 21 3-2 3D 細胞支架製作方法 ... 22 3-3 傅立葉紅外線光譜儀(FT-IR)分析 ... 23 3-4 電子顯微鏡(SEM)分析 ... 23 3-5 PVA-Curdlan 細胞支架的膨潤度 ... 24 3-6 PVA-Curdlan 細胞支架的孔隙率測試 ... 24 3-7 壓縮試驗 ... 25 3-8 生物降解性測試 ... 25 3-8-1 脂肪酵素(Lipase) ... 26 3-8-2 溶菌酶(Lysozyme) ... 26
IX 3-9 體外試驗 ... 27 3-10 能量散射光譜儀(EDS) ... 28 第四章 結果與討論 ... 29 4-1 3D 細胞支架的型態 ... 29 4-2 FT-IR 試驗 ... 33 4-3 膨潤度和孔隙率試驗 ... 35 4-4 機械強度試驗 ... 37 4-5 生物可降解性試驗 ... 39 4-6 生物可相容性試驗 ... 42 第五章 結論 ... 45 參考文獻 ... 47
X
圖/表目錄
表 1 PVA-Curdlan 化學交聯的製作條件 ... 23 圖 1 聚乙烯醇化學結構 ... 11 圖 2 卡德蘭膠化學結構 ... 13 圖 3 絲瓜纖維結構 ... 14 圖 4 聚乙烯醇與卡德蘭膠縮醛化反應過程 ... 19 圖 5 整體實驗流程圖 ... 21 圖 6 支架實體圖 ... 31 圖 7 利用各種比例的 PVA-Curdlan 化學交聯製成的 3D 細胞支架和支 架中絲瓜的 SEM 圖 ... 32圖 8 PVA 和 Curdlan 以及 PVA-Curdlan3D 細胞支架的 FTIR 光譜 ... 34
圖 9 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的 swelling (■ ) 和 porosity (■ ) ... 36
圖 10 添加絲瓜和未添加絲瓜 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的應力應變比較 ... 38 圖 11 Lipaes 和 Lysozyme 下各個比例的分解率 ... 40 圖 12 S1 PVA-Curdlan 3D 細胞支架，未處理和經過酵素分解 28 天後的 SEM 圖。(A)分解前,(B)Lipase,(C)Lysozyme ... 41 圖 13 NIH/3T3 細胞隨著時間的增長在 PVA-Curdlan3D 細胞支架的生長 曲線圖 ... 43
XI
圖 14 NIH/3T3 細胞培養於 PVA-Crudlan 3D 細胞支架，5 天後的 SEM 圖與 EDS 圖 ... 44
1
第一章 緒論
1-1 前言
生物可分/降解高分子材料，是指在自然界微生物，如細菌、黴菌及 藻類作用下，可完全分解或者是降解為低分子的材料。這類材料儲存方 便，只要保持乾燥，不需避光，應用範圍廣，可用於包裝袋和醫療等領 域[1-5]。而生物可分解材料和生物可降解材料皆不會對環境造成破壞；生 物可分/降解材料例如: 聚乙烯醇(PVA)、 聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸 (PGA)、聚羥基烷酸酯(PHA)。 近年來在醫療方面利用生物可降解高分子材料(Biodegradable polymer) 來代替人體內的器官、骨頭或是血管，搭配著細胞的植入，可以培育出 新生的器官、皮膚組織、骨組織等等，使得人類在醫療領域發展突飛猛 進。 而專家學者們利用這種生物可降解高分子材料，製造出一個擁有三維 空間(Three-dimensional space)的立體支架(scaffold)。3D 支架是一種可以 讓細胞在其附著生長並且增生的技術，而使用生物可降解性高分子做為 生物醫療材料，是因為其無毒性和生物相容性良好，適合放入人體並且 不會對人體有不良的反應，而且生物可降解高分子材料較為便宜，所以 我們希望能夠利用這些有良好的可塑性、價格便宜的材料來設計出、製 作出一個能夠用於再生醫療方面的 3D 細胞支架。2 而因為 PVA 的價格便宜、容易取得、無毒，對皮膚無刺激作用，不 會引起人體皮膚過敏，有著生物降解性、生物相容性，因此本篇研究就 是以 PVA 和生物可分解的卡德蘭膠(Curdlan)來進行實驗，PVA 和卡德 蘭膠不需要用複雜的實驗方式、設備來製作，只需要利用簡單的化學交 聯法，就可以改善其形態和強度，製作出不同比例的 3D 細胞支架， 除了探討材料的結構型態，膨潤度、孔隙、機械強度、生物可降解性、 生物相容性等性質，這些性質對於 3D 細胞支架來說都是重要的，對於 運用在組織工程[6-9]這方面。
1-2 研究背景
1-2-1 生物可分/降解高分子材料的發展 生物可分/降解高分子材料在日本和台灣又稱為綠色塑膠[10]，指可以 在自然界分解的一種材質。只要環境有足夠的氧氣、濕度以及微生物存 在的掩埋或堆肥環境中，就可以被微生物給代謝分解掉，分解之後產生 的水、二氧化碳和甲烷這些物質，對環境的影響比較小。 而生物可分/降解高分子材料分為三種，第一種是天然聚合物，第二 種是人工合成聚合物，最後是微生物合成聚合物，而這三種材料各有其 優缺點。 生物分解性的天然高分子，具有良好的生物相容性，但是用來作為細胞3 支架其機械強度不佳，以及分解快速和欠缺熱可塑性，因此目前鮮少有 人單獨使用；而人工合成高分子，雖然有較好的機械性能，但是在生物 相容性的表現較差，難讓細胞附著於此材料上。 專家學者們為了改善這些材料的優缺點，將這些高分子進行改質或是 化學的修飾，希望能夠製作出一個最適合製作細胞支架的材料。 1-2-2 生物可降解性高分子材料分類 生物可降解高分子材料分成[11]: (1)天然可降解高分子 利用植物中的纖維素、木質素和澱粉；利用動物中的殼聚醣、聚氨 基葡萄糖、動物膠以及海洋生物的藻類等等，可製造出有價值的生物 可降解材料。因多數的天然高分子不具熱可塑性，加工成型困難，通 常較難單獨使用。目前都以此天然高分子聚合物混和其他兩種聚合物 來進行改質，使其有較好的加工性。 (2)人工合成可降解性高分子 一般合成可降解高分子比天然可降解高分子有更多優點。合成的材 料通過控制條件，其生產重複性好，可進行大量的生產，通過簡單的 物理、化學改質，就能夠獲得所需的性能，進而滿足不同需求，因此 合成高分子在生物材料中的應用更加廣泛。主要有脂肪聚酯、聚原酸
4 酯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚磷酸酯等。 (3)微生物合成可降解高分子 是利用微生物所產生的體外酵素，將容易被微生物分解的物質分解 成可以被微生物吸收的小分子，吸收之後，再利用體內酵素於體內合 成出高分子化合物。 綜合上述三種製作方法的優缺點: A.天然合成的優點是:生物相容性高、生物降解性較佳。 缺點為:熱塑性差，機械強度不佳。 B.人工/化學合成的優點有:成本較低、產量高、熱塑性好。 缺點為:分解不易、分子量大。 C.微生物合成其優點:材料可完全分解、生物相容性高。 缺點:成本較為昂貴、製作太過於耗時。 1-2-3 生物可分解高分子材料分解的機轉 生物可分解高分子的生物降解是指在生物作用下，聚合物發生降解、 同化的過程。引起生物降解作用的微生物主要包括真菌、黴菌或藻類， 作用機制主要分為三類: (1)生物物理作用:由生物細胞增長而使聚合物部分水解、電離或質子化 而發生機械性的破壞，分裂成低分子碎片。
5 (2)生物化學作用；微生物對聚合物作用而產生細小分子(CH4、CO2、 H2O)。 (3)酶直接作用；被微生物侵蝕部分導致聚合物分裂或氧化崩裂。生物降 解並非單一簡單的機制，而是有著複雜的生物物理、化學作用。 1-2-4 生物可降解性高分子的分解途徑 生物化學作用高分子材料的表面被微生物黏附，微生物黏附表面的方 式受高分子材料表面張力表面結構多孔性溫度和濕度等環境的影響。高 分子在微生物分泌的酶作用下，通過水解和氧化的反應將高分子斷裂成 為低相對分子質量的碎片。微生物吸收或消耗的碎片一般相對分子質量 低於 500，經過代謝最終形成 CO2、H2O 等。生物物理作用微生物侵蝕 高分子後由於細胞的增大致使高分子材料發生機械性破壞。 1-2-5 組織工程的發展 組織工程致力於組織和器官的再生和生成，利用材料學與生物科技的 進步，我們在一個模仿組織或器官形狀的材料中種入細胞，使細胞依著 模型生長成一個新的組織器官，以提供修復人體的組織器官缺損。而這 項技術對於世界上有許多因為器官衰竭或缺少組織甚至是需要修復組 織的患者來說，是一大好事。
6 在以前，外科醫生對於受損組織的處理，都以手術的方式進行，也就 是對患處直接進行手術縫合或利用人體其他組織部位移植來達到修復 的目的。科學家提出了「仿效自然」的想法，希望能夠以人工製造的方 式，創造出和人體器官相同的替代品。漸漸地，科學家們發現，人工合 成的物質若長久置放在人體內，會有慢性發炎等免疫排斥問題產生。於 是開始醞釀出新一代的思維模式，嘗試結合人體組織移植與人工材料修 復的優點，開啟了組織工程的新時代。 人體組織損傷、缺損會導致功能障礙。傳統的修復方法是自體組織移 植術，雖然療效還不錯，但它是以犧牲自體健康組織為代價去進行，後 續可能會導致許多併發症或是附加損傷。而人體器官功能衰竭，我們採 用藥物治療或是暫時性的療法可挽救部分病人的性命，但供體器官來源 極為有限。 組織工程學是 80 年代提出的一個新概念，它結合了工程學和生命科 學的基本，在體外建構出一個有生物活性的物體，可能是組織也可能是 器官，之後植入體內修復組織缺損，替代器官功能。組織工程的科學意 義不僅在於為病人提供了一種新的治療方法，更主要的是提出了複製組 織器官的一個新理念。 組織工程是依循人體組織生長發育的模式，提供近似體內的生長環境 和營養給未完全分化的細胞，例如幹細胞，使這些細胞分裂、成長、及
7 分化成具有特定功能的細胞，進而繁衍成所需的組織，甚至培養不同功 能的組織，以形成具特殊功能的器官，解決缺乏移植組織或器官的問 題。若細胞是來自被移植者，則所培養的組織尚可避免免疫系統的排斥 問題。 1-2-6 3D 細胞支架簡介 組織再生的關鍵點之一是，細胞要在何處生長?並且分化成我們所需 要的組織？而我們必須提供一個舒適並且安全的生長環境，可以讓細胞 能夠在其生長，然而這邊講到的結構就是在組織工程中所使用的「細胞 支架」（cell scaffold）[12]。 我們可以把支架想像成一個家，或是一個種植植物的溫室，可以將其 放置在體外或是體內，讓細胞能夠在支架中增生分化，形成組織，再移 植進入患者體內，或者直接在患者體內增生分化成患者所需的組織。 我們要讓細胞享受一個舒適的環境，所以支架必須要有足有足夠的強 度可以承受日後植入人體的情況，並且需要具備良好的生物相容性，有 著合適的表面性質，以供細胞能夠附著生長、有相互連接的孔隙可以使 營養物質及互通有無，具有生物可分解可降解的性質以及適當的分解速 率，以配合細胞的繁殖最後當組織器官長好之後支架也可以分解代謝出 人體。
8 我們可以想像出細胞支架會有許多相互連接的孔洞，就好像海綿的形 狀一樣，方便細胞和營養物質流通。而細胞支架就是要能夠讓細胞附著 在支架上，吸取著從孔洞流入的養分，而這些孔洞的大小，也必須也要 能讓細胞通過。 而組織工程發展的重要條件有下面三點。 (1)生物相容性：因為要讓細胞附著在細胞支架上成長，所以細胞支架的 材料必須是要沒有毒性，具有相當的生物相容性，才不會傷害細胞及病 患。支架若能在細胞繁殖的期間，同時分解成對人體無害的物質，這樣 就能達到更好的生物相容性[13,14] (2)生物可降解：細胞支架必須使用可降解的材料，例如膠原蛋白、幾丁 質等天然聚合物，但材料的選用仍須考慮應用的範圍以及在體內分解的 速率。 (3)支架強度：細胞支架最後將移植入人體內，所以必須要有一定的機械 強度，不然整個結構可能受到人體內各種外力的影響而崩塌。所以，在 考慮孔洞大小的時候，也不可以忽略掉整體結構的強度[13]。 孔洞的孔徑大小只有 0.05-0.2 mm，而且需要相互連接，所以我們必 須利用一些方法，才能製作出好的支架，這也是一個研究者最大的課題。 1-2-7 細胞支架的製作方法
9 (1)鹽析法 這是一種先將材料用溶劑溶解掉後，接著加入水溶性的填充物，例如 氯化鈉，然後放置於培養皿中，等待溶劑揮發之後，就會形成塊狀的混 合物，並將此混合物浸泡水中數天，溶解去除填充物。這樣原本填充物 所占的空間就變成了多孔結構，而填充物的大小和比例是可以控制孔洞 的大小和比例。 (2)冷凍乾燥法 冷凍乾燥法[15-18]，是將材料溶解之後，放置入液態氮中急速冷凍後， 再進行抽真空冷凍乾燥持續數天，將水分抽出。這麼一來，原先的溶劑 會因為真空乾燥的緣故而揮發掉，使原本所占有的空間變成孔洞。此法 也可以利用溶劑成分來控制孔洞的大小和比例。 (3)熔積成形法 熔積成形法[19]，方法是將材料做成線材，此線材先經過加熱管加熱到 其熔點附近，接著由噴嘴噴出。因為噴出之後，材料會很快的冷卻形成 固體，所以利用控制噴嘴的方式，我們可以進而的設計出我們所想要的 形狀甚至是結構。 其餘還有一些方法可以製作細胞支架，例如:合成法(Synthesis method) [20,21]、薄膜積層法、氣體發泡法、相轉移法、高分子／陶瓷複合發泡法 等等。目前有這麼多的方法正在不同的研究者實驗中，期盼的就是幫細
10 胞蓋一個舒適的家，讓細胞可以舒適的生長繁衍。 1-2-8 化學交聯應用的目的 交聯是指在聚合物大分子鏈之間產生化學反應，從而形成化學鍵的過 程。聚合物交聯後，其力學性能、熱穩定性、機械性能、耐溶劑性都有 不同程度的提高。如果交聯反應發生在不同聚合物尤其是互不相容的聚 合物之間，可大大提高兩種聚合物的相容性，甚至使不相容組分變為相 容組分。化學交聯是指交聯劑在一定溫度下分解產生自由基，引發聚合 物大分子之間發生化學反應，從而形成化學鍵的過程。化學交聯需要有 交聯劑存在，並在一定溫度下進行。
11 1-2-9 聚乙烯醇簡介
(1)材料介紹
聚乙烯醇[23]，英文名 Polyvinyl alcohol，簡稱為 PVA 是我們最熟悉的
一種水溶性高分子，它是白色粉末狀，並且是由聚醋酸乙烯酯水解而得。 圖 1 聚乙烯醇化學結構[22] (2)材料特性： A. 聚乙烯醇具有極性，能夠溶於水。 B. 聚乙烯醇的水溶液性能與澱粉溶液類似，滴上碘會變成藍色，但是 聚乙烯醇不會發霉也不會被細菌破壞。 C. 水是聚乙烯醇最好的溶劑。 D. 聚乙烯醇的黏度和它的分子量大小幾乎成正比，所以製備時聚乙烯 的黏度有高、中、低三種。聚合度在 1500 以上的屬高黏度(高分子)，
12
聚合度在 1000～1500 的屬中黏度，聚合度在 1000 以下的屬低黏度。
E. PVA 對人體皮膚無害，對陽光和紫外線有較佳的抵抗性。 F. 具有平滑性、耐磨擦性、接著性、不腐敗。
(3)應用：
通過 PVA 聚合度的選擇能夠很方便的改變 PVA 水溶性的黏度，PVA
具有非常好的熱可塑性和黏合性。其應用主要如下。[24 -27] A. 黏合劑: 在纖維改性和造紙業方面應用相當廣泛。在紙張作業中作 為黏合劑更顯出優越的黏接力。 B. 相容性: PVA 可以單獨使用，但是考慮到其性能要求的互補合使用 上 的經濟性， 一般會期他生物可降解高分子合併使用。均可表現 出良好的相容性。 C. 成膜性: 成膜性的特點可以運用在包裝或是化妝品等行業。 (4)聚乙烯醇的優缺點： PVA 無毒，對皮膚無刺激作用，不會引起皮膚過敏，但是其粉塵會對 眼睛有刺激性作用，對於陽光和紫外線也有較佳的抵抗性。工業上，可 利用 PVA 脫水，而吸收與過濾的特性也可提供製程的簡化。對於環境 有很大的幫助，也非常的環保。
13 1-2-10 卡德蘭膠簡介
卡德蘭膠(Curdlan) [28]為糞產鹼桿菌 Alcaligenes faecalis var. myxogenes
所產生的天然多醣體，又名凝膠多醣或熱凝膠，為天然的膠狀物。 圖 2 卡德蘭膠化學結構式 目前已知卡德蘭膠是無毒性的，且無致癌性或生殖毒性無微生物的代 謝產物，是最常使用的食品添加劑，主要是因它加熱後，具有凝固的能 力。卡德蘭膠的特徵是水溶性的，該結構加熱到 70℃後接著冷卻會改變 成為固體。因為它是一種天然聚合物，像膠原蛋白，藻酸鹽和其它天然 聚合物。這是一個好的條件，應用於組織工程這個方面。 卡德蘭膠具有多種的特性可以分類為生物材料。而卡德蘭膠的缺點，
14 它是一種天然的親水性聚合物，其機械性能會因為單獨的使用會有所問 題出現，並在細胞培養實驗中會有一些困難。 1-2-11 絲瓜簡介 絲瓜英文名 Luffa aegyptiaca[29]，而絲瓜乾指的是將絲瓜老化後曬乾的 內部纖維結構，這時候絲瓜乾的纖維很有韌性，日常生活中人們常將這 部分當作刷洗的工具。絲瓜乾的化學成分：木聚醣(xylan)，甘露聚醣 (mannan)，半乳聚醣(galactan)等。目前已知絲瓜乾是沒有毒性的，其 絲瓜絡當作中藥使用也有多種療效，可以用於通經活絡、解毒消腫、風 濕、乳汁不通、咳嗽等等症狀。 圖 3 絲瓜纖維結構
15 1-3 結語 在以前的醫療水準，人們認為只要體內缺少器官，就只能夠等著別人 的移植捐贈，才有辦法使自己看起來有點完整卻又不太完整。然而現在 科技的發展逐漸的能夠讓我們可以自己培養出利用自己細胞長出來的 組織器官，移植回我們的體內，也不會有排斥的反應。但是這種生醫材 料也是必須要經過嚴謹的體外和動物實驗，最後進行臨床試驗，才能夠 上市。 現今的組織工程所需的知識範圍很廣，需要多方的齊心合作，結合眾 人的智慧，才有辦法達到完美的境界，最後期許在短短的幾年後，我們 都能夠享受到，發展良好的組織工程。 1-4 研究動機及目的 組織工程是以組織再生達到回復人體正常功能為目標，其三大主要因 素為:細胞培養、生醫材料與支架、及生長因子(growing factor)。其中 3D 細胞支架是用來提供細胞附著與增生的空間[30]。 最近這幾年，製造 3D 支架的技術不斷被發展出來，例如 纖維鍵結 (Fiber bonding) 、 膜 積 層 (Membrane lamination) 、 溶 劑 鑄 造 / 鹽 析 (Solvent casting / particulate leaching)、二氧化碳滲透(Gas forming)、相
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分離(Phase separation )、以及冷凍乾燥(Freeze drying)。然而這些方法 皆能夠做出 3D 支架，但結構及孔徑大小這些數值無法固定。如果想製 作出孔徑大小固定的支架能夠利用快速原型 (Rapid Prototyping、RP)、 3D printing 又稱增材製造(Additive Manufacturing，AM)等技術來製作 3D 組織工程支架，可以製作複雜支架外型與內部結構。 而本研究所利用的方法是化學交聯法，也是一種能夠製作 3D 組織工 程用支架的方法。接下來的實驗使用卡德蘭膠的原因是因為其無毒性， 且無致癌性或生殖毒性，而且目前尚未被使用在組織工程方面。卡德蘭 膠是一種天然聚合物，例如:膠原蛋白，藻酸鹽和其它天然聚合物。我 們讓卡德蘭膠和聚乙烯醇混和，利用聚乙烯醇的特性用來增加卡德蘭膠 的熱塑性和機械性能，讓這個材料有更好的性能用來作為 3D 細胞支架。
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第二章 原理
2-1 交聯作用
交聯是指在聚合物大分子鏈之間產生化學反應，從而形成化學鍵的過 程。聚合物交聯後，其力學性能、熱穩定性、機械性能、耐溶劑性都有 不同程度的提高。如果交聯反應發生在不同聚合物尤其是互不相容的聚 合物之間，可大大提高兩種聚合物的相容性，甚至使不相容組分變為相 容組分。化學交聯指的是交聯劑在一定溫度下分解產生自由基，引發聚 合物大分子之間發生化學反應，從而形成化學鍵的過程。化學交聯需要 有交聯劑存在，並在一定溫度下進行。 交聯反應[31]對細胞支架性能的影響，交聯反應會降低高分子鏈之間的 滑動能力，如果交聯密度不高，非晶態的高分子就變得更有彈性。 交聯密度增加，抗拉伸壓縮強度也會增加，但達到一定交聯程度之後 會有所下降，而隨著交聯密度的增加，伸縮率和膨脹度降低，硬度及玻 璃化溫度也會上升。 本研究使用的化學交聯劑為甲醛，以甲醛進行實驗是為了縮醛化反應 能夠順利進行，最後能夠形成具有彈性的 3D 細胞支架。雖然甲醛經過 了化學反應，其原本所具有的毒性會有所減少，但是不怕一萬只怕萬 一，所以成形後的細胞支架，我們仍然會以大量清水清洗，避免造成日 後細胞實驗的誤差。18
而本實驗為聚乙烯醇與甲醛的反應，除了分子內部能形成縮醛之外， 分子間也能起作用發生交聯反應。如圖 4 為 PVA 和卡德蘭膠的縮醛化 反應。
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2-2 細胞貼附原理
動物細胞其特性分為兩種:懸浮型(Suspension)和貼附型(Adherent)。懸 浮型的細胞，通常不貼附在支持物上便可生長，有著胞體圓形，在培養 液中生長空間大，並且可長時間的生長；而貼附型細胞只能依賴貼附生 長，當生長過多之後期生長速度會明顯減慢，這種現象與細胞分化有關。 而本篇所使用的是小鼠纖維母細胞(NIH/3T3)它就是一種貼附型的細 胞，而要給這種貼附型細胞生長的環境必須提供一個較大的空間，所以 選擇了具有多孔結構的 3D 細胞支架，因為它能夠提供大量的支持面以 提供細胞附著以及生長，而細胞的黏附效果會因為所選的可降解高分子 材料會有所差別。 本篇研究所選的 PVA 和卡德蘭膠製作而成的 3D 細胞支架由於兩者都 是能夠完全溶於水的親水性物質，所以製成的細胞支架其親水性有利於 細胞的生長和代謝物的交換，並且有著大量適合細胞生長的多孔性結 構，所以提供貼附型細胞更多的貼附面積和良好的生長環境。21
第三章 實驗
3-1 實驗流程
22
3-2 3D 細胞支架製作方法
本實驗使用的材料聚乙烯醇(PVA)、卡德蘭膠(Curdlan)購於日東化學 製藥公司(Nitto Chemical Pharmaceutical Company)、甲醛(Formaldehyde)
購於 Aldrich Chemical Company、硫酸 (H2SO4)購於第一化學公司(First
Chemical Company)，所有的材料和藥品購入後除了使用水去稀釋外，皆 沒有使用任何的加工方法處理，製作條件如表一所表示。本實驗以不同 的卡德蘭膠重量，其餘的溶劑、PVA 皆為固定的條件之下進行製作，製 備 四 組 3D 細 胞 支 架 ， 並 由 卡 德 蘭 膠 濃 度 高 至 低 將 樣 品 名 稱 取 為 S(sample)1、S2、S3、S4，如表一所顯示。 先將 PVA 和卡德蘭膠分別加入 20ml 的 RO 水中，並且加熱攪拌致其 完全溶解，最後形成透明膠狀的水溶液。將兩者混和再一起並且以 90℃、100rpm 充分加熱攪拌 30 分鐘，使兩者充分混合並蒸發多餘的水 分，此時才混合物應為黏稠狀。接著將混合物放置在室溫下冷卻一段時 間，之後直接加入 12ml 的 20%硫酸水溶液將混和物的鍵結打斷，攪拌 使其充分反應後，接著加入 5ml 甲醛使混合物重新鍵結後依樣均勻的攪 拌，因為細胞支架的致孔劑為攪拌混合物時進入液體的空氣，所以在製 作的過程中，必須維持一定的攪拌速率。最後將混合物倒入 3 根已經事 先將絲瓜放置好的離心管中，最後放入 90℃的烘箱烘乾 90 分鐘使材料 成形，取出後以大量清水洗淨殘留在材料上的硫酸，洗淨後細胞支架先
23 以冷凍乾燥處理，接著保存在防潮櫃中。 表 1 PVA-Curdlan 化學交聯的製作條件
3-3 傅立葉紅外線光譜儀(FT-IR) 分析
將原料與交聯後的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架，利用冷凍乾燥去除水 分後，將乾燥的待測物品壓成片後，再置入 FT-IR 進行分析。光譜吸收 範圍為 650cm-1 - 4000cm-1 ，分析後觀察 PVA-Curdlan 3D 細胞支架官能 基的變化。並繪製成對照圖表。3-4 電子顯微鏡(SEM) 分析
將待觀測的細胞支架樣本完全乾燥後，以導電帶黏在銅座上，並以真 空蒸鍍機度上鉑(Pt)，然後放置於 SEM 的樣品基座上，調整致所要觀察 的位置，進行觀察拍攝。而經過酵素分解的細胞支架樣品也以相同的方 式進行處理並且拍攝型態。而有培養細胞的 3D 細胞支架則需先在 10% 的甲醛浸泡 24h，使細胞能夠慢慢脫水並且固定在細胞支架上，再以冷24 凍乾燥的方法乾燥後，如上述處理待觀測的細胞支架的處理方式進行 SEM 觀察並且進行能量散射光譜儀(EDS)分析 3D 細胞支架表面所含的 元素物質。
3-5 PVA-Curdlan 細胞支架的膨潤度
經過交聯後的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架我們以冷凍乾燥的方式將它 乾燥，接著我們將乾燥的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架在室溫下浸泡於 RO 水中 5 分鐘後取出，並將膨潤後的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架擦拭多餘 的水分之後，進行實驗。我們將各比例材料，以完全吸水後的重量和完 全乾燥之下的重量進行比較分析對液體的吸收程度，最後以下列公式進 行計算膨潤率[32] ，並以曲線的方式呈現數據。 Swelling (%) = [ (Gs – Gi) / Gi ] × 100 (公式 1) GI 代表凍乾 PVA-Curdlan 三維支架材料的初始重量，而 Gs 為膠體的重 量在膨脹的狀態。3-6 PVA-Curdlan 細胞支架的孔隙率測試
孔隙在 3D 細胞支架的研究中是一個重要的因子，其原因在於孔隙可 能會對 3D 細胞支架的一些性能有關，例如: 支架的機械強度、細胞的 生物相容性、酵素的分解率等等有著很大的影響。 這個實驗的孔隙率[33] 是藉由體積的移除去計算出來。將 3D 細胞支架樣品浸泡於已知體積(V1)25 的 RO 水中，等待液體充分的進入 3D 細胞支架樣品內，此時浸泡細胞 支架樣品的液體總體積稱為 V2。將移除細胞支架樣品後所剩餘的液體 體積稱為 V3。計算方式如下： P (%) = [( V1−V3) / (V2−V3) ] x 100 (公式 2)
3-7 壓縮試驗
觀察細胞支架的機械性質，並希望製作出的細胞支架能夠具備有良好 的抗壓強度，所以我們將不同濃度比例製成的 PVA-Curdlan 3D 細胞支 架進行壓縮試驗，而本實驗不進行拉伸試驗的原因是因為，PVA-Crudlan 3D 細胞支架當中有放置絲瓜，而我們在之前的試驗中有進行過拉伸試 驗，試驗出來的結果顯示出 PVA-Curdlan 3D 細胞支架有兩個斷裂值， 推測一個斷裂值是屬於絲瓜的，而另一個斷裂值是 PVA- Curdlan 3D 細 胞支架的。因為此原因，所以我們沒有選擇繼續拉伸試驗。本實驗是利 用 Shimadzu EZ-test 萬能試驗機來進行實驗。 將直徑 1.5cm X 高 2cm 的材料放置在壓縮機上，以 5mm/min、500kgf 進行拉力試驗。並探討各種比例的材料，在最大力量之下的應變和應力。3-8 生物降解性測試
製作完成的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架，利用生物可降解試驗來觀察 3D 細胞支架分解時重量上的變化。本實驗為了模擬人體的環境，使用26 的二種酵素，分別為 Lipase 脂解脢(20μg/ml)、Lysozyme 溶菌酶(20μg/ml) 這兩種酵素，並且加入一組以 PBS 溶液當作對照組，進而和兩種酵素進 行比較對照。將製作完成的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架各取厚度約為 1 公分，之後放進 15ml 的離心管，其中加入 2ml 各種酵素。將離心管放 置在 37°C、100rpm 的震盪式恆溫水浴槽內進行試驗，並且持續 4 週。 每週固定時間取出 3D 細胞支架，乾燥後分別測定分解後的重量損失。 以下列公式來計算其降解率。 Weight loss(%) = (W0-Wt) / W0 x 100% (公式 3) W0和 Wt為支架分解之前的重量以及分解之後的重量。 3-8-1 脂肪酵素(Lipase) 脂肪酵素又稱為胰脂酵素或是解脂酵素，是一種能促進分解脂肪的酵 素。動物體內含脂肪酵素較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織，在腸液 中含有少量的脂肪酵素，用於補充胰脂肪酵素對脂肪消化的不足，在肉 食動物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在動物體內，各類脂肪酵素 控制著消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過程；細菌、真菌和酵母 中的脂肪酵素含量更為豐富。 3-8-2 溶菌酶(Lysozyme) 溶菌酶是一種低分子量的、不耐熱的堿性蛋白質，其中富含精氨酸。
27 溶菌酶為正常機體免疫防御機制的組成部分。因具有溶解細菌細胞壁的 作用而得名，是能溶解某些細菌的一種糖水解酶。溶菌酶主要存在于動 植物的組織液和某些微生物體內，如鼻粘液、眼淚、唾液、卵蛋白、枯 草桿菌培養物和某些蔬菜中。 該酶能水解細菌的細胞壁中 N-乙酰氨基葡萄糖和 N-乙酰胞壁酸之間 的β-1，4-糖苷鍵，故又稱胞壁質酶，即 N-乙酰胞壁質糖苷聚糖水解酶。 在人體內，溶菌酶存在於嗜中性球、單核細胞和巨噬細胞內；也存在於 黏膜分泌液中，成為體表防禦能力之一。
3-9 體外試驗
將小鼠纖維母細胞(NIH/3T3 Fibroblasts) 培養在 10cm 的培養皿，其內 的細胞培養液成分含有 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、 FBS(Fortified Bovine)10%、Penicillin Streptomycin Solution 1%，和 2.2gNaHCO3 並且以 HCL、NaCl 進行調整培養液的 PH 值約 7.4。培養箱的 環境為 37℃和含有 5%CO2以及 95% 的相對濕度。將 PVA-Curdlan 製作 的 3D 細胞支架進行細胞培養，培養五天，每 24 小時計算一次細胞數量， 並將計算得到的細胞數量繪製出細胞生長曲線。 將體積約 1x1x0.1cm 的 3D 細胞支架放入 24 孔盤之中，考慮到細胞生 長的速率含培養孔盤的空間，所以每孔加入 5000 顆細胞至 3D 細胞支架
28 的表面，之後放置 37℃和 5% CO2以及 95% 的相對濕度的培養箱之中 並且在 30 分鐘後取出，再將細胞支架移至沒有添加任何試劑的孔盤中， 並添加 2mL 培養一開始進行細胞附著的試驗，培養五天後將含有細胞 的 3D 細胞支架並泡於 5mL 10%的甲醛 24 小時，甲醛易溶脂類物質， 因此能穿過細胞膜並進入細胞內。使用甲醛固定細胞使細胞能夠完整的 固定在 3D 細胞支架上，透過觀察細胞在 3D 細胞支架上的生長情形， 確認細胞支架在醫療上面的應用，並利用 EDS 儀器分析出是否在 PVA-Curdlan 3D 細胞支架上有細胞的元素。
3-10 能量散射光譜儀(EDS)
EDS 為能量散射光譜儀(Energy Dispersive Spectrometer)的簡稱，主要 利用電子束所激發的特性 X 光來檢測待測樣品的定性或半定量化學成 份分析。擷取物質放射出來的特性 X 光，分析其能量散佈圖，即可知該
樣品元素的組成[34]，使原有的物性結構分析能力外，再增添化學元素分
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第四章 結果與討論
4-1 3D 細胞支架的型態
利用先前 PVA 和卡德蘭膠化學交聯形成的 3D 細胞支架進行觀察。我 們首先觀察其外觀，接著使用 SEM 電子顯微鏡來觀察其形態和變化。 圖 6 顯示為 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的外觀。乾燥和濕潤的狀態以 及用夾子去壓縮它的實際情況。 圖 7 顯示的是 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的電子顯微鏡圖。3D 細胞支 架的孔洞是藉由攪拌進入當初的混合物中的氣體所產生的，由圖 7 知經 由攪拌交聯的 3D 細胞支架的內部是有孔洞的存在，但是本實驗所使用 的孔洞為攪拌過程中進入的小氣泡，導致細胞支架的孔洞大小可能有分 布不均勻的情形，雖然可以固定攪拌的速率，但是對於控制氣泡的大小 和均勻度仍然有限，但因為孔洞大小的分布不均，如此更能夠使細胞更 不會掉落出細胞支架，而長在培養器具之中。 我們也藉由 SEM 電子顯微鏡的觀察發現，3D 細胞支架內部有著許多 凹凸不平的結構，然而這樣的結構可能可以提供給細胞一個良好的生長 空間。最後我們將這些 3D 細胞支架進一步的探討其物性和細胞培養之 用。化學交聯的 PVA-curdlan 3D 細胞支架的型態，如圖 所示。經由均 質機固定轉速攪拌後的 PVA-curdlan 3D 細胞支架如圖所示可以製作成 多孔的支架，此類多孔的結構是做為組織工程用途的支架所必須要具備30
的一個材料結構。然而，圖中拍攝出絲瓜(Luffa aegyptiaca) 材料。加入 絲瓜材料於支架中的目的是為了要增加支架的機械強度。
31 圖 6 支架實體圖。(圖 A 為乾燥以及濕潤的支架，圖 B 為添加絲瓜的支 架，圖C 為壓縮的支架) A B C
32 圖 7 利用各種比例的 PVA-Curdlan 化學交聯製成的 3D 細胞支架和支 架中絲瓜的 SEM 圖 S4 S3 S2 S1
33
4-2 FT-IR 試驗
經由化學交聯製成的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架，我們為了瞭解其是否
有成功的交聯，因此利用 FT-IR 來探討其結構變化。
圖 8 所示為 PVA 與 Curdlan 交聯後的 FTIR 圖形。PVA 的甲基(CH2)
出現在 800cm-1、1000cm-1、3000cm-1 附近，而 C=O 基出現的範圍在 1700cm-1和 1150cm-1以及 3400 - 3640cm-1附近的 OH 基。PVA 和卡德蘭 膠的官能基吸收峰在化學交聯後的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的 FT-IR 中 也同樣的可以觀察到。 由化學交聯 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的 FT-IR 吸收峰圖中可以得知， 交聯後的支架出現的主要吸收峰值，都有明顯的變化。顯示經化學反應 之後，PVA 和卡德蘭膠確實能夠形成交聯。
34
圖 8 PVA 和 Curdlan 以及 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的 FTIR 光譜
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4-3 膨潤度和孔隙率試驗
PVA 和 卡 德蘭 膠 為水 溶 性的 材 料， 為 了瞭 解 經過 交 聯反 應後的 PVA-Curdlan3D 細胞支架的膨脹率，和其孔隙率，我們進行了測試。 圖 9 所示為 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的膨潤度 swelling ( ■ ) 和孔 隙率 porosity ( ■ )。由圖所示的結果可知，S1(4:2)時支架的膨潤度 swelling ( ■ )雖然是四種比例中最低的，但是其膨潤度還是可以達到接 近 200%。然而隨著 Curdlan 濃度的減少，其膨潤度越高，S4(4:0.5)的支 架其膨潤度接近 300%。而 porosity ( ■ )的結果由圖中可知，利用均質 機以 100rpm 攪拌後的 3D 細胞支架，孔隙率雖然隨著 Curdlan 的減少而 增加，但是四個比例幾乎都維持在 80-90%之間。36
圖 9 所示為 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的 swelling ( ■ ) 和
37
4-4 壓縮試驗
3D 細胞支架用作於再生醫療器材必須要有一定的強度，以便能夠支 撐細胞在培養期間能夠使其維持形態，所以我們為了瞭解 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的強度變化，使用了 Shimadzu EZ-test 的壓縮試驗機進行 測試。 圖 10 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的應力應變圖。Curdlan 的性質是加熱 後會變硬，所以變硬的情況會反映在製作成 PVA-Curdlan 3D 細胞支架 的壓縮強度上。並由圖 10 可以得知，壓縮強度會隨著 Curdlan 的比例增 加而降低。 我們也進一步的探討添加絲瓜的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架和未添加 絲瓜的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的抗壓強度差別，如圖 10 示未添加絲 瓜的 3D 細胞支架的抗壓強度比添加絲瓜的 3D 細胞支架還來的低，由 此數據可以得知，添加絲瓜能更增強 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的抗壓 強度。 最後結果顯示出經由交聯後的 S4 PVA-Curdlan 3D 細胞支架在未添加 絲瓜的時候其抗壓強度為 8 x 10-3 MPa，而在添加絲瓜後的 3D 細胞支架 其抗壓強度提高到 15 x 10-3 MPa，證明了添加絲瓜能夠提高 3D 細胞支 架的強度。38
圖 10 為添加絲瓜和未添加絲瓜 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的 應力應變比較圖。
未添加絲瓜
39
4-5 生物可降解性試驗
組織工程的植入材料，最重要的除了在一定期間內保持一定的強度之 外，也要能夠隨著細胞的生長，3D 細胞支架能夠慢慢的被人體給分解， 變成小分子排出人體。因此模擬了人體的環境，我們進行了利用酵素分 解的試驗，我們利用的 Lipase、Lysozyme 這兩種酵素來探討 3D 細胞支 架的分解率，Lipase 是屬於脂類分解酵素，而 Lysozyme 則是屬於糖質 分解酵素。 圖 11 顯示出 3D 細胞支架在各種酵素影響下的生物分解率。不同比例 的 PVA-Curdlan 3D 細胞支架在經過 28 天的實驗之後，PVA-Curdlan 3D 細胞支架的酵素分解率都有明顯的提升。在對照組中我們將支架放入不 加酵素的 PBS 水溶液中進行實驗，結果顯示出雖然支架會隨著反應時間 的增加，會有些許的分解，而這可能是因會支架浸泡於水中膨脹的原 因，使得支架鍵結較弱的部位崩壞。最後這四種不同濃度比例的 3D 細 胞支架，在這 28 天之後的生物降解率大約都在 25%-45%左右，顯示這 種 PVA-Curdlan 3D 細胞支架可以做為長時間植入人體的再生醫療材 料，並隨著時間的增長和酵素的影響而逐漸分解，證明了此 3D 細胞支 架是能夠被人體酵素分解的，如圖 12。40
41 圖 12 S1 PVA-Curdlan 3D 細胞支架，未處理和經過酵素分解 28 天後的 SEM 圖。(A)分解前,(B)Lipase,(C)Lysozyme。 A B C
42
4-6 生物相容性試驗
為了瞭解 PVA-Curdlan 3D 細胞支架的生物相容性，我們使用了小鼠 纖維母細胞(NIH/3T3)移植進細胞支架內培養，並觀察細胞生長的情況。 由圖 13 知，此 PVA-Curdlan 3D 細胞支架具備有良好的生物可相容 性。此項實驗我們將使用支架材料與 NIH/3T3 細胞共培養。在經過 5 天 的培養之後，細胞能夠從原先殖入的 5x103，增生到跟原先的多了大約 40 倍(到了 2x105)，結果表明隨著培養時間的增加，支架上的細胞附著 數量也隨之增加。使用絲瓜使材料的提升支架的強度與支撐力，且製成 的孔徑大小是適合細胞增殖的。這樣的結構強度不僅可讓支架承受大量 的細胞附著，還可能有助於提升組織的再生速率。然而，在圖 14 的 EDS 試驗結果顯示，在支架材料上附著的物質含有鈣(Ca)、磷(P)等元素，此 元素成分是原先 3D 細胞支架中所不存在的。最後，藉由 EDS 儀器分析 的結果，可以更進一步證明了在 3D 細胞支架上附著的就是與支架培養 的細胞。此項實驗結果表明以 Curdlan 與 PVA 化學交聯而成的 3D 細胞 支架在組織工程的領域中是能夠被運用的。43
圖 13 NIH/3T3 細胞隨著時間的增長在 PVA-Curdlan 3D 細胞支架 的生長曲線圖。
44
圖 14 NIH/3T3 細胞培養於 PVA-Crudlan 3D 細胞支架，5 天後的
45
第五章 結論
Curdlan 與 PVA 可以藉由簡單的化學交聯法製作出複合式 3D 細胞支
架，其四種比例的 3D 細胞支架的孔隙率可以達到 80%以上，膨潤度也 有達到 200%-300%左右。
從 FT-IR 圖顯示，PVA 和 Curdlan 確實能夠交聯形成聚合物。SEM 圖 也明顯地顯示出 PVA 和 Curdlan 化學交聯製成的細胞支架有著良好的 3D 空間。 此 3D 細胞支架隨著 Curdlan 的增加雖然會增加其抗壓的強度，但是 會導致細胞支架的膨潤度稍微降低。 而在壓縮試驗中顯示，添加絲瓜的 3D 細胞支架的抗壓強度明顯的比 未添加絲瓜的細胞支架來的高，證實了我們當初推測的情況，以上的實 驗數據也足以證明此 3D 細胞支架具有一定的機械強度用在於人體。 PVA-Curdlan 3D 細胞支架在經過 28 天的酵素分解下，4 種比例的細 胞支架其分解速率都有 25%以上，我們推測 Curdlan 的濃度增加，細胞 支架的結構隨之密集導致孔隙率的降低，可能導致酵素分解的不易。 在體外試驗的實驗顯示，3D 細胞支架隨著培養時間的增加，細胞的 數量也會逐漸的增加，而在 120 小時之後細胞數量大約可以達到 20x 104 左右，最後以 EDS 儀器分析細胞支架的表面，由得到的數據可以知道， 支架上有磷、鈣等細胞的基本元素存在，證明了正常的細胞能夠附著於
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細胞支架的表面，此實驗數據更證明了 PVA-Curdlan 3D 細胞支架具有 生物相容性，能夠使細胞附著和增生在此細胞支架上。
藉由以上優點可以期待 Curdlan 與 PVA 添加絲瓜的 3D 細胞支架可以 在未來的組織工程上有更好的應用。
47
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