認識身旁的小傢伙
(23)－觸酶在維持
昆蟲之氧化還原恆定的生理角色
黃瑜緹
1施雯文
2蔡任圃
3* 1上 海 外 國 語 大 學 國 際經 濟 與 貿 易專 業 2國 防 醫 學 院 醫 學 系 3臺 北 市 立 第 一 女 子 高 級 中 學壹、前言
氧 化 還 原 電 位(Oxidation-Reduction Potential, ORP)是 評 估 物 質 之 氧 化 還 原 狀 態 的 指 標 ， 例 如 ： 可 用 氧 化 還 原 電 位 作 為 評 估 飼 養 池 底 土 狀 態(周 與 葉，2010；周 與 葉，2013)，底 土依 氧 化 還 原電 位 可 分 為氧 化 態(400 至 700mV) 、 低 還 原 態 (100 至 400mV)、還 原 態(100 至 -100mV)以及 高 還 原 態(-100 至 -300mV)。氧 化 還原 電 位 越 低， 代 表 本 身 愈 為 還 原 態 ， 愈 容 易 使 其 他 物 質 氧 化(失 去 電 子)；氧 化 還 原 電位 越 高，代 表 本 身 愈 為 氧 化 態 ， 愈 容 易 使 其 他 物 質 還 原 (獲 得電 子)。我 們猜 想，除 了測 量 環 境 物質 外 ， 生 物 的 組 織 或 器 官 之 間 是 否 也 具 有 氧 化 態-還 原 態 的 差異 ？ 例 如：進行 氣 體 交換 的 呼 吸 器 官，是 否 會 因 常 接 觸 溶 氧(高 還原 態，可 作 為 氧 化 劑)而 為 了 避免 氧 化 還 原反 應 發 生，故 維 持 在 高 還 原 態(氧 化 還 原 電位 較 低)的 狀 態。負 責 處 理 過 氧化 物 的 肝 臟， 常 製 造 作 為 還 原 劑 的 觸 酶(洪，2008)，因 而 含 有 高 濃 度 還 原 劑 物 質(高 氧化 態)， 是 否 *為本 文 通 訊 作 者 需 要 常 常 維 持 在 高 氧 化 態(氧 化 還 原 電 位 較 高)的 狀 態 ？ 觸 酶 廣 泛 存 在 於 各 類 生 物 細 胞 ， 負 責 處 理 細 胞 代 謝 過 程 所 產 生 的 過 氧 化 物 ， 並 將 過 氧 化 物 轉 換 為 毒 害 較 低 或 無 害 的 物 質 (趙，1997；肖 與陳，2007)。這 些細 胞 代謝 出 的 過 氧 化 物 可 產 生 自 由 基 ， 過 多 或 過 少 都 會 造 成 細 胞 傷 害 ， 而 適 量 的 自 由 基 卻 能 幫 助 我 們 清 除 細 菌 或 受 感 染 細 胞(長 庚 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 網 站 。 檢 索 日 期 ： 2017.05.23)。 氧 化 壓 力 是 氧 化 自 由 基 的 生 成 和 還 原 劑 防 禦 二 者 失 衡 的 結 果(郭 與 李， 2007；王等 人，2007)，許 多疾 病 都 是 因氧 化 壓 力 而 起(Kodrík, et al., 2015；郭 與 李， 2007；邱，2009；王 等人，2007)。不 只 是 疾 病 ， 甚 至 連 老 化 ， 都 與 氧 化 壓 力 大 有 關 聯 。 生 物 課 程 中 ， 我 們 也 曾 探 討 豬 肝 與 馬 鈴 薯 的 觸 酶 在 不 同 環 境 下 的 活 性(高 三 上 第 一 章 生 物 體 的基 本 構 造 與功 能)。 生 物 體 會 用 還 原 劑 來 降 低 氧 化 壓 力 ， 以 植 物 為 例，可 產 生 如 維 生 素C、茶 多酚、 花 青 素 、 葉 黃 素 等 來 減 少 自 由 基 的 傷 害 ， 這 些 還 原 劑 也 已 應 用 在 許 多 保 健 食 品 與 保養 品 上 。 人 體 觸 酶 活 性 最 高 之 器 官 為 肝 臟 (Deisseroth and Dounce, 1970)，因 為 肝臟 是 進 行 新 陳 代 謝 最 主 要 的 器 官 ， 常 代 謝 出 較 多 的 過 氧 化 物 ， 需 要 較 高 的 觸 酶 活 性 來 降 低 這 些 過 氧 化 物 所 產 生 的 氧 化 壓 力 。 我 們 假 設：負 責 處 理 過 氧 化 物 的 肝 臟， 常 製 造 出 還 原 劑 物 質(洪 ， 2008)而 含 有 高 濃 度 還 原 劑 物 質(高 氧 化 態 )， 它 是 否 需 要 常 常 維 持 在 高 氧 化 態(氧 化 還 原 電 位 較 高 ) 的 狀 態 ， 以 避 免 被 還 原 劑 物 質 還 原 ？ 另 一 方 面 ， 進 行 氣 體 交 換 的 呼 吸 器 官 ， 是 否 會 因 常 接 觸 溶 氧(高 還 原 態 ， 可 作 為 氧 化 劑 ) 而 為 了 避 免 氧 化 還 原 反 應 發 生 ， 故 將 自 身 維 持 在 高 還 原 態(氧 化 還 原 電 位 較 低 )的 狀 態 ？ 我 們 的 假 說 是 ： 生 物 體 的 器 官 會 避 免 與 環 境 物 質 發 生 氧 化 還 原 反 應 而 造 成 氧 化 傷 害 ， 故 其 氧 化 還 原 電 位 會 與 所 接 觸 的 環 境 物 質 相 近 。 本 研 究 擬 先 瞭 解 呼 吸 器 官 與 代 謝 器 官 的 氧 化 還 原 電 位 是 否 具 有 差 異 ， 並 透 過 氧 化 劑 與 還 原 劑 的 使 用 ， 改 變 實 驗 動 物 體 內 的 氧 化 還 原 狀 態 ， 探 討 體 內 環 境 的 氧 化 壓 力 對 生 物 體 呼 吸 器 官 與 肝 臟 之 觸 酶 活 性 的 效 應。本 研 究 以 文 蛤 與 蟑 螂 作 為 實 驗 動 物， 因 其 體 腔 較 大 ， 較 易 取 得 組 織 進 行 實 驗 。 蟑 螂 脂 肪 體 的 生 理 角 色 近 似 人 體 的 肝 臟 (蔡，2006)。若 於文 蛤 的 體 外環 境 或 與 蟑螂 體 腔 內 形 成 不 同 程 度 的 氧 化 或 還 原 壓 力 ， 透 過 觀 察 文 蛤 肝 胰 腺 、 蟑 螂 脂 肪 體 與 其 他 組 織 的 觸 酶 活 性 之 變 化 ， 藉 此 推 知 氧 化 劑 和 還 原 劑 對 觸 酶 活 性 的 效 應 。 也 可 透 過 測 量 其 觸 酶 活 性 的 生 理 誘 發 濃 度 或 生 理 抑 制 濃 度 ， 探 討 文 蛤 與 蟑 螂 面 對 氧 化 壓 力 變 化 時 ， 肝 胰 腺 與 脂 肪 體 之 觸 酶 所 扮 演 的 生 理 角 色 。 我 們 也 以 酒 精 作 為 探 討 的 因 子 之 一 。 組 織 細 胞 因 代 謝 過 程 產 生 過 氧 化 物 (Freeman and Crapo, 1982；李 等 人， 2008)， 當 過 氧 化 物 太 高 或 太 低 時 ， 會 造 成 氧 化 壓 力 ， 而 氧 化 壓 力 則 促 使 觸 酶 增 加 活 性 來 因 應 這 個 氧 化 狀 態 。 前 述 實 驗 設 計 針 對 的 因 子 為「 氧 化 壓 力 」或「 氧 化 還 原 狀 態 」，則 酒 精 則 可 透 過 影 響「 代 謝 」，也 就 是 比 氧 化 壓 力 更 為 源 頭 因 子(代 謝 過 程 可 產 生 氧 化 壓 力)，探 討 酒 精代 謝 對 觸 酶活 性 的 效 應。 基 於 上 述 的 研 究 動 機 ， 本 研 究 的 目 的 如 下 ： (一) 比 較 文 蛤 與 蟑 螂 之 呼 吸 器 官 與 肝 臟 (脂 肪體)的 氧 化還 原 電 位 。 (二) 、 發 展 適合 於 中 學 推廣 之 動 物 組織 觸 酶 活 性 的 量 化 方 法 。 (三) 以 文 蛤 作為 實 驗 動 物， 透 過 浸 泡氧 化 劑 或 還 原 劑 改 變 實 驗 動 物 體 外 的 氧 化 還 原 狀 態 ， 探 討 當 鰓 的 氧 化 還 原 狀 態 改 變 時 ， 對 呼 吸 器 官 與 肝 臟 觸 酶 活 性 的 效 應 。 (四) 以 蟑 螂 作為 實 驗 動 物， 透 過 注 射氧 化 劑 或 還 原 劑 改 變 實 驗 動 物 體 內 的 氧 化 還 原 狀 態 ， 探 討 當 脂 肪 體 的 氧 化 還 原 狀 態 改 變 時 ， 對 呼 吸 器 官 與 脂 肪 體 觸 酶 活 性 的 效 應 。
貳、研究方法
一、研究器材與設備(表一)
表 一 、 實 驗 裝 置 與 器 材 編 號 名 稱 廠 牌 與 規 格 備 註 1 60mL 針 筒 綠 十 字 2 1mL 微 量吸 量 管 TF Laboratory 3 橡 皮 軟 管 4 磁 鐵 5 雙 氧 水 Choneye Pure Chemicals 濃 度 為35% 6 100%維 生 素 C 粉 城 乙 化 工 原 料 公 司 L-Ascorbic Acid 7 棉 花 棒 8 蓋 玻 片 盒 空 的 9 皮 下 注 射 針 TERUMO 1ml 10 蟑 螂 生 理 食 鹽 水 0.8%(精 鹽 調 製) 11 碼 錶 12 解 剖 器 材 ViBRA 解 剖 刀(小 剪 )、 鎳子 13 電 子 秤 可 測 量 至 0.001 公 克 14 鐵 針 15 藍 色 水 溶 性 墨 水 16 蟑 螂 屋 貼 紙 與 膠 帶 上 黏 蟑 螂 屋 17 二 氧 化 碳 鋼 瓶 18 文 蛤 養 殖 水 15ppt(精 鹽 調 製) 19 分 光 光 度 計 SP830 Simpo-Metertech 20 研 缽 21 離 心 機二、實驗動物
1. 文 蛤(Meretrix lusoria) 於 實 驗 操 作 的 前 一 天 購 買 同 一 品 種 之 文 蛤 ， 皆 為 來 自 雲 林 台 西 的 養 殖 文 蛤 ， 選 用 大 小 相 似 的 活 個 體。浸 泡 於 實 驗 溶 劑 內， 冷 藏 在 約 攝 氏4~8 度 的 冰 箱中 保 存，隔 日 進 行 實 驗 。 2. 美 洲蟑 螂(Periplaneta americana) 飼 養 方 式 與 實 驗 動 物 篩 選 參 考 自 高 與 蔡(2014)。在 實 驗操 作 前 一 天，以 二 氧 化碳 使 其 暫 時 麻 痺，以 利 注 入 藥 劑。將0.02 毫 升 之 溶 液 透 過 蟑 螂 第 五 和 第 六 片 背 板 骨 片 之 縫 隙 薄 膜 注 入 體 腔 中 ， 並 放 置 在 空 氣 流 通 且 空 間 足 夠 的 飼 養 箱 內 放 置 一 天 ， 使 其 可 以 自 由 活 動 。 實 驗 當 日 再 將 其 黏 貼 固 定 於 蟑 螂 屋 貼 紙 上 ， 進 行 實 驗 。三 、 比 較 生 物 組 織 的 氧 化 還 原 電 位
之方法
二 氯 酚 靛 酚 (2,6-dichlorophenol Indophenol, DCPIP) 為 一 種 氧 化 還 原 指 示 劑 ， 當 其 與 待 測 物 共 存 時 ， 其 顏 色 變 化 的 反 應 如 下(圖 一)，可 由 DCPIP 的 顏色 變 化， 推 知 待 測 物 質 的 氧 化 還 原 趨 勢。換 句 話 說， 當 DCPIP 顏 色 變淡 時，代 表待 測 物 具 容易 失 去 電 子(高 氧 化 態 ， 而 可 作 為 還 原 劑 )的 性 質；若 DCPIP 顏 色變 深 時，代 表 待 測物 具 容 易 接 受 電 子(高 還 原 態，而可 作 為 氧化 劑)的性 質 。 我 們 先 測 量 不 同 光 波 長 下 ， 未 發 生 反 應 之 0.00125%DCPIP 溶 液 的透 光 率，發 現 DCPIP 最 大 吸 收高 峰 約 為 600 nm(圖 二)， 故 測 量DCPIP 溶 液 的 透 光 率時，則 選 取光 波 長 600 nm 作 為 光 源 ， 測量 其 透 光 率。 本 實 驗 先 將 擬 測 量 的 組 織 秤 重 之 後 ， 用 研 缽 磨 碎 再 倒 入 150 毫 升、0.00125%的 DCPIP 中，以 玻棒 攪 拌 後 靜置，並 於 5 分 鐘 與 60 分 鐘 分 別吸 取 1 毫 升之 實 驗 溶 液， 進 行 離 心 使 溶 液 中 的 懸 浮 固 體 不 影 響 透 光 率 的 測 量(3000 轉 /分鐘，進 行 5 分 鐘)，再 取 出 各 實 驗 溶 液 ， 利 用 分 光 光 度 計 測 量 其 於 光 波 長 為 600 nm 光 源 下的 透 光 率 ，以 推 測 各 組 織 的 氧 化 還 原 情 形 。 我 們 發 現 此 實 驗 在 組 織 與 DCPIP 反 應 5 分 鐘 或 60 分 鐘 後 ， 兩 時 間 所 測 得 之 透 光 率 一 致 。 以 下 本 實 驗 的 結 果 是 以 兩 段 時 間 的 數 據 經 平 均 、 統 計 而 成 。 圖 一 、DCPIP 作 為 氧 化 還 原 指 示 劑之 相 關 反 應示 意 圖 還 原 態 待 測 物→ 氧化 →氧 化 態待 測 物+ 2e- + 2H+ DCPIP(藍 色 ) + 2e- + 2H+ →還原 → DCPIPH2(無 色) DCPIPH2(無 色) → 氧化 → DCPIP(藍 色) + 2e- + 2H+ 氧 化 態 待 測 物 + 2e- + 2H+ → 還 原 → 還 原態 待 測 物本 實 驗 所 測 量 的 組 織 來 自 文 蛤 與 蟑 螂 兩 種 實 驗 動 物。文 蛤 的 組 織 包 含 鰓、斧 足、 肝(收 集 自 20 隻 個 體 )， 各 組 織 重 量 皆 於 2.14 至 2.19 克 之間。蟑 螂 的組 織 包 含 胸部 大 氣 管、步 足 肌 肉 與 脂 肪 體(收 集 自 8 隻 個 體)，各 組 織 重 量皆 為 0.14 克 。
四 、 不 同 濃 度 之 氧 化 劑 與 還 原 劑 的
配製
本 研 究 以 過 氧 化 氫 溶 液 與 維 生 素C 溶 液 分 別 作 為 氧 化 劑 與 還 原 劑 。 在 探 討 體 外 給 予 氧 化 壓 力(以 文 蛤 作 為 實 驗 動 物)的 實驗 中，文 蛤養 殖 最 適 宜的 海 水 濃 度 是 10~45 psu (practical salinity unit，即 千 分 之 一) (農 委 會 水產 試 驗 所 全球 期:2017.02.14)。我 們 將 對 照組 以 15 psu 食 鹽 水 做 為 浸 泡 液 ； 氧 化 劑 處 理 組 則 是 以 對 照 組 浸 泡 液 配 製 不 同 濃 度 的 過 氧 化 氫 浸 泡 液，分 別 有：0.5%、0.05%、0.005%過 氧化 氫 溶 液 ； 還 原 劑 處 理 組 則 以 同 樣 方 法 配 製 不 同 濃 度 的 維 生 素C 溶 液，分 別 有：2.58%、 0.258%、0.0258%維 生 素 C 溶 液 。 此 實驗 將 文 蛤 浸 泡 於 不 同 的 浸 泡 液 中 ， 以 控 制 體 外 環 境 的 氧 化 還 原 狀 態 。 在 探 討 體 內 環 境 氧 化 壓 力 的 效 應(以 蟑 螂 作 為 實 驗 動 物)實 驗 中，對照 組 為 注射 蟑 螂 0.8 % 生 理 食 鹽 水 (Cohen, et al., 2002)0.02 毫 升；氧 化劑 處 理組 則 是 以 生理 食 鹽 水 配 製 不 同 濃 度 的 過 氧 化 氫 溶 液 ， 分 別 有：0.5%、0.05%、0.005%過 氧 化氫 溶 液； 還 原 劑 處 理 組 則 以 生 理 食 鹽 水 配 製 不 同 濃 度 的 維 生 素 C 溶 液 ， 分 別 有 ： 2.58% 、 0.258%、0.0258%維 生素 C 溶 液。其 中 0.5% 圖 二 、 不 同 光 波 長 下 ，DCPIP 溶 液 的 透 光 率 0 10 20 30 40 50 400 500 600 700 800 900 光波長(nm) 透光率 (% )過 氧 化 氫 溶 液 的 體 積 莫 耳 濃 度 約 等 於 2.58%維 生 素 C 溶 液(0.0284 M)，其 他 濃度 以 此 類 推 。
五、攝入酒精之方法
1. 文 蛤攝 入 酒 精 之方 法 在 實 驗 前 一 天 將 文 蛤 浸 泡 在 3 %的 酒 精 溶 液 中 ， 探 討 攝 入 酒 精 對 其 各 組 織 生 理 作 用 的 影 響 。 另 外 ， 我 們 以 浸 泡 在 生 理 食 鹽 水 作 為 對 照 組 。 2. 蟑 螂攝 入 酒 精 之方 法 本 研 究 將 蟑 螂 置 入 密 閉 容 器 中 ， 內 置 沾 附95 %的 酒 精，酒 精 揮 發後 可 藉 由 蟑螂 呼 吸 運 動 攝 入 酒 精 。 以 攝 入 酒 精 的 時 間 長 短 作 為 劑 量 控 制 的 方 法 ， 並 依 此 將 其 分 別 稱 為「 攝 入 酒 精 十 分 鐘 組 」、「 攝 入 酒 精20 分 鐘 組 」及「 攝 入 酒 精30 分鐘 組 」。另 以 未 經 處 理 蟲 體 作 為 對 照 組 。六、建立量化觸酶活性之方法
1. 量 化文 蛤 鰓 和 肝臟 觸 酶 活 性之 方 法 先 將 文 蛤 浸 泡 在 不 同 濃 度 的 實 驗 藥 劑 (對 照組、氧 化 劑或 還 原 劑)，以 造 成 文 蛤的 體 外 環 境 具 不 同 的 氧 化 壓 力。放 置 一 天 後， 進 行 文 蛤 解 剖 ： 將 剪 刀 伸 入 文 蛤 的 兩 側 ， 剪 開 閉 殼 肌 使 兩 殼 易 張 開 ， 用 鑷 子 分 別 取 出 適 量 右 半 側 的 兩 片 鰓 與 肝 臟 ， 沾 抹 在 裝 有 鐵 針 的 棉 花 棒 上 ， 以 電 子 秤 測 量 此 組 織 之 淨 重 。 用 滴 管 吸 取 1 毫 升的 35 %過氧 化 氫 溶 液 至 針 筒 內 ， 將 棉 花 棒 緩 慢 沿 著 針 筒 上 壁 放 入 ， 並 以 磁 鐵 在 針 筒 外 吸 引 此 棉 花 棒 ， 避 免 棉 花 棒 接 觸 到 雙 氧 水 。 將 活 塞 放 回 ， 在 針 筒 前 端 接 上 微 量 吸 量 管 ， 內 含 稀 釋 墨 水(圖 三 )。 在 確 保 針 筒 為 密 閉 空 間 後 ， 將 磁 鐵 拿 開 ， 棉 花 棒 會 瞬 間 落 下 而 接 觸 過 氧 化 氫 溶 液 產 生 反 應。此 時 開 始 計 時， 每 5 秒 觀察 一 次微 量 吸 量 管中 墨 水 移 動之 刻 度 變 化 。 以 此 記 錄 所 產 生 的 氣 體 體 積 變 化(單 位 為 毫 升 )， 再 計 算 成 每 公 克 組 織 的 氣 體 產 生 速 率(單位 為 毫 升 /克 .秒)，作 為觸 酶 活 性 的 指 標 。 2. 量 化蟑 螂 脂 肪 體觸 酶 活 性 之方 法 美 洲 蟑 螂 的 腹 部 背 板 骨 片 共 有 8 片 。 本 研 究 利 用 皮 下 注 射 針 ， 於 腹 部 背 側 第 5 片 與 第 6 片 骨 板 之 間 的 薄 膜 ， 注 射 不 同 濃 度 的 實 驗 藥 劑(對 照 組 、 氧 化 劑 或 還 原 劑)。每 組 皆 注射 0.02 毫 升實 驗 藥 劑 進入 體 腔 內 ， 以 控 制 蟑 螂 體 內 環 境 的 氧 化 壓 力 狀 態 。 已 施 打 實 驗 藥 劑 之 實 驗 動 物 ， 放 在 可 自 由 活 動 的 飼 養 箱 內 ， 待 注 入 藥 劑 在 美 洲 蟑 螂 體 內 循 環 並 充 分 反 應 。 放 置 一 天 後 ， 利 用 二 氧 化 碳 麻 醉 ， 再 將 蟑 螂 腹 面 朝 下 貼 到 蟑 螂 屋 貼 紙 上 固 定。從 背 部 第 5、6 片 骨 板 間 剪 開 右 側 之 骨 板 ， 以 鑷 子 取 出 適 量 脂 肪 體 ， 沾 抹 在 裝 有 鐵 針 的 棉 花 棒 上 。 其 餘 測 量 觸 酶 活 性 的 步 驟 如 同 文 蛤 組 的 操 作 。圖 三 、 組 織 樣 本 之 觸 酶 活 性 測 量 的 實 驗 裝 置 示 意 圖 (上 )與 照 片 (下 )。 3. 比 較美 洲 蟑 螂 和文 蛤 的 觸 酶活 性 反 應 利 用 過 氧 化 氫 溶 液 作 為 氧 化 劑 造 成 氧 化 壓 力 ， 不 同 濃 度 的 過 氧 化 氫 溶 液 代 表 不 同 程 度 的 氧 化 壓 力，而 維 生 素 C 溶 液 則作 為 還 原 劑 。 我 們 將 過 氧 化 氫 溶 液 的 體 積 莫 耳 濃 度 和 維 生 素C 溶液 的 體積 莫 耳 濃 度調 配 成 相 同 的(例 如 ： 0.5 %雙 氧 水 的 莫 耳 濃 度=2.58 %維 生 素 C 溶 液 的莫 耳 濃 度)，方 便 比 較 其 效 應 。
參、研究結果
一、各器官氧化還原電位比較
文 蛤 的 各 組 織 中 ， 浸 泡 過 鰓 組 織 的 DCPIP 溶 液，其 透 光率 較 對照 組 低，代 表 鰓 組 織 具 高 還 原 態(氧 化 還 原 電 位 較 低 )。 也 就 是 說 ， 鰓 組 織 較 容 易 獲 得 電 子 ， 使 DCPIP 被 氧 化(圖 四 )； 而 肝 與 斧 足 肌 肉 組 織 透 光 率 較 對 照 組 高 ， 代 表 肝 與 斧 足 肌 肉 組 織 具 高 氧 化 態(氧 化 還 原 電 位 較 高 )。 也 就 是 說 ， 肝 與 斧 足 肌 肉 組 織 較 容 易 獲 得 電 子 ， 使DCPIP 被 還 原(圖 四)。 蟑 螂 的 各 組 織 中 ， 浸 泡 過 步 足 肌 肉 組 織 的 DCPIP 溶 液，其 透 光 率較 對 照 組 低， 代 表 步 足 肌 肉 組 織 具 高 還 原 態(氧 化 還 原 電 位 較 低)。也 就是 說，步 足肌 肉 組 織 較容 易 獲 得 電 子 ， 使 DCPIP 被 氧化(圖 五 )； 而 大 氣 管 與 脂 肪 體 組 織 透 光 率 較 對 照 組 高 ， 代 表 大 氣 管 與 脂 肪 體 組 織 具 高 氧 化 態(氧 化 還 原 電 位 較 高)。也 就 是 說，大 氣 管 與脂 肪 體 組 織 較 容 易 獲 得 電 子，使DCPIP 被 還 原 。圖 四 、 文 蛤 各 組 織 浸 泡 於 DCPIP 溶 液 ， 對 DCPIP 溶 液 透 光 率 的 效 應 (n = 8)。 a、 b、 c、 d： 代 表 之 間具 統 計 顯 著差 異 (單 尾 t 檢 定 ， α = 0.05)。 圖 五 、 蟑 螂 各 組 織 浸 泡 於 DCPIP 溶 液 ， 對 DCPIP 溶 液 透 光 率 的 效 應 (n = 6)。 a、 b、 c、 d： 代 表 之 間具 統 計 顯 著差 異 (單 尾 t 檢 定 ， α = 0.05)。
二 、 探 討 體 外 暴 露 氧 化 壓 力 對 文 蛤
觸酶活性的效應
文 蛤 浸 泡 在 氧 化 劑 一 日 後 ， 在 濃 度 為 0.5%時，鰓 組 織的 觸 酶 活 性明 顯 較 對 照組 增 加(圖 六 )， 但 較 低 濃 度 的 氧 化 劑 浸 泡 處 理 則 沒 有 明 顯 影 響 ； 肝 臟 組 織 的 觸 酶 活 性 在 高 濃 度 氧 化 劑 浸 泡 液(0.5%)時 增 加 。 但 若 以 低 濃 度 氧 化 劑 浸 泡(0.005%)處 理 時， 則 被 抑 制(圖 七)。 文 蛤 浸 泡 在 還 原 劑 一 日 後 ， 於 濃 度 為 0.026 %和 0.26 %時 ， 鰓 組織 的 觸 酶 活性 皆 增 加(圖 八 )， 其 中 以 0.026 %組 較 為 明 顯；肝 臟 組 織 的 觸 酶 活 性 則 在 濃 度 0.26 % 還 原 劑 浸 泡 處 理 後 下 降(圖 九)。 15 20 25 30 35 40 對照組 鰓 肝 斧足 透光 率( % ) a c d b 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 對照組 步足肌肉 大氣管 脂肪體 透光率( % ) a c d b圖 六 、 文 蛤 接 觸 不 同 濃 度 氧 化 劑 1 日 後 ， 鰓 組織 的 觸 酶 反應 速 率 比 較 (平 均 ±標 準誤 ， 各 組 取 樣 數 皆 為20)。 與 對 照 組 (0%)相 比 (單 尾 t 檢 定 )： ˙： p <0.06； *： p < 0.05。 圖 七 、 文 蛤 接 觸 不 同 濃 度 氧 化 劑 1 日 後 ， 肝 臟組 織 的 觸 酶反 應 速 率 比較 (平 均 ±標準 誤 ， 各 組 取 樣 數 皆 為 20)。 與 對 照 組(0%)相 比 (單 尾 t 檢 定 )： ˙： p <0.06； *： p < 0.05。 我 們 發 現 增 加 體 外 環 境 的 氧 化 壓 力 ， 可 增 加 文 蛤 鰓 的 觸 酶 活 性 ， 但 若 體 外 出 現 微 弱 的 氧 化 壓 力 ， 則 肝 臟 的 觸 酶 活 性 反 而 下 降 。 若 降 低 體 外 環 境 的 氧 化 壓 力 則 可 使 鰓 與 肝 臟 的 觸 酶 活 性 下 降 ， 但 若 體 外 氧 化 壓 力 只 是 輕 微 下 降 時 ， 鰓 的 觸 酶 活 性 反 而 增 加 。 文 蛤 暴 露 於 3%酒 精 中 一 日 後 ， 鰓 和 肝 組 織 的 觸 酶 活 性 明 顯 增 加 ， 和 對 照 組 達 統 計 上 差 異(圖 十、 圖 十 一)。 體 外 暴 露 氧 化 壓 力 對 文 蛤 觸 酶 活 性 的 影 響 之 實 驗 結 果 ， 統 整 成 表 二 。 鰓(雙氧水處理) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0% 0.005% 0.05% 0.5% 反應速率( 毫升/ 秒‧克) 5秒內速率 10秒內速率 20秒內速率
*
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˙
肝(雙氧水處理) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 0% 0.005% 0.05% 0.5% 反應速 率( 毫 升 /秒 ‧克) 5秒內速率 10秒內速率 20秒內速率*
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圖 八 、 文 蛤 接 觸 不 同 濃 度 還 原 劑 1 日 後 ， 鰓 組織 的 觸 酶 反應 速 率 比 較 (平 均 ±標 準誤 ， 各 組 取 樣 數 皆 為20)。 與 對 照 組(0%)相 比 (單 尾 t 檢 定 )： ˙： p <0.06； *： p < 0.05。 圖 九 、 文 蛤 接 觸 不 同 濃 度 還 原 劑 1 日 後 ， 各 濃度 肝 臟 組 織的 觸 酶 反 應速 率 比 較 (平 均 ±標 準誤 ， 各 組 取樣 數 皆 為 20)。 與 對 照 組(0%)相 比 (單 尾 t 檢 定 )： *： p < 0.05。 圖 十 、 文 蛤 暴 露 於 3%酒 精 1 日 後 ， 鰓 組 織 觸酶 反 應 速 率比 較 (平 均 ±標 準 誤 ) (平 均 ±標 準誤 ， 各 組 取樣 數 皆 為 20)。 與 對 照 組相 比 (單 尾 t 檢 定 )： *： p < 0.05。 鰓(維生素C處理) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0% 0.026% 0.26% 2.6% 反 應速率 (毫升/ 秒‧克 ) 5秒內速率 10秒內速率 20秒內速率
˙
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肝(維生素C處理) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 0% 0.026% 0.26% 2.6% 反應速率 (毫 升 /秒 ‧克) 5秒內速率 10秒內速率 20秒內速率*
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鰓 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 5秒內 10秒內 20秒內 氣體 產生速 率( 毫 升 /公 克. 秒 ) 對照組 3%酒精一天*
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*
圖 十 一 、 文 蛤 暴 露 於3%酒 精 1 日 後 ， 肝 組 織觸 酶 反 應 速率 比 較 (平 均±標 準 誤 ) (平 均 ±標 準誤 ， 各 組 取樣 數 皆 為 20)。 與 對 照 組相 比 (單 尾 t 檢 定 )： *： p < 0.05。 表 二 、 體 外 浸 泡 氧 化 劑 、 還 原 劑 與 酒 精 ， 對 文 蛤 鰓 與 肝 臟 觸 酶 活 性 的 效 應 。 溶 液 器 官 浸 泡 氧 化 劑 浸 泡 還 原 劑 浸 泡 酒 精 0.005% 0.05% 0.5% 0.0258% 0.258% 2.58% 鰓(文 蛤 ) － － 促 進 促 進 促 進 － 促 進 肝 臟(文 蛤 ) 抑 制 抑 制 促 進 － 抑 制 － 促 進
三 、 探 討 蟑 螂 體 內 氧 化 壓 力 對 觸 酶
活性的效應
美 洲 蟑 螂 體 內 暴 露 氧 化 劑 一 日 後 ， 在 濃 度0.05 %時，脂 肪體 和 步足 肌 肉 的 觸酶 活 性 皆 被 觸 發 而 反 應 速 率 增 快(圖 十 二 )； 預 先 接 觸 還 原 劑 一 日 後 ， 在 各 個 濃 度 都 能 見 到 脂 肪 體 的 觸 酶 活 性 被 抑 制 而 反 應 速 率 減 慢 ， 其 中 以 濃 度 0.026 %最 為明 顯(圖十 三)。 增 加 體 內 氧 化 壓 力 可 增 加 美 洲 蟑 螂 的 脂 肪 體 與 步 足 肌 肉 觸 酶 活 性(圖 十 四 )， 而 減 少 體 內 氧 化 壓 力 可 降 低 美 洲 蟑 螂 的 脂 肪 體 觸 酶 活 性 。 美 洲 蟑 螂 在 酒 精 中 暴 露 20 分 鐘 並 放 置 5 分 鐘後 ， 觸酶 活 性 明 顯受 到 觸 發 ，而 在 酒 精 中 暴 露20 分 鐘 並 放 置一 日 後，觸 酶 活 性 被 觸 發 的 效 果 更 為 顯 著(圖 十 五 )。 美 洲 蟑 螂 脂 肪 體 的 觸 酶 活 性 在 氧 化 壓 力 下 之 變 化 ， 統 整 為 下 表(表三)。 肝 0 1 2 3 4 5 6 7 8 5秒內 10秒內 20秒內 氣體 產生 速率(毫 升 /公 克 .秒) 對照組 3%酒精一天*
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圖 十 二 、 蟑 螂 注 射 不 同 濃 度 氧 化 劑(0.02 毫 升 )1 日 後 ， 各 組脂 肪 體 的 觸酶 反 應 速 率比 較 (平 均 ±標 準誤，n = 取 樣 數 )。與 對 照 組 (0%組 )相 比 (單 尾 t 檢 定 )：*：p < 0.05。 圖 十 三、蟑 螂 注 射 不 同 濃 度 還 原 劑(0.02 毫 升 )1 日 後，各 濃度 脂 肪 體 的觸 酶 反 應 速率 比 較 (平 均 ±標 準誤，n = 取 樣 數 )。與 對 照 組 (0%組 )相 比 (單 尾 t 檢 定 )：*：p < 0.05。 圖 十 四 、 蟑 螂 注 射 不 同 濃 度 氧 化 劑(0.02 毫 升 )1 日 後 ， 對 步足 肌 肉 觸 酶活 性 的 效 應。 (平 均 ±標 準誤 ， n = 取 樣 數 )。 與 對照 組 相 比 (單尾 t 檢 定 )： *： p < 0.05。 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 0.005 0.05 0.5 5 預先注射雙氧水濃度(%) 觸酶活性( 毫升/ 秒‧克) 5秒內速率 10秒內速率 20秒內速率
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n = 21 28 26 22 23 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0% 0.026% 0.26% 2.6% 預先注射維生素C濃度(%) 反應 速率 (毫 升 /公克 .秒 ) 5秒內速率 10秒內速率 20秒內速率*
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n = 21 20 20 20 5秒內速率 0 1 2 3 4 5對照組 0.005%H2O2 0.05%H2O2 0.5%H2O2
觸酶 活 性 (毫升/ 秒 ‧ 克 )
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n = 24 12 12 12圖 十 五 、 蟑 螂 醺 95%酒 精 20 分 鐘 後 靜 置 5 分 鐘 後 ， 對 蟑螂 脂 體 觸 酶活 性 的 效 應 (平 均 ±標 準誤 ， n = 取 樣 數 )。 與 對照 組 相 比 (單尾 t 檢 定 )： *： p < 0.05。 與 「 暴 露 酒 精 後 5 分 鐘 」 組 相 比 (單尾 t 檢 定 )： ★ ： p < 0.05。 表 三 、 體 內 注 射 氧 化 劑 與 還 原 劑 ， 對 蟑 螂 脂 肪 體 觸 酶 活 性 的 效 應 。 溶 液 器 官 注 射 氧 化 劑 注 射 還 原 劑 攝 入 酒 精 0.005% 0.05% 0.5% 0.0258% 0.258% 2.58% 脂 肪 體 觸 酶 活 性 － 促 進 － 抑 制 抑 制 抑 制 促 進
肆、討論
本 研 究 建 立 了 一 個 比 較 生 物 組 織 間 氧 化 還 原 電 位 的 方 法 ， 並 發 現 文 蛤 進 行 氣 體 交 換 的 鰓 ， 其 氧 化 還 原 電 位 較 低(高 還 原 態)，肝 與斧 足 肌肉 組 織 的 氧化 還 原 電 位則 較 高(高 氧 化 態 )。 蟑 螂 步 足 肌 肉 組 織 的 氧 化 還 原 電 位 較 低(高 還 原 態 )， 而 大 氣 管 與 脂 肪 體 組 織 的 氧 化 還 原 電 位 較 高(高 氧 化 態)。我 們認 為 蟑螂 真 正 進 行氣 體 交 換 的組 織 為 氣 管 系 統 最 末 端 的 微 氣 管(tracheole)。 我 們 知 道 ， 步 足 肌 肉 組 織 內 富 含 氣 管 與 微 氣 管(圖 十 六 )，因 此 蟑 螂 各 組織 中，步 足組 織 的 氧 化 還 原 電 位 最 低 。 綜 合 上 述 結 果 ， 我 們 推 論 ： 負 責 氣 體 交 換 的 呼 吸 器 官 ， 例 如 ： 文 蛤 的 鰓 與 蟑 螂 的 微 氣 管 ， 因 常 接 觸 溶 氧(高 還 原 態 )而 為 了 避 免 氧 化 還 原 反 應 發 生，故 這 些 呼 吸 器 官 維 持 高 還 原 態(氧化 還 原 電 位 較 低)狀態；負 責 處理 過 氧 化 物的 肝 臟，例 如：文 蛤 的 肝 臟 與 蟑 螂 的 脂 肪 體， 常 製 造 還 原 劑 物 質 而 含 有 高 濃 度 還 原 劑 物 質，故 維 持 高 氧 化 態(氧 化 還原 電 位 較 高)。 可 見 ， 昆 蟲 脂 肪 體 的 生 理 功 能 ， 就 如 同 人 體 的 肝 臟 與 文 蛤 的 肝 臟(又 稱為 肝 胰 腺)。 0 5 10 15 20 25 5秒內速率 10秒內速率 20秒內速率 觸酶活性( 毫升/ 秒‧克) 對照組(n=18) 暴露酒精後5分鐘(n=20) 暴露酒精後1日(n=19)*
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★ ★ ★圖 十 六 、 蟑 螂 步 足 肌 肉 組 織 內 的 氣 管 與 微 氣 管 照 片 ， 左 圖 為 100 倍 倍 率 ， 右 圖 為 400 倍 倍 率 。 箭 頭 所 指 的 構 造 即 為 微 氣 管 。 本 研 究 建 立 了 量 化 生 物 組 織 中 觸 酶 活 性 的 方 法 ， 可 用 於 探 討 各 項 因 子 對 觸 酶 活 性 的 影 響 。 也 證 實 了 藉 由 氧 化 劑 和 還 原 劑 改 變 美 洲 蟑 螂 體 內 的 氧 化 壓 力 ， 可 調 節 其 脂 肪 體 的 觸 酶 活 性 。 其 中 因 氧 化 劑 所 產 生 的 氧 化 壓 力 ， 可 增 加 脂 肪 體 的 觸 媒 活 性 ； 還 原 劑 降 低 氧 化 壓 力 ， 可 減 少 脂 肪 體 觸 媒 活 性 。 高 濃 度 的 氧 化 劑 處 理 ， 蟑 螂 的 觸 酶 活 性 反 而 與 對 照 組 一 致 ， 可 能 是 因 為 高 濃 度 雙 氧 水 已 造 成 了 脂 肪 體 細 胞 的 傷 害 ， 使 得 觸 酶 活 性 下 降 。 另 一 方 面，文 蛤 的 實 驗 結 果 較 為 複 雜， 並 非 像 蟑 螂 脂 肪 體 的 實 驗 結 果 單 純(接 觸 氧 化 劑 可 促 進 觸 酶 活 性 ， 而 接 觸 還 原 劑 則 為 抑 制)，尤 其 是鰓 組 織。文 蛤的 相 關 實驗 結 果 與 我 們 的 推 論 如 下(表 四 )： 由 於 文 蛤 的 實 驗 是 經 由 改 變 體 外 環 境 的 氧 化 還 原 狀 態 ， 又 由 前 項 比 較 氧 化 還 原 電 位 的 實 驗 中 得 知 ， 鰓 的 氧 化 還 原 電 位 較 低 。 若 氧 化 還 原 電 位 比 原 本 的 狀 態 更 低 或 過 高 ， 則 必 須 要 回 復 到 正 常 的 氧 化 還 原 電 位 的 恆 定 範 圍 ， 因 此 在 低 濃 度 的 還 原 劑(0.026%)浸 泡 之 下 ， 可 促 使 鰓 組 織 產 生 過 氧 化 物 以 維 持 恆 定(表 四 中 狀 態 編 號 C)。 但 為 保 護 部 分 胞 器 或 局 部 組 織 免 於 氧 化 傷 害 ， 而 提 升 觸 酶 活 性 。 反 之 ， 因 為 鰓 的 氧 化 還 原 電 位 本 來 就 比 較 低 ， 所 以 低 濃 度 的 氧 化 劑 所 產 生 的 氧 化 壓 力 不 足 以 對 鰓 構 成 威 脅 ， 故 鰓 的 觸 酶 活 性 不 變(表 四 中 狀 態 編 號 B)， 所 以 在 低 濃 度 氧 化 劑 處 理 後 ， 對 鰓 的 觸 酶 活 性 不 具 效 應 。 但 在 高 濃 度 過 氧 化 氫 溶 液 (0.5%) 卻 明 顯 增 加 了 鰓 的 觸 酶 活 性 ( 表 四 中 狀 態 編 號 A)，可 能 是 因 為氧 化 狀 態 已達 造 成 氧 化 壓 力 的 狀 態 。 也 就 是 說 ， 可 能 引 發 細 胞 傷 害 的 程 度 ， 故 需 增 加 觸 酶 活 性 以 避 免 氧 化 傷 害 。
在 文 蛤 肝 臟 的 實 驗 結 果 中 ， 以 低 濃 度 氧 化 劑 處 理 時 ， 肝 臟 觸 酶 活 性 下 降 。 我 們 推 測 原 因 是：在 文 蛤 體 表 接 觸 到 氧 化 劑 時， 為 了 協 助 體 表 組 織(如 表 皮 、 消 化 道 等 )應 付 氧 化 壓 力，肝 的 觸 酶 轉 移 到 體 表 組 織(例 如 鰓)(表 四 中 狀態 編 號 B)，故 此 時 肝 臟的 觸 酶 活 性 下 降；而 在 接 觸 高 濃 度 氧 化 劑 時， 由 於 氧 化 壓 力 過 高 ， 觸 酶 除 了 由 肝 臟 轉 移 到 其 他 器 官 ， 肝 臟 本 身 也 需 產 生 或 誘 發 更 多 的 觸 酶(表 四 中 狀 態 編 號 A)， 以 降 低 高 氧 化 壓 力 ， 故 此 時 肝 臟 的 觸 酶 活 性 恢 復 成 與 對 照 組 一 致 。 由 表 四 中 也 可 比 較 發 現 ， 呼 吸 器 官 的 氧 化 還 原 電 位 之 生 理 恆 定 範 圍 確 實 較 肝 臟 低 。 換 句 話 說 ， 呼 吸 器 官 的 氧 化 還 原 電 位 較 肝 臟 低 ， 故 其 氧 化 還 原 電 位 之 生 理 恆 定 範 圍 也 較 低 ， 因 而 抑 制 與 誘 發 觸 酶 活 性 的 閾 值 亦 較 低 。 近 年 來 ， 生 態 環 境 污 染 成 為 全 球 十 分 關 心 的 議 題 ， 本 實 驗 對 文 蛤 應 付 氧 化 壓 力 之 酵 素 活 性 的 量 化 方 法 ， 可 以 應 用 在 環 境 汙 染 監 測 體 系 中 。 例 如 ： 已 有 學 者 利 用 偵 測 文 蛤 肝 胰 腺 的 觸 酶 ， 作 為 環 境 水 質 中 氧 化 壓 力 或 特 定 污 染 物 的 生 物 指 標(王 等 人， 2007)。 攝 入 酒 精 處 理 的 實 驗 結 果 符 合 預 期 ： 暴 露 在 酒 精 中 ， 酒 精 會 造 成 生 物 體 的 氧 化 性 傷 害(曾，2009)，而 組織 細 胞為 了 代 謝 酒 精 ， 增 加 了 觸 酶 活 性 。 表 四 、 不 同 程 度 之 體 外 氧 化 還 原 暴 露 對 文 蛤 的 鰓 與 肝 臟 觸 酶 活 性 的 效 應 。 註 ： 標 註黃 色 底 色 範圍 為 該 器 官的 氧 化 還 原電 位 之 生 理恆 定 範 圍 。 器 官 氧 化 劑 處 理 還 原 劑 處 理 高 劑 量 中 劑 量 低 劑 量 低 劑 量 中 劑 量 高 劑 量 (氧 化 逆 境 )氧 化 還 原 電 位 低 氧 化 還 原 電 位 高 (還 原 逆 境 ) 對 照 組 組 織 病 變 或 壞 死 (失 去 調 解 能 力) 狀 態 編 號 A B C D E 實 驗 結 果 鰓 ↑ － － ↑ ↑ － 肝 ↑ ↓ ↓ － ↓ － 過氧化物 觸酶 肝 鰓 肝 鰓 體外的氧化壓力 肝 鰓 體外的氧化壓力 肝 鰓 體外的氧化壓力 肝 鰓 體外的氧化壓力 肝 鰓 體外的氧化壓力 肝 鰓 體外的氧化壓力 肝 鰓 體外的氧化壓力 肝 鰓 體外的氧化壓力
參考文獻
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