亮不亮？有關係！---螢火蟲的冷光基因在轉殖
植物上的應用
The usage of luciferase gene from firefly for
transformed plants
農藝系助理教授常玉強 *筆者找不到 luciferase gene 正確的中文翻譯，暫時譯為冷光基因； Luciferin 譯為冷光素。 為什麼要用螢火蟲的冷光? 來自螢火蟲的 luc 基因是用來研究植物基因表現的新工具。luc 基因 的產物為 LUC 酵素（luciferase），該酵素可分解冷光素（luciferin）， 進而發光。LUC 酵素進行反應時需要 ATP，分解冷光素時產生波長 560nm 的黃藍光。螢火蟲之 luc 基因的編碼 DNA 序列（cDNA）已於 1985 年被 de Wet 等人選殖出，並可在細菌、植物及動物細胞中表現 而發光。 上述 luc 基因的 cDNA，若單獨轉殖入細胞是不會表現的；只有當結 合在一個啟動子（promoter）之後才有可能發光。因此， luc 基因可 作為研究啟動子的工具--即作為「報導基因」：報導啟動子的表現量、 表現時間及表現的組織特異性（圖一）。「報導基因」有許多種，最 常用的包括: gus 基因（表現藍色）；gfp 基因（表現螢光）；luc 基因 （表現冷光）。gus 報導基因的優點為可精確顯示啟動子在單一細胞 的表現，並可以測定啟動子的表現量；缺點是測定時必須將植物細胞 殺死。gfp 報導基因則克服了 gus 報導基因的缺點:可在活體細胞中測 定啟動子的活性；但缺點是無法精確的進行定量分析（檢測啟動子的 表現量）。luc 報導基因則兼具前述兩者的優點，並無兩者的缺點： 即一方面可在活體細胞中測定啟動子的活性（經由 luciferase 活性的 「報導」），另一方面又可非常精密的檢測啟動子的表現量。更重要的 是：luciferase（luc 報導基因的產物）的反應是一個非常專一的反應 （圖二），在不含 luc 基因的植物體中不會有類似的反應曲線。因此， 即使某種植物本身含有會發出波長 560nm 的化合物，測定 luciferase 時也不會受到誤導。圖一： PR-1a 啟動子的組織特異性。只在植物「節」（白色箭頭）及主根（紅色 箭頭）的部分表現；報導基因為 gus 基因，因此啟動子有活性的組織呈現藍色， 但因執行檢測時必須除去葉綠素，因此其他組織均呈透明，受檢測的植物也死了。
圖二： luciferase 活性的檢測是非常靈敏且具有專一性。IC 植物不含 luc 基因，
活性數值為 39（紅色框）；IK 植物含 luc 基因，活性數值為 189497。每一樣品測
定時間為 2 秒，每 0.1 秒讀一次數據並由＊顯示當時活性，據此 IK 植物之活性 在 0.5 秒時達到最高其後遞減。螢火蟲的 luciferase-luciferin 反應均應顯示類似的
如何測定螢火蟲的冷光?
一、活體內測定（in vivo Assay）
上述 luciferase 的活性可在活體細胞中測定。將含有 luc 基因的植物以 含 0.4 mM 冷光素噴灑或以水耕（含 0.4 mM 冷光素）方式處理，約 10 分鐘後植物即可發光。最原始的活體測定是用感光底片來測定（既 然它會發光）。但是植物是立體的，底片是平面的，如何感光？訣竅 乃比照作標本的方法如圖三：將植物整理約成平面一樣（寬度約 0.5 公分），置於保濕的濾紙上，以保鮮膜包覆。比照一般壓片方式，在 黑暗中壓上感光底片並且置於紙作的壓片匣中（金屬壓片匣空間小容 易將植物夾死）。曝光一定時間後（5 分鐘至 2 小時，依啟動子強弱 而定），以一般方式沖洗底片。影像顯示植物之何種器官（或組織） 有 luciferase 的活性—亦即啟動子的活性（圖四）。用感光底片來測定 luciferase 的活性的缺點可由圖四中蕃茄之發光影像顯示出來：當整棵 植物發光強度相同時，愈接近底片的組織，所發的光愈容易被底片偵 測；愈遠離底片的組織，所發的光愈不易被底片偵測發光強度愈強。 因此，用感光底片來偵測冷光的方法，只能証明發光的組織具有活 性，不能証明未偵測到冷光的組織就不具有活性。一個改善的方法就 是使用攝影機並結合影像處理系統來偵測冷光，為了避免光害，測定 時必須在全暗的環境，測定結果如圖四所示。 圖三：用感光底片來偵測冷光。只有當沒有 cooled CCD 攝影機時才使用這個方 法。
圖四：含有 luc 基因的蕃茄用感光底片來偵測冷光。圖左:用黑白底片曝光; 圖右: 用彩色底片曝光，由於是負片，所以呈現紫色，顯示冷光應為互補色—黃綠色。
圖五：含有 luc 基因的兩種蕃茄轉殖株用 cooled CCD 攝影機偵測冷光。圖左: 正 常光照下之影像; 圖右: 黑暗下攝取之影像。結果顯示雖然兩種轉殖蕃茄均含有 luc 基因，但上面的轉殖蕃茄的啟動子才會在果實中表現。
二、活體外測定（in vitro Assay） 上述活體內測定方法的缺點是無法精確的顯示活性的強弱（定量分 析），如欲做定量分析則必須使用活體外測定方法。如前所述，冷光 酵素-冷光素（luciferase- luciferin）的反應是一個非常專一又非常靈 敏的反應。如果兩個啟動子的活性相差一萬倍，也可以使用 luc 報導 基因作定量分析。其測定大略分為三步：一、從植物組織中萃取蛋白； 二、將蛋白混入 LUC 檢定緩衝液（LUC assay buffer）；三、在黑暗 中加入冷光素溶液。加入冷光素行後，冷光強度將在第四分之一秒達 到最高，其後遞減。因此，如欲精確測定冷光活性，第三步驟時必須 由機器執行並即時測定。雖然已發展出新技術，可將前述活性遞減的 現象延遲，進而從容進行測試。但有時候欲判斷測定數據低的樣品究 竟是背景質（無活性）或活性低，可參考該樣品是否具有活性遞減軌 跡的數據：有遞減軌跡則為有活性，無遞減軌跡則為背景質，如圖二 顯示。 結語及展望 一、 luc 報導基因分子生物學研究的好工具：即一方面可在活體細胞 中測定活性（經由 luciferase 活性的「報導」），另一方面又可作 非常精密的定量分析。luciferase- luciferin 的反應是一個非常專 一的反應，在不含 luc 基因的植物體中不會有類似的反應曲線。 因此，測定時不會因背景質而誤導。 二、 使用攝影機並結合影像處理系統來偵測冷光（即活體內測定）， 目前大多用於植物組織或器官的冷光測定，很少用於單一或少 數細胞的冷光測定。未來發展重點在細胞級的冷光偵測，並且 針對樣品長時間追蹤偵測（例如每小時偵測一次並持續 24 小 時）。 參考文獻
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2. Charng, Y.C., Pfitzner, A.J.P., Pfitzner, U.M., Charng-Chang, K.F., Tu, J. & Kuo, T.T. (2000) Construction of an inducible transposon, INAc, to develop a gene tagging system in higher plants. Molecular Breeding 6, 353-367.
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