腐植酸造成血栓/血液凝固或動脈硬化及機制之探討
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2320-B-039-015- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 中國醫藥大學營養學系 計畫主持人： 楊新玲 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公開查詢中 華 民 國 92 年 10 月 31 日
一、HA 誘導 LDL 聚集作用的分析
(1) 改變 HA 濃度 先將分光光度計開機且將溫度控制在 37℃，石英管內加入 140 mM NaCl 之 PBS 及不同濃度的 HA 混合後加入 200µg/ml protein LDL（此時總體積為 1ml） ，蓋上蓋子及封 parafilm 測 OD680nm，每隔 5min 測一次 。 (2) 改變 PBS 之 NaCl 濃度 先將分光光度計開機且將溫度控制在 37℃，石英管內加入不同濃度的 NaCl 之 PBS 及不同濃度的 HA 混合後加入 200µg/ml protein LDL（此時總體積為 1ml），蓋上蓋子及封 parafilm 測 OD680nm，每隔 5min 測一次。 (3) 添加砷 先將分光光度計開機且將溫度控制在 37℃，石英管內加入 140 mM NaCl 之 PBS 及 20µg/ml HA 和不同濃度砷混和液後加入 200µg/ml protein LDL（此時 總體積為 1ml），蓋上蓋子及封 parafilm 測 OD680nm，每隔 5min 測一次 。二、負染法觀察 AgLDL 的分子大小
140 mM NaCl 之 PBS 分別加入 10、20µg/ml HA 及 200µg/ml protein LDL 混 合後，分別在 37℃反應 10min 及 40min ，反應結束後取 7.5 µl sample 滴在 formvar 的銅網上，5 min 後，用濾紙將過多的 sample 吸走，再加入 10 µl 的染劑（10﹪phosphotungstic acid），分別在 30 及 60 秒時用濾紙將染劑吸乾，放入乾燥
一、HA 誘導 LDL 聚集作用的分析
HA 會誘導 LDL 聚集作用 (aggregation) ，利用波長 680nm 偵測 AgLDL 的程 度，其吸光值越高則表示 aggregation 程度越嚴重。由圖 1 及 2 可以知道隨著 HA 的濃度增加 LDL aggregation 的程度也逐漸增加，在反應大約 30 分鐘時已達 到飽和，其最高值可達到 1.4 (20 ug/ml HA)。改變 PBS 之 NaCl 濃度，對 LDL
aggregation 程度的影響，NaCl 在水溶液中會解離為 Na+ 、Cl -，Na+ 會和 HA 之 COO-結合，由圖 3 及 4 可以知道隨著 NaCl 濃度增加其吸光值逐漸下降。添加 As5+ 也 是有同樣的結果，由圖 5 及 6 可知隨著 As5+ 的濃度增加其吸光值逐漸下降，其下 降的最低值與未經 HA 處理的 LDL 相似。
二、負染法觀察聚集 LDL (AgLDL) 的分子大小
利用負染法觀察 AgLDL 的分子大小，選擇其中 200 個 LDL 分子測量他的直 徑。n-LDL 平均直徑大約為 22.4nm，經 HA 處理的 LDL 直徑隨著反應時間的增加 而增加，反應 10 分鐘及 40 分鐘的 AgLDL 分子平均直徑分別為 22.66nm、 25.27nm， 其中反應 40 分鐘的 AgLDL 分子最大為 100nm。由圖 7 可知隨著作用時間增加 LDL 分子直徑在 20~29nm 的數量逐漸減少，而大於 30 nm 的分子數量逐漸增加增加。Fig.1.The aggregation of LDL (200 ug/ml) induced by HA as a function of timemonitored by the turbidity measurement at 680 nm at 37℃.
Fig.2.Graph showing the dependence of turbidity change (△O.D. 680 nm) as a function of concentration of HA. The concentration of LDL was 200 ug/ml.
time (mine) T u rb id it y (O .D .68 0n m ) 0.0 0.4 0.8 1.2 5 ug/ml HA 7.5 ug/ml HA 10 ug/ml HA 12.5 ug/ml 15 ug/mlHA 17.5 ug/ml HA 20 ug/ml HA HA conc. (ug/ml) 0 5 10 15 20 ∆ A680nm 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6
NaCl conc. (mM) 0 100 200 300 400 500 ∆ A68 0nm 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6
Fig.3.The aggregation of LDL (200 ug/ml) induced by HA (20 ug/ml) as a function of time at different concentrations of NaCl monitored by the turbidity measurement at 680 nm at 37℃.
Fig.4.Graph showing the dependence of turbidity change (△O.D. 680 nm) as a function of concentration of NaCl . The concentration of LDL and HA was 200 ug/ml and 20 ug/ml.
time (min) 0 10 20 30 40 50 Tu rb id ity (O .D. 680nm ) 0.0 0.4 0.8 1.2 360 mM NaCl 400 mM NaCl 440 mM NaCl 500 mM NaCl
Fig.5.The aggregation of LDL (200 ug/ml) induced by HA (20 ug/ml) as a function of time at different concentrations of As5+ monitored by the turbidity measurement at 680 nm at 37℃.
Fig.6.Graph showing the dependence of turbidity change (△O.D. 680 nm) as
a function of concentration of As5+. The concentration of LDL and HA was
200 ug/ml and 20 ug/ml.
time (min) 0 10 20 30 40 50 Tur b id it y ( O .D .68 0nm ) 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0 mM As5+ 10 mM As5+ 20 mM As5+ 30 mM As5+ 60 mM As5+ 90 mM As5+ 100 mM As5+ 200 mM As5+ 300 mM As5+ A s5+ conc. (m M ) 0 50 10 0 150 200 250 300 350 400 450 ∆ A 6 80nm 0.0 0.4 0.8 1.2
L D L 1 0~ 1 9 2 0~ 29 30~ 39 40~ 49 50~ 59 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 nu m b er s i z e ( n m ) (B) L D L + 2 0 u g / m l H A 1 0 m i n s i z e ( n m ) 10~1 9 20~2 9 30~3 9 40~4 9 50~5 9 60~6 9 un m b er 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 (C) L D L + 2 0 u g / m l H A 4 0 m i n s i z e ( n m ) 1 0~1 9 2 0~2 9 3 0~ 3 9 4 0~ 4 9 5 0~5 9 6 0~ 6 9 7 0~ 7 9 8 0~ 8 9 9 0~ 9 9 1 00 ¡ ô nu m b e r 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0
Fig.7. Electron microscopic analysis of HA treated LDL particles. LDL (200ug
protein/ml) was incubated at 37℃ for 10 min and 40 min with 20ug/ml HA. The LDL particles were examined by electron microscopy after negative staining, and size distributions of the negatively stained particles were determined.(A) native LDL; (B) HA treat LDL incubator 10min; (c) HA treat LDL incubator40min.
